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一种消除小花万代兰组织培养过程中内生菌的方法.pdf

花匠小妙招
2024-11-26 06:04

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710903686.9 (22)申请日 2017.09.29 (71)申请人南京仙草堂生物科技有限公司地址 210000 江苏省南京市高淳经济开发区古檀大道3号 (72)发明人史月龙曾宋君吴英亮刘文斌吴坤林汤静 (74)专利代理机构苏州翔远专利代理事务所 (普通合伙) 32251 代理人王华 (51)Int.Cl. A01H 4/00(2006.01) (54)发明名称一种消除小花万代兰组织培养过程中内生菌的方法 (57)摘要一种消除小花万代兰组。

2、织培养过程中内生菌的方法，包括选取当年萌发生长的小花万代兰顶芽为外植体，冲洗后用酒精浸泡，然后用升汞溶液消毒，再用无菌水冲洗，接下来切取带节的顶芽，然后将所述带节的顶芽接种到顶芽促长培养基上进行培养，于无菌条件下，将顶芽的基部茎段切除，保留高度为12厘米的顶芽，然后插植到新的顶芽促长培养基；再转接至增殖培养基，培养获得高度为34厘米的不定芽，将不定芽插植至不定根诱导和壮苗培养基，培养获得生根苗；炼苗后种植在基质上。本发明利用利福平处理结合茎顶培养方式彻底消除小花万代兰组组织培养过程中外植体材料存在的内生菌而获得无菌、生活力强的顶芽来进行。

3、其优良种苗的大量繁殖的方法。权利要求书2页说明书7页 CN 107494269 A 2017.12.22 CN 107494269 A 1.一种消除小花万代兰组织培养过程中内生菌的方法，其特征在于：包括下列步骤：第一步：选取当年新萌发生长的小花万代兰顶芽为外植体，冲洗后用酒精浸泡，然后用升汞溶液消毒，再用无菌水冲洗，接下来切取高度为12厘米的带节的顶芽，然后将所述带节的顶芽接种到顶芽促长培养基上进行培养，所述顶芽促长培养基的表面滴加无菌的利福平溶液35ml；培养条件为：培养温度为2327，光照度为15002000 l ，光照时长为11 13小时/天；每。

4、升所述顶芽促长培养基含有12g的花宝1号、 12g的花宝2号， 24g的硫酸亚铁， 24g的乙二胺四乙酸二钠、 0.52g的蛋白胨、 50100mL的椰子汁、 80120mg的肌醇、 1.52.5mg的甘氨酸、 0.050.2mg的盐酸硫胺素、 0.40.8mg的盐酸吡哆醇、 0.40.8mg的烟酸、 0.10.5mg的6-苄基腺嘌呤、 0.10.5mg的萘乙酸、 1530g的蔗糖、 67g的琼脂；所述顶芽促长培养基的pH 值为5.4-5.6；第二步：于无菌条件下，将第一步培养获得的顶芽的基部茎段切除，保留高度为12厘米的顶芽，然后插植到新的顶芽促长培养基，接着于顶芽促。

5、长培养基的表面滴加无菌的利福平溶液35ml，然后放置在培养室内培养，培养条件为：培养温度为2327，光照度为 15002000 l ，光照时长为1113小时/天；获得无菌的生活力强的顶芽；第三步：将第二步培养获得的顶芽转接至增殖培养基，培养获得高度为34厘米的不定芽；每升所述增殖培养基含12g的花宝1号、 12g的花宝2号、 24g的硫酸亚铁、 24g的乙二胺四乙酸二钠、 0.52g的蛋白胨、 100150mL的椰子汁、 80120mg的肌醇、 1.52.5mg 的甘氨酸、 0.050.2mg的盐酸硫胺素、 0.40.8mg的盐酸吡哆醇、 0.40.8mg的烟酸、 3。

6、.0 5.0mg的6-苄基腺嘌呤、 0.10.5mg的萘乙酸、 1530g的蔗糖、 67g的琼脂；所述增殖培养基的pH 值为5.4-5.6；培养条件为：培养温度为2428，光照度为15002000 l ，光照时长为1113小时/天；第四步：将所述不定芽插植至不定根诱导和壮苗培养基，培养获得高度为57厘米，根数为35条的生根苗；每升所述不定根诱导和壮苗培养基含12g的花宝1号、 0.52g的蛋白胨、 4080g的土豆泥、 80120mg的肌醇、 1.52.5mg的甘氨酸、 0.050.2mg的盐酸硫胺素、 0.40.8mg的盐酸吡哆醇、 0.40.8mg的烟酸、 0.。

7、20.5mg的萘乙酸、 1530g的蔗糖、 67g的琼脂；所述不定根诱导和壮苗培养基的pH值为 5.4-5.6；培养条件为：培养温度为2630，光照度为20003000 l ，光照时长为1113小时/天；第五步：将所述生根苗炼苗，然后洗净附着在生根苗上的培养基后，用高锰酸钾溶液浸泡后种植在基质上。 2.根据权利要求1所述的消除小花万代兰组织培养过程中内生菌的方法，其特征在于：所述顶芽促长培养基的配制方法包括：向去离子水中添加花宝1号、花宝2号、硫酸亚铁、乙二胺四乙酸二钠、蛋白胨、椰子汁、肌醇、甘氨酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、烟酸、蔗糖和琼脂。

8、，混合均匀后调整pH值至5.4-5.6，然后添加6-苄基腺嘌呤和萘乙酸，将培养基分装到玻璃培养瓶中，每培养瓶分装25-30 ml的培养基，于压力为1.06 kg/cm2，温度为121条件下灭菌20 min，得到顶芽促长培养基。 3.根据权利要求1所述的消除小花万代兰组织培养过程中内生菌的方法，其特征在于：所述无菌的利福平溶液的制备方法包括：将医用利福平粉剂分散于甲醇中配制得到浓度为 2550mg/L的溶液，然后于无菌条件下，将溶液过滤至一已灭菌的滴瓶中，然后用无菌牛皮纸将滴瓶密封即得无菌的利福平溶液。权利要求书 1/2 页 2 CN 107494269。

9、 A 2 4.根据权利要求1所述的消除小花万代兰组织培养过程中内生菌的方法，其特征在于：第二步重复两次以上。 5.根据权利要求1所述的消除小花万代兰组织培养过程中内生菌的方法，其特征在于：第三步重复两次以上。 6.根据权利要求1所述的消除小花万代兰组织培养过程中内生菌的方法，其特征在于：所述基质为水苔。 7.根据权利要求1所述的消除小花万代兰组织培养过程中内生菌的方法，其特征在于：所述利福平溶液的浓度为2550mg/L。 8.根据权利要求1所述的消除小花万代兰组织培养过程中内生菌的方法，其特征在于：所述高锰酸钾溶液的浓度为0.10.3%。权利要求书 2/2 页 3。

10、 CN 107494269 A 3 一种消除小花万代兰组织培养过程中内生菌的方法技术领域 0001 本发明属于植物保护生物学和生物技术领域，特别涉及一种彻底消除小花万代兰组织培养过程中内生菌的方法。背景技术 0002 小花万代兰（Vanda coerulescens Griff. ）是兰科万代兰属植物，分布于印度东北部、缅甸、泰国，以及中国云南的西镇康、澜沧、墨江、思茅、景洪、勐海、勐腊、元江、元阳等县；生于海拔700-1600米，附生于疏林中树干上。为附生兰，茎粗壮，长8-30厘米，叶多枚，二列，先端有不规则缺刻；总状花序1-2个，。

11、长达36厘米，具多花，花色白色带淡蓝色，花期3-5 月，国家二级保护植物，具有重要的育种、观赏、科研、保护等价值。但由于人们过度的采伐以及其生长环境发生变化，野外的小花万代兰种源稀缺，因而需要对其进行人工繁殖，一方面除了满足市场以及育种、科研的需求外，另一方面可将人工繁殖的种苗回归原产地放养，令其能自然繁殖，扩大其种群数量，极好地保护该物种的多样性。但在进行小花万代兰的组织培养过程中因其固有的内生菌问题给其外植体消毒带来很大的难度，甚至因为无法获得无内生菌的繁殖材料而导致无法进行其组培苗生产，从而导致因生产成本高而造成停产的问题。 0003 。

12、本发明将具有广谱的杀菌能力的利福平添加至小花万代兰促长培养基上发挥其高效的杀菌、抑菌作用，避免高浓度的利福平对离体培养材料小花万代兰的毒副作用，同时通过培养基中的各种成分配搭可以促进离体培养的小花万代兰顶芽能快速伸长生长，再结合继代培养切掉顶芽的基部，保留新生长的顶芽部分，继代4次后可以彻底消除培养材料的内生菌，获得无菌的、生活力强的顶芽用于其种苗的大量繁殖。该技术可以成功解决小花万代兰等单轴类兰花组培苗生产过程中内生菌消除的瓶颈问题，为有效完成其组培苗快速繁殖过程奠定基础。技术独特且简单实惠，应用价值高，只需要简单的组织培养设备就可以完成。发明内容。

13、0004 本发明的目的在于提供一种消除小花万代兰组织培养过程中内生菌的方法。 0005 为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种消除小花万代兰组织培养过程中内生菌的方法，包括下列步骤：第一步：选取当年新萌发生长的小花万代兰顶芽为外植体，冲洗后用酒精浸泡，然后用升汞溶液消毒，再用无菌水冲洗，接下来切取高度为12厘米的带节的顶芽，然后将所述带节的顶芽接种到顶芽促长培养基上进行培养，所述顶芽促长培养基的表面滴加无菌的利福平溶液35ml；培养条件为：培养温度为2327，光照度为15002000 l ，光照时长为11 13小时/天；每升所述顶芽促。

14、长培养基含有12g的花宝1号、 12g的花宝2号， 24g的硫酸亚铁， 24g的乙二胺四乙酸二钠、 0.52g的蛋白胨、 50100mL的椰子汁、 80120mg的肌醇、 1.52.5mg的甘氨酸、 0.050.2mg的盐酸硫胺素、 0.40.8mg的盐酸吡哆醇、 0.40.8mg的说明书 1/7 页 4 CN 107494269 A 4 烟酸、 0.10.5mg的6-苄基腺嘌呤、 0.10.5mg的萘乙酸、 1530g的蔗糖、 67g的琼脂；所述顶芽促长培养基的pH 值为5.4-5.6；第二步：于无菌条件下，将第一步培养获得的顶芽的基部茎段切除，保留高度为12厘米的顶。

15、芽，然后插植到新的顶芽促长培养基，接着于顶芽促长培养基的表面滴加无菌的利福平溶液35ml，然后放置在培养室内培养，培养条件为：培养温度为2327，光照度为 15002000 l ，光照时长为1113小时/天；获得无菌的生活力强的顶芽；第三步：将第二步培养获得的顶芽转接至增殖培养基，培养获得高度为34厘米的不定芽；每升所述增殖培养基含12g的花宝1号、 12g的花宝2号、 24g的硫酸亚铁、 24g的乙二胺四乙酸二钠、 0.52g的蛋白胨、 100150mL的椰子汁、 80120mg的肌醇、 1.52.5mg 的甘氨酸、 0.050.2mg的盐酸硫胺素、 0.40.。

16、8mg的盐酸吡哆醇、 0.40.8mg的烟酸、 3.0 5.0mg的6-苄基腺嘌呤、 0.10.5mg的萘乙酸、 1530g的蔗糖、 67g的琼脂；所述增殖培养基的pH 值为5.4-5.6；培养条件为：培养温度为2428，光照度为15002000 l ，光照时长为1113小时/天；第四步：将所述不定芽插植至不定根诱导和壮苗培养基，培养获得高度为57厘米，根数为35条的生根苗；每升所述不定根诱导和壮苗培养基含12g的花宝1号、 0.52g的蛋白胨、 4080g的土豆泥、 80120mg的肌醇、 1.52.5mg的甘氨酸、 0.050.2mg的盐酸硫胺素、 0.40.8。

17、mg的盐酸吡哆醇、 0.40.8mg的烟酸、 0.20.5mg的萘乙酸、 1530g的蔗糖、 67g的琼脂；所述不定根诱导和壮苗培养基的pH值为 5.4-5.6；培养条件为：培养温度为2630，光照度为20003000 l ，光照时长为1113小时/天；第五步：将所述生根苗炼苗，然后洗净附着在生根苗上的培养基后，用高锰酸钾溶液浸泡后种植在基质上。 0006 优选的技术方案为：所述顶芽促长培养基的配制方法包括：向去离子水中添加花宝1号、花宝2号、硫酸亚铁、乙二胺四乙酸二钠、蛋白胨、椰子汁、肌醇、甘氨酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、烟酸、蔗糖和琼脂，。

18、混合均匀后调整pH值至5.4-5.6，然后添加6-苄基腺嘌呤和 0.10.5萘乙酸，将培养基分装到玻璃培养瓶中，每培养瓶分装25-30 ml的培养基，于压力为1.06 kg/cm2，温度为121条件下灭菌20 min，得到顶芽促长培养基优选的技术方案为：所述无菌的利福平溶液的制备方法包括：将医用利福平粉剂分散于甲醇中配制得到浓度为2550mg/L的溶液，然后于无菌条件下，将溶液过滤至一已灭菌的滴瓶中，然后用无菌牛皮纸将滴瓶密封即得无菌的利福平溶液。 0007 优选的技术方案为：第二步重复两次以上。 0008 优选的技术方案为：第三步重复两次以上。 0009 优。

19、选的技术方案为：所述基质为水苔。 0010 优选的技术方案为：所述利福平溶液的浓度为2550mg/L。 0011 优选的技术方案为：所述高锰酸钾溶液的浓度为0.10.3%。 0012 由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：本发明将具有广谱的杀菌能力的利福平添加至小花万代兰促长培养基上发挥其高效的杀菌、抑菌作用，避免高浓度的利福平对离体培养材料小花万代兰的毒副作用，同时通过培养基中的各种成分配搭可以促进离体培养的小花万代兰顶芽能快速伸长生长，再结合继代培养切掉顶芽的基部，保留新生长的顶芽部分，继代4次后可以彻底消除培养材料的内生说明书 2/7 。

20、页 5 CN 107494269 A 5 菌，获得无菌的、生活力强的顶芽用于其种苗的大量繁殖。该技术可以成功解决小花万代兰等单轴类兰花组培苗生产过程中内生菌消除的瓶颈问题，为有效完成其组培苗快速繁殖过程奠定基础。技术独特且简单实惠，应用价值高，只需要简单的组织培养设备就可以完成。具体实施方式 0013 以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本实施例所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。 0014 实施例1：一种消除小花万代兰组织培养过程中内生菌的方法 1 材料：种植于中国科学院华南植物园兰花种质资源圃小花万代兰。 0015 2 无菌。

21、的利福平溶液的配制购买医用的利福平粉剂。选用带吸管的250ml滴瓶，晾干后用报纸将其包装好后于1.06 kg/cm2、 121条件下灭菌20 min，另用500ml的甲醇将医用的利福平粉剂配制成25mg/L浓度的溶液装进兰花瓶。将以上的药品、器具、一次性细菌过滤器放置于超净工作台上，无菌条件下将利福平溶液过滤至无菌的滴瓶中，配制成25mg/L浓度的无菌的利福平溶液，用无菌牛皮纸将滴瓶的于瓶颈部密封后放置4冰箱条件下保存待用。 0016 3 培养基配制根据培养材料组培苗生产的要求，配制其顶芽促长培养基V1：每升含花宝1号1g，花宝2 号1g，硫酸亚铁（FeS。

22、O4.7H2O） 2g ，乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na） 2，蛋白胨 0.5g，椰子汁 50mL，肌醇80mg，甘氨酸1.5mg，盐酸硫胺素（VB1） 0.05mg，盐酸吡哆醇（VB6） 0.4mg，烟酸 0.4mg， 6-苄基腺嘌呤（6-BA） 0.1毫克，萘乙酸（NAA） 0.1mg，蔗糖 15g，琼脂6g， pH 5.4；配制培养基按以下程序添加药品或母液：糖-无离子水-铁盐母液-大量元素母液-微量元素母液-维生素母液-甘氨酸母液-肌醇母液-植物生长调节剂母液-琼脂，调整pH至5.4，添加植物生长调节剂包括0.1mg/L 6-苄基腺嘌呤。

23、（6-BA）和0.1mg/L萘乙酸（NAA），将培养基分装玻璃培养瓶（300ml）中，每瓶分装25 ml培养基，于1.06 kg/cm2、 121条件下灭菌20 min，冷却凝固待用。 0017 4. 外植体选择及其表面消毒、接种、培养春夏季节于小花万代兰种质资源圃中选取生长健壮、抗逆性、抗病虫害强的健康株系，选取其当年新萌发生长的顶芽为外植体，在自来水下冲洗干净后剪去叶片、气生根，在体积分数为70%的酒精中浸泡30秒，再用质量分数为0.1%的升汞溶液消毒5分钟，无菌水冲洗4 次，切取高1厘米带节的顶芽，接种到顶芽促长培养基V1：每升含花宝。

24、1号1g，花宝2号1g，硫酸亚铁（FeSO4.7H2O） 2g ，乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na） 2g，蛋白胨 0.5g，椰子汁 50mL，肌醇80mg，甘氨酸1.5mg，盐酸硫胺素（VB1） 0.05mg，盐酸吡哆醇（VB6） 0.4mg，烟酸0.4mg， 6-苄基腺嘌呤0.1毫克，萘乙酸（NAA） 0.1mg，蔗糖 15g，琼脂6g， pH 5.4；接着于培养基表面滴加 25mg/L浓度的无菌的利福平溶液3ml，盖上瓶盖后将材料放置培养室中培养，培养温度为23 ，光照度1500 l ，光照11 / 。 0018 5 切顶、继代培养。

25、三次顶芽在顶芽促长培养基V1培养45天后能伸长生长1厘米，同时顶芽基部有细菌的生长；于超净工作台上无菌条件下将顶芽的基部茎段切除，保留高1厘米的顶芽插植到新的顶芽促长培养基V1上，接着于顶芽促长培养基V1表面滴加25mg/L浓度的无菌的利福平溶液3ml，说明书 3/7 页 6 CN 107494269 A 6 盖上瓶盖后将材料放置培养室中培养，培养温度为23，光照度1500 l ，光照11 / 。 0019 培养周期45天，接着同样的操作，继代培养2次后即可获得彻底消除内生菌的无菌的生活力强的顶芽用于不定芽的大量增殖培养。 0020 6. 不定芽增殖培养将获得的。

26、无菌的生活力强的顶芽转接至增殖培养基为V2：每升含花宝1号1g，花宝2号 1g，硫酸亚铁（FeSO4.7H2O） 2g ，乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na） 2g，蛋白胨 0.5g，椰子汁 100mL，肌醇80mg，甘氨酸1.5mg，盐酸硫胺素（VB1） 0.05mg，盐酸吡哆醇（VB6） 0.4mg，烟酸 0.4mg， 6-苄基腺嘌呤3.0毫克，萘乙酸（NAA） 0.1mg，蔗糖 15g，琼脂6g， pH 5.4；不定芽增殖培养条件为培养温度为24，光照度1500l ，光照11 / 。 0021 7. 不定根诱导及壮苗培养经过4代的不定芽增殖。

27、培养，把高3厘米的不定芽插植至不定根诱导和壮苗培养基V3：每升含花宝1号1g，蛋白胨 0.5g，土豆泥 40g，肌醇80mg，甘氨酸1.5mg，盐酸硫胺素（VB1） 0.05mg，盐酸吡哆醇（VB6） 0.4mg，烟酸0.4mg，萘乙酸（NAA） 0.2mg，蔗糖 15g，琼脂6g， pH 5.4，培养60天时，苗高可达到5厘米，根数3条，生根率为95%以上。生根壮苗阶段的培养温度为26，光照度2000 l ，光照11 / 。 0022 8. 移栽将生根培养60天左右的试管苗在强光照下炼苗7天后出瓶。移栽时，从培养瓶中取出生根苗，洗净附着。

28、的培养基后，用千分之一的高锰酸钾溶液浸泡5 min，种植基质采用水苔，注意保持适宜湿度和温度，置于阴凉通风处栽培，成活率可达95%以上。 0023 实施例2：一种消除小花万代兰组织培养过程中内生菌的方法 1 材料：种植于南京仙草堂生物科技有限公司兰花种质资源圃中小花万代兰。 0024 2 无菌利福平溶液配制购买医用的利福平粉剂。选用带吸管的250ml滴瓶以，晾干后用报纸将其包装好后，于 1.06 kg/cm2、 121条件下灭菌20 min，另用500ml的甲醇将利福平配制成50mg/L浓度的溶液装进兰花瓶。将以上的药品、器具、一次性细菌过滤器放置于超净工作台。

29、上，无菌条件下将利福平溶液过滤至无菌的滴瓶中，配制成、 50mg/L浓度的无菌的利福平溶液，用无菌牛皮纸将滴瓶的于瓶颈部密封后放置4冰箱条件下保存待用。 0025 3 培养基配制根据培养材料组培苗生产的要求，配制其顶芽促长培养基V1：每升含花宝1号2g，花宝2 号2g，硫酸亚铁（FeSO4.7H2O） 4g ，乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na） 4g，蛋白胨 2g，椰子汁 100mL，肌醇120mg，甘氨酸2.5mg，盐酸硫胺素（VB1） 0.2mg，盐酸吡哆醇（VB6） 0.8mg，烟酸 0.8mg， 6-苄基腺嘌呤0.5毫克，萘乙酸（NAA。

30、） 0.5mg，蔗糖30g，琼脂7g， pH 5.6；配制培养基按以下程序添加药品或母液：糖-无离子水-铁盐母液-大量元素母液-微量元素母液-维生素母液-甘氨酸母液-肌醇母液-植物生长调节剂母液-琼脂，调整pH至5.6，添加植物生长调节剂包括0.5 mg/L 6-苄基腺嘌呤（6-BA）和0.5 mg/L萘乙酸（NAA），将培养基分装玻璃培养瓶（300ml）中，每瓶分装30 ml培养基，于1.06 kg/cm2、 121条件下灭菌20 min，冷却凝固待用。 0026 4. 外植体选择及其表面消毒、接种、培养秋冬季节于小花万代兰种质资源圃中选取生长健。

31、壮、抗逆性、抗病虫害强的健康株系，说明书 4/7 页 7 CN 107494269 A 7 选取其当年新萌发生长的顶芽为外植体，在自来水下冲洗干净后剪去叶片、气生根，在体积分数为70%的酒精中浸泡30秒，再用质量分数为0.1%的升汞溶液消毒10分钟，无菌水冲洗5 次，切取高2厘米带节的顶芽，接种到顶芽促长培养基V1：每升含花宝1号2g，花宝2号2g，硫酸亚铁（FeSO4.7H2O） 4g ，乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na） 4g，蛋白胨2g，椰子汁 100mL，肌醇 120mg，甘氨酸2.5mg，盐酸硫胺素（VB1） 0.2mg，盐酸吡。

32、哆醇（VB6） 0.8mg，烟酸0.8mg， 6-苄基腺嘌呤0.5毫克，萘乙酸（NAA） 0.5mg，蔗糖30g，琼脂7g， pH5.6；接着于培养基表面滴加50mg/ L浓度的无菌的利福平溶液5ml，盖上瓶盖后将材料放置培养室中培养，培养温度为27，光照度2000 l ，光照13h/d。 0027 5 切顶、继代培养三次顶芽在顶芽促长培养基V1培养45天后能伸长生长2厘米，同时顶芽基部有细菌的生长；于超净工作台上无菌条件下将顶芽的基部茎段切除，保留高1.5厘米的顶芽插植到新的顶芽促长培养基V1上，接着于顶芽促长培养基V1表面滴加50mg/L浓度的无菌的。

33、利福平溶液 5ml，盖上瓶盖后将材料放置培养室中培养，培养温度为27，光照度2000 l ，光照12 / 。 0028 培养周期45天，接着同样的操作，继代培养2次后即可获得彻底消除内生菌的无菌的生活力强的顶芽用于不定芽的大量增殖培养。 0029 6. 不定芽增殖培养将获得的无菌的生活力强的顶芽转接至增殖培养基为V2：每升含花宝1号2g，花宝2号 2g，硫酸亚铁（FeSO4.7H2O） 4g ，乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na） 4g，蛋白胨2g，椰子汁150mL，肌醇120mg，甘氨酸2.5mg，盐酸硫胺素（VB1） 0.2mg，盐酸吡哆醇（VB。

34、6） 0.8mg，烟酸0.8mg， 6- 苄基腺嘌呤5.0毫克，萘乙酸（NAA） 0.5mg，蔗糖30g，琼脂7g， pH 5.6；不定芽增殖培养条件为培养温度为28，光照度15002000 l ，光照12 / 。 0030 7. 不定根诱导及壮苗培养经过4代的不定芽增殖培养，把高4厘米的不定芽插植至不定根诱导和壮苗培养基V3：每升含花宝1号2g，蛋白胨2g，土豆泥80 g，肌醇120mg，甘氨酸2.5mg，盐酸硫胺素（VB1） 0.2mg，盐酸吡哆醇（VB6） 0.8mg，烟酸0.8mg，萘乙酸（NAA） 0.5mg，蔗糖30g，琼脂7g，。

35、pH 5.6，培养60天时，苗高可达到7厘米，根数5条，生根率为95%以上。生根壮苗阶段的培养温度为30 ，光照度3000 l ，光照12 / 。 0031 8. 移栽将生根培养60天左右的试管苗在强光照下炼苗7天后出瓶。移栽时，从培养瓶中取出生根苗，洗净附着的培养基后，用千分之二的高锰酸钾溶液浸泡5 min，种植基质采用水苔，注意保持适宜湿度和温度，置于阴凉通风处栽培，成活率可达95%以上。 0032 实施例3：一种消除小花万代兰组织培养过程中内生菌的方法一种消除小花万代兰组织培养过程中内生菌的方法，包括下列步骤：第一步：选取当年新萌发生长的小花。

36、万代兰顶芽为外植体，冲洗后用酒精浸泡，然后用升汞溶液消毒，再用无菌水冲洗，接下来切取高度为1.5厘米的带节的顶芽，然后将所述带节的顶芽接种到顶芽促长培养基上进行培养，所述顶芽促长培养基的表面滴加无菌的利福平溶液4ml；培养条件为：培养温度为25，光照度为1800 l ，光照时长为12小时/天；每升所述顶芽促长培养基含有1.5g的花宝1号、 1.5g的花宝2号， 3g的硫酸亚铁， 3g的乙二胺四乙酸二钠、 1.25g的蛋白胨、 75mL的椰子汁、 100mg的肌醇、 2mg的甘氨酸、 0.125mg的盐酸硫胺说明书 5/7 页 8 CN 107494269 。

37、A 8 素、 0.6mg的盐酸吡哆醇、 0.6mg的烟酸、 0.3mg的6-苄基腺嘌呤、 0.3mg的萘乙酸、 22.5g的蔗糖、 6.5g的琼脂；所述顶芽促长培养基的pH 值为5.5；第二步：于无菌条件下，将第一步培养获得的顶芽的基部茎段切除，保留高度为1.5厘米的顶芽，然后插植到新的顶芽促长培养基，接着于顶芽促长培养基的表面滴加无菌的利福平溶液5ml，然后放置在培养室内培养，培养条件为：培养温度为25，光照度为1800 l ，光照时长为12小时/天；获得无菌的生活力强的顶芽；第三步：将第二步培养获得的顶芽转接至增殖培养基，培养获得高度为4厘米的不定芽。

38、；每升所述增殖培养基含1.5g的花宝1号、 1.5g的花宝2号、 3g的硫酸亚铁、 3g的乙二胺四乙酸二钠、 1.25g的蛋白胨、 125mL的椰子汁、 100mg的肌醇、 2mg的甘氨酸、 0.125mg的盐酸硫胺素、 0.6mg的盐酸吡哆醇、 0.6mg的烟酸、 4mg的6-苄基腺嘌呤、 0.3mg的萘乙酸、 22.5g的蔗糖、 6.5g的琼脂；所述增殖培养基的pH 值为5.5；培养条件为：培养温度为26，光照度为 1700 l ，光照时长为12小时/天；第四步：将所述不定芽插植至不定根诱导和壮苗培养基，培养获得高度为6厘米，根数为4条的生根苗；每升所述不定根。

39、诱导和壮苗培养基含1.5g的花宝1号、 1.25g的蛋白胨、 60g 的土豆泥、 100mg的肌醇、 2mg的甘氨酸、 0.123mg的盐酸硫胺素、 0.6mg的盐酸吡哆醇、 0.6mg 的烟酸、 0.35mg的萘乙酸、 22.5g的蔗糖、 6.5g的琼脂；所述不定根诱导和壮苗培养基的pH值为 5.5；培养条件为：培养温度为28，光照度为2500l ，光照时长为12小时/天；第五步：将所述生根苗炼苗，然后洗净附着在生根苗上的培养基后，用高锰酸钾溶液浸泡后种植在基质上。 0033 实施例4：一种消除小花万代兰组织培养过程中内生菌的方法一种消除小花万代兰组织培养过程中内生。

40、菌的方法，包括下列步骤：第一步：选取当年新萌发生长的小花万代兰顶芽为外植体，冲洗后用酒精浸泡，然后用升汞溶液消毒，再用无菌水冲洗，接下来切取高度为12厘米的带节的顶芽，然后将所述带节的顶芽接种到顶芽促长培养基上进行培养，所述顶芽促长培养基的表面滴加无菌的利福平溶液3.5ml；培养条件为：培养温度为2327，光照度为15002000 l ，光照时长为11 13小时/天；每升所述顶芽促长培养基含有1.2g的花宝1号、 1.7g的花宝2号， 2.9g的硫酸亚铁， 3.5g的乙二胺四乙酸二钠、 1.7g的蛋白胨、 57mL的椰子汁、 107mg的肌醇、 2mg的甘氨。

41、酸、 0.1mg的盐酸硫胺素、 0.6mg的盐酸吡哆醇、 0.6mg的烟酸、 0.4mg的6-苄基腺嘌呤、 0.4mg的萘乙酸、 28g的蔗糖、 7g的琼脂；所述顶芽促长培养基的pH 值为5.6；第二步：于无菌条件下，将第一步培养获得的顶芽的基部茎段切除，保留高度为12厘米的顶芽，然后插植到新的顶芽促长培养基，接着于顶芽促长培养基的表面滴加无菌的利福平溶液4ml，然后放置在培养室内培养，培养条件为：培养温度为2327，光照度为1500 2000 l ，光照时长为1113小时/天；获得无菌的生活力强的顶芽；第三步：将第二步培养获得的顶芽转接至增殖培养基，培养。

42、获得高度为34厘米的不定芽；每升所述增殖培养基含1.5g的花宝1号、 2g的花宝2号、 4g的硫酸亚铁、 2g的乙二胺四乙酸二钠、 0.9g的蛋白胨、 120mL的椰子汁、 80mg的肌醇、 1.6mg的甘氨酸、 0.12mg的盐酸硫胺素、 0.4mg的盐酸吡哆醇、 0.8mg的烟酸、 3. 5mg的6-苄基腺嘌呤、 0.2mg的萘乙酸、 19g的蔗糖、 6.3g的琼脂；所述增殖培养基的pH 值为5.4-5.6；培养条件为：培养温度为2428，光照度为15002000 l ，光照时长为1113小时/天；说明书 6/7 页 9 CN 107494269 A 9 第四步。

43、：将所述不定芽插植至不定根诱导和壮苗培养基，培养获得高度为57厘米，根数为35条的生根苗；每升所述不定根诱导和壮苗培养基含1.2g的花宝1号、 2g的蛋白胨、 40g的土豆泥、 120mg的肌醇、 2mg的甘氨酸、 0.2mg的盐酸硫胺素、 0.4mg的盐酸吡哆醇、 0.8mg 的烟酸、 0.3mg的萘乙酸、 25g的蔗糖、 6g的琼脂；所述不定根诱导和壮苗培养基的pH值为 5.4；培养条件为：培养温度为2630，光照度为20003000 l ，光照时长为1113小时/ 天；第五步：将所述生根苗炼苗，然后洗净附着在生根苗上的培养基后，用高锰酸钾溶液浸泡后种植在基质。

44、上。 0034 优选的技术方案为：所述顶芽促长培养基的配制方法包括：向去离子水中添加花宝1号、花宝2号、硫酸亚铁、乙二胺四乙酸二钠、蛋白胨、椰子汁、肌醇、甘氨酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、烟酸、蔗糖和琼脂，混合均匀后调整pH值至5.6，然后添加6-苄基腺嘌呤和萘乙酸，将培养基分装到玻璃培养瓶中，每培养瓶分装30 ml的培养基，于压力为1.06 kg/cm2，温度为121条件下灭菌20 min，得到顶芽促长培养基优选的技术方案为：所述无菌的利福平溶液的制备方法包括：将医用利福平粉剂分散于甲醇中配制得到浓度为50mg/L的溶液，然后于无菌条件下，。

45、将溶液过滤至一已灭菌的滴瓶中，然后用无菌牛皮纸将滴瓶密封即得无菌的利福平溶液。 0035 优选的技术方案为：第二步重复两次以上。 0036 优选的技术方案为：第三步重复两次以上。 0037 优选的技术方案为：所述基质为水苔。 0038 优选的技术方案为：所述利福平溶液的浓度为50mg/L。 0039 优选的技术方案为：所述高锰酸钾溶液的浓度为0.1%。 0040 以上所述者仅为用以解释本发明之较佳实施例，并非企图具以对本发明做任何形式上之限制，是以，凡有在相同之发明精神下所作有关本发明之任何修饰或变更，皆仍应包括在本发明意图保护之范畴。说明书 7/7 页 10 CN 107494269 A 10 。