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真菌检验图文全总结，专家来划重点！ | CTS2021

花匠小妙招
2024-11-26 10:02

*仅供医学专业人士阅读参考

读懂真菌检验报告不再难！

部分真菌可侵入人体，在组织器官、血液中生长繁殖并导致炎症反应、组织损伤的感染性疾病。目前，临床常见的真菌感染如念珠菌、曲霉菌等。诊断真菌感染的实验室技术包括涂片、培养、（1,3）-β-D葡聚糖（G试验）等，随着医疗生物技术的进步，新的诊断技术逐渐进入临床。

2021年12月11日，中华医学会呼吸病学年会在福建厦门召开。会上，来自广州医科大学附属第一医院的叶枫教授为我们带来“真菌实验室检测进展”的专题报告，一起来看看吧。

传统的真菌实验室检测技术

传统的真菌实验室诊断技术：涂片、培养、G试验、抗原抗体、病理。

▌真菌直接镜检形态特征

念珠菌：常单个出芽，有假菌丝者末端缩窄附于菌上，似“香肠”样连接，菌丝多有分隔；

黄曲霉：有隔夜丝，可见“双义型的45度分枝”，菌丝较大；

黑曲霉：分生孢子梗长，小分生孢子表面粗糙；

新型隐球菌：大小变异甚大，球形或橄榄球性，在墨汁黑背景下呈清晰的晕圈；晕圈内可见菌体细胞。

▌真菌的菌落特征

念珠菌：临床常见的念珠菌有5个类别，见图1。

图1 来源：叶枫教授“真菌实验室检测进展”报告截图

念珠菌属显色鉴别培养：

白色念珠菌的菌落为翠绿色，热带念珠菌为蓝灰或铁蓝；

光滑念珠菌为紫色，克柔念珠菌为淡粉；其他类别念珠菌为白色。

曲霉菌：

图2 来源：叶枫教授“真菌实验室检测进展”报告截图

显微镜下的曲霉（图2）“美丽而妖娆”，却给人体的健康带来极大的危险。其中，烟曲霉导致的感染性疾病较为常见。

隐球菌：

图3 来源：叶枫教授“真菌实验室检测进展”报告截图

隐球菌可以在葡萄蛋白胨琼脂、沙氏、咖啡酸培养基上生长。

马尔尼菲篮状菌：

对温度敏感的二相丛菌，菌落呈柔毛丛状，在培养基中分泌葡萄酒样红色色素。在骨髓、淋巴结培养的阳性率最高（均为100%）、其次皮肤（90%）、血液（76%）。

▌组织切片及病理

图4 来源：叶枫教授“真菌实验室检测进展”报告截图

如图4所示，在组织病理切片上分辨曲霉与毛霉具有一定难度。叶枫教授指出：“曲霉比较细、形似锐角的分枝有较多的分隔；而毛霉则比较粗短、呈直角或者是钝角的一个分枝。”

▌真菌的荧光染色镜检

即通过显微镜及光学显色方法（如钙荧光或开普蓝染色剂）对标本进行直接鉴定和快速染色；无菌体液培养阳性和深部组织病理鉴定仍是侵袭性感染诊断的金标准。

▌真菌G（BDG，(1,3）-β-D葡聚糖）试验[1]

（1,3）-β-D葡聚糖是真菌的细胞壁成分，当吞噬细胞吞噬真菌后可使（1,3）-β-D葡聚糖被大量释放于血液中而被检测发现。

表1

注：ICU：重症监护病房；SOT：实体器官移植；SoR：推荐强度；QoE：证据质量；HSCT，造血干细胞移植；IFD：侵袭性真菌病；HIV：人免疫缺陷病毒；IA：侵袭性曲霉病；PPV：阳性预测值；NPV：阴性预测值；GM：半乳甘露聚糖

叶枫教授强调：“G试验的敏感度约50%至70%，动态观察G试验数值变化更具有临床意义。”

▌GM试验[1]

GM试验是临床诊断真菌感染的常用方法，多用于鉴定曲霉所致的感染。

表2

注：HRCT：高分辨率计算机断层扫描；ODI：光密度指数

▌检测隐球菌抗原的不同方法

表3

▌真菌的聚合酶链反应（PCR）检测[2]

PCR是指利用一段DNA为模板，在DNA聚合酶和核苷酸底物共同参与下，将该段DNA扩增至足够数量，以便进行结构和功能分析。如图5所示，从全血中提取曲霉的DNA比从血清中提取的技术要求更高。叶枫教授指出：“全血PCR与血清PCR的敏感性分别为85.1%、78.7%，全血PCR敏感性更高；但血清样本中提取DNA较全血更快、更容易。”

注：ELISA:酶联免疫吸附试验；WB：全血；Serum：血清

图5

▌组织活检标本的分子生物学诊断[1]

表4

▌联合检测提高诊断的敏感率

叶枫教授说道：“任何一个检测方法都不是完美的，联合多种检测方法可排除更多的假阳性、提高诊断的敏感率。”

表5

新的真菌实验室诊断技术

▌T2 Candida[3]

诊断效能：除G试验和PCR技术之外，T2磁共振（T2 magnetic resonance，T2MR）也可检测念珠菌，即T2 Candida；T2 Candida是诊断念珠菌血症的最佳诊断工具。

局限性：T2 Candida这种基于磁共振的分子自动检测方法可在5h内检测出最常见的5种念珠菌，如白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌和克柔念珠菌。T2 Candida未能检测出所有念珠菌，在深部念珠菌感染和儿童念珠菌血症的诊断仍缺乏大规模的随机对照研究。

▌基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱法（MALDI-TOF MS）[4]

图6 MALDI-TOF质谱技术描述来源：叶枫教授“真菌实验室检测进展”报告截图

MALDI-TOF MS是一种简单、快速、高通量、低成本和高效的微生物鉴定技术，适用于纯培养菌株、报阳的血培养瓶检测。可快速（通常在20min内）检测，鉴定报阳的培养瓶的敏感性及特异性高，接近100%。

不足：该方法主要用于细菌、酵母菌、分枝杆菌的鉴定，需要建立标准数据库体系进行对比分析。

▌二代测序（NGS）在感染性疾病诊治中的应用[5]

图7 实验室的诊断程序包括NGS的一般工作流程概述

▌VOCs（挥发性有机物）对肺曲霉病的诊断[6]

对疑似真菌性肺炎患者，其呼出气体中的曲霉次生代谢物特征可用于识别IA。

图8 呼吸曲霉代谢差异参考标准及试验参数

曲霉次级代谢物特征的任何一种元素的检测可将IA、IFD或其他肺炎患者进行区分，敏感性为94%（95%CI,81%-98%）、特异性为93%（95%CI,79%-98%）。

▌多种检测方法在曲霉病诊断中的比较[7]

表6

注：BAL：支气管肺泡灌洗液；BG：β-葡聚糖

真菌的耐药性检测

烟曲霉对三唑类药物耐药的问题日益严重，其起源于环境的耐药机制以TR34/L98H为主，TR34/L98H在多个国家被报道[8]。探讨TR34/L98H的耐药机制，主要包括：①耐药的TR34/L98H孢子发生了地理（空气）迁移；②在不相关菌株中存在TR34/L98H转移；③两者兼有。

荷兰发现了一种新的TR46/Y121F/T289A，可导致伏立康唑高度耐药、并导致伏立康唑治疗失败。

总结：

课后，叶枫教授总结如下：

1.真菌常规的实验室检测方法包括涂片镜检（荧光染色）、培养、病理、G试验、抗原、抗体；

2.关注真菌检测的新技术：PCR、T2 Candida、MALDI-TOF、二代测序、呼出气特征性VOCs；

3.临床多采用联合检测，提高诊断的敏感性、特异性；

4.关注真菌的药敏试验和耐药性。

参考文献：

[1]Ullmann AJ,Aguado JM,Arikan-Akdagli S,et al.Diagnosis and management of Aspergillus diseases:executive summary of the 2017 ESCMID-ECMM-ERS guideline.Clin Microbiol Infect.2018 May;24 Suppl 1:e1-e38.doi:10.1016/j.cmi.2018.01.002.Epub 2018 Mar 12.

[2]Springer J,Morton CO,Perry M,et al.Multicenter comparison of serum and whole-blood specimens for detection of Aspergillus DNA in high-risk hematological patients.J Clin Microbiol.2013 May;51(5):1445-50.

[3]Zacharioudakis IM,Zervou FN,Mylonakis E.Use of T2MR in invasive candidiasis with and without candidemia.Future Microbiol.2018 Aug;13:1165-1173.

[4]Croxatto A,Prod'hom G,Greub G.Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology.FEMS Microbiol Rev.2012 Mar;36(2):380-407.doi:10.1111/j.1574-6976.2011.00298.x.Epub 2011 Aug 22.

[5]Deurenberg RH,Bathoorn E,Chlebowicz MA,Couto N,Ferdous M,García-Cobos S,Kooistra-Smid AM,Raangs EC,Rosema S,Veloo AC,Zhou K,Friedrich AW,Rossen JW.Application of next generation sequencing in clinical microbiology and infection prevention.J Biotechnol.2017 Feb 10;243:16-24.

[6]Koo S,Thomas HR,Daniels SD,Lynch RC,Fortier SM,Shea MM,Rearden P,Comolli JC,Baden LR,Marty FM.A breath fungal secondary metabolite signature to diagnose invasive aspergillosis.Clin Infect Dis.2014 Dec 15;59(12):1733-40.

[7]Arvanitis M,Mylonakis E.Diagnosis of invasive aspergillosis:recent developments and ongoing challenges.Eur J Clin Invest.2015 Jun;45(6):646-52.doi:10.1111/eci.12448.Epub 2015 Apr 24.

[8]Vermeulen E,Lagrou K,Verweij PE.Azole resistance in Aspergillus fumigatus:a growing public health concern.Curr Opin Infect Dis.2013 Dec;26(6):493-500.

本文首发：医学界呼吸频道

本文整理：CTS记录组

汇报专家：叶枫

责任编辑：戴戴章丽

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