2n花粉在蔷薇多倍体杂交中的强竞争作用

BMC植物生物学gydF4y2Ba体积gydF4y2Ba19gydF4y2Ba、物品编号:gydF4y2Ba127gydF4y2Ba（gydF4y2Ba2019gydF4y2Ba）gydF4y2Ba引用本文gydF4y2Ba

2487gydF4y2Ba访问gydF4y2Ba

6gydF4y2Ba引用gydF4y2Ba

3.gydF4y2BaAltmetricgydF4y2Ba

指标gydF4y2Ba细节gydF4y2Ba

摘要gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

2n花粉在水稻多倍体杂交育种中具有很强的竞争作用gydF4y2Ba罗莎矮牵牛gydF4y2Ba．分析了‘橙火’ב老红脸’的倍性遗传特性。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

细胞学观察结果表明，花粉母细胞PMC在减数分裂中期失败的细胞质分裂或核分裂产生了2n花粉。“老红脸”(2x)的2n花粉自然产生率约占所有雄性配子的1.39%，而F1后代的四倍体自然产生率高达44.00%。对“橙火”和“DEE”花粉在柱头上萌发和雌蕊生长的时空特征进行了观察，结果表明，2n花粉在柱头上的发芽率并不优于1n花粉，但在穿越柱头进入花柱的过程中，2n花粉的发芽率分别增加到30.90%和37.20%。2n花粉管的胼胝质塞明显薄于1n花粉管。我们实验中涉及的每一个性状都可能对F1的形态表型非常重要。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

我们认为2n花粉参与了杂交，在穿越柱头进入花柱时具有竞争优势。2n花粉管中的胼胝质塞可能对花粉管的竞争过程有很大的影响gydF4y2Bar .矮牵牛gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

多倍体化是一种重要的物种形成机制，广泛存在于植物中。基因组复制在物种进化过程中已经发生[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]。多倍体可以通过多种途径获得，例如通过亲本杂交在其后代中产生快速有效的未减数配子。可育多倍体的形成不仅促进了遗传和多样性，而且有利于多倍体育种。多倍体与物种形成的相关性本身仍然是一个有争议的话题。在许多情况下，不清楚区分因果关系。例如，未还原配子通常在寒冷环境中产生[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

2n个配子能够将亲本杂合性性状以很大比例传递给后代。由于这种杂合性，这些配子也可能具有某些特殊的适应性，与适应性有很大程度的正相关[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]。针叶树科的针叶树在灭绝的潜在危机中幸存下来，因为它们产生了大量的花粉，并在晚三叠纪时期对多倍体的产生做出了很大的贡献[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]。实际上，多倍体很可能具有很强的适应能力，正如在高海拔的恶劣环境中观察到的那样[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

未还原配子为植物细胞遗传学和育种研究提供了基础，促进了多倍体基因型的发展[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]。在多倍体育种过程中，为了获得多倍体植株，2n配子在有丝分裂时先进行染色体加倍。2n配子将具有高级性状的基因从野生物种转移到栽培品种中，将亲本杂合性传递给后代，并提高三倍体的近交和花粉育性[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]。多倍体育种可能带来显著的经济和社会效益。具有2n个配子的两性多倍体gydF4y2Ba紫花苜蓿gydF4y2Ba结果是生物量增加，开花早，种子数量和重量大，叶片大，细胞大[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]。在郁金香的杂交后代中发现了具有生长旺盛和花大等重要园艺性状的三倍体。gydF4y2Ba郁金香gydF4y2Ba)源自杂交2x × 2x植物杂交[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]，而在3x × 2x杂交后代中发现四倍体和五倍体[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]。利用2n个配子，将一些重要的经济性状，包括对非生物和生物胁迫的抗性，以及与质量相关的性状，如高比重和慢还原糖，从野生品种逐渐渗入到栽培马铃薯中[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]。微卫星基因分型表明，单性生殖体细胞变异的大多数可活种子是由未还原配子受精形成的[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

大多数具有商业价值的现代玫瑰品种是四倍体，源自欧洲四倍体和亚洲二倍体之间长期存在的种间杂交[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]。很明显，种间杂交在该属的进化中起了关键作用gydF4y2Ba罗莎gydF4y2Ba但在三倍体中存在高水平的不育甚至流产gydF4y2Ba罗莎gydF4y2Ba植物和种间杂交[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]。只有8至11种野生品种对现代具有商业价值的玫瑰育种和选择有贡献[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba也就是说，只有一小部分基因库资源可以用于基因改良。种间杂交是丰富遗传多样性和产生新的种质资源的重要策略[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]。种间杂交在提高性状的数量和质量方面具有巨大的潜力，如增加花的大小、改善风味品质、改变颜色、增强生物和非生物抗逆性以及其他特性[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]。然而，目前尚不清楚倍性的水平是如何影响动物的有性生殖的gydF4y2Ba罗莎gydF4y2Ba植物。据推测，较高的倍性可能导致生殖系统中更大的种内多样性[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

以2个二倍体月季品种和6个二倍体月季品种为母系与6倍体月季品种杂交。他们的后代包括具有五种倍性的植物，包括二倍体、三倍体、四倍体、五倍体和六倍体[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]。在减数分裂阶段的细胞学观察中，gydF4y2Ba罗莎gydF4y2Ba二倍体和四倍体品种通常表现出完全匹配的染色体。gydF4y2Ba

四倍体、六倍体和五倍体的花粉可以获得一半的成对染色体分离，卵在减数分裂后获得一半的成对染色体分离和不配对的一价gydF4y2Ba罗莎gydF4y2Ba家庭(gydF4y2Ba21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]。一些杂交后代，如gydF4y2Ba狗牙蔷薇gydF4y2Ba和gydF4y2Ba罗莎inodoragydF4y2Ba以及它们自然产生的相互杂交，gydF4y2Ba罗莎dumalisgydF4y2Ba(5倍)gydF4y2Ba罗莎agrestis)gydF4y2Ba(5x, 6x)以不对称减数分裂为特征，使双亲遗传的染色体能够重组，但在母系遗传的染色体中却无法重组[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]。无融合可能导致后代的倍性水平高于其父母，这只是在切片中显示为相当罕见的现象gydF4y2BaCaninaegydF4y2Ba［gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]，但不发生在其他玫瑰，包括gydF4y2Bar .矮牵牛。gydF4y2Ba在gydF4y2Bar·阿尔巴gydF4y2Ba杂种，产生2n花粉，观察到异常倍性[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]。得到五倍体和六倍体后代gydF4y2Bar . caninagydF4y2Ba作为母本的品种与作为父本的现代四倍体玫瑰品种杂交，由于父本花粉未减少而产生六倍体后代[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]。在玫瑰杂交实验中，后代有较高的倍性水平，这可能是由亲本产生的2n花粉或自花授粉引起的[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba罗莎矮牵牛gydF4y2Ba‘HW336’是种间二倍体杂交品种，由二倍体玫瑰、gydF4y2Bar .矮牵牛gydF4y2Ba“H190”。二倍体种gydF4y2Bar . wichuranagydF4y2Ba在不同的高温处理下产生2n个花粉，比例为1.10~24.50%，扫描电镜观察到，在蚁巢数量和外质沉积方面表现出特定的形态变化，导致纹状结构较少[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]。高温使二倍体玫瑰HW154的2n花粉数量增加，二倍体父本与四倍体母本杂交产生的95个后代中有40个四倍体杂交种，其二倍体、三倍体或多倍体的概率在0 ~ 6.20%之间。gydF4y2Ba29gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

通过对花粉母细胞减数分裂的观察gydF4y2Bar .矮牵牛gydF4y2Ba，gydF4y2Ba毛茛属植物laetusgydF4y2Ba，gydF4y2Ba龙舌兰tequilana,gydF4y2Ba等，通过检测杂交后代的倍性和杂合性来证实2n花粉的存在[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32gydF4y2Ba]。的亲本遗传杂合度gydF4y2Bar . wichuraianagydF4y2Ba，gydF4y2Bar·玫瑰gydF4y2Ba利用AFLP(扩增片段长度多态性)对2株二倍体玫瑰及其杂交后代进行检测，以证实2n花粉存在FDR(一分裂恢复)和SDR(二分裂恢复)两种类型。FDR产生的2n个配子将80%至100%的亲本杂合性传给后代。相比之下，约40%的亲本杂合性预计由SDR 2n配子传递[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]。研究者一般将1.3~1.5倍1n花粉直径作为鉴定花粉是否为2n二倍体染色体花粉的临界值[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32gydF4y2Ba]。在PMC减数分裂过程中，从四倍体玫瑰的二单倍体(Anna’、Leonidas’、Sweet Promise’)衍生的55株二单倍体植株中观察到2n株直径大于60 μm的花粉，平行纺锤体发育为FDR二分体，垂直纺锤体发育为FDR三分体[j]。gydF4y2Ba33gydF4y2Ba]。在细胞水平上，已有一些关于月月花2n花粉形成的报道，但仅通过检测杂交后代的倍性来评估2n花粉的强大竞争优势。因此，月季如何产生2n花粉尚不清楚。此外，还缺乏真正杂交的鉴定，以及花粉在雌蕊中竞争的细胞和分子机制。这种生产是否参与了正常的受精或无融合过程，也不确定2n雄性配子体及其2n花粉的特性在多倍体杂交育种中是否具有足够的强度[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba]。本研究以四倍体玫瑰为母本，二倍体玫瑰为父本的四种杂交组合进行了研究。通过对二倍体父本2n花粉的产生、F1后代的杂交鉴定、倍性遗传特征和‘橙火’ב老红脸’杂交组合形态性状的观察和鉴定。采用根尖压缩法，利用流式细胞术、SSR (simple sequence repeat)和SRAP (sequence-related amplification polymorphism)分子标记鉴定技术，观察了授粉后雌蕊(Orange Fire和DEE)花粉(Old Blush)的时空生长特征。本研究结果阐明了玫瑰2n花粉的产生过程及其竞争优势，为杂交育种提供依据。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

4个杂交组合中2n花粉具有较强的竞争力gydF4y2Ba

用流式细胞术和茎尖染色体压缩法对4个杂交组合的亲本和F1后代的倍性进行分析，倍性鉴定准确率为100%(表1)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。“橙火”F1杂交后代三倍体和四倍体的比例(2n = 4x = 28, 1C = 0.79 pg)，图。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa、b和c)ד老脸红”(2 n = 2 x = 14日1 c = 0.71 pg,无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2Bad, f, e)为14:11，其中F1-2(图1)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bag, h和i)为三倍体(2n = 3x = 21, 1C = 0.72 pg)和F1-9(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Baj、k、l)为四倍体(2n = 4x = 28, 1C = 0.70 pg)。在“春潮”(2n = 4x = 28, 1C = 0.79 pg)与“斯雷特深红中国”(2n = 2x = 14, 1C = 0.71 pg)的F1中，这一比值为3:1;在‘DEE’(2n = 4x = 28,1c = 0.73 pg)与‘Slater’’Crimson China’的F1杂交后代中为5:1;而在“DEE”דOld Blush”的F1杂交后代中，这一比例为21:11。“橙火”ד老红脸”F1杂交种茎尖的体细胞染色体和染色体倍性部分显示在附加文件中gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S1流式细胞术检测的‘Orange Fire’בOld Blush’F1杂交体的倍性图见附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S2，流式细胞术检测的‘Chun Chao’בSlater’’Crimson China’F1杂种倍性图见附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba图S3，流式细胞术检测的' DEE ' × ' Slater ' s Crimson China ' F1杂交体的倍性图见附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S4，流式细胞术检测的' DEE ' × ' Old Blush ' F1杂种的倍性图见附加文件1:图S5。流式细胞术检测的‘Orange Fire’בOld Blush’亲本和F1杂交体的DNA量见附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba表S1，‘Chun Chao’בSlater’s Crimson China’亲本和F1杂交种流式细胞术检测的DNA量见附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba表S2，‘DEE’בSlater’s Crimson China’F1杂交体流式细胞术检测的DNA量见补充文件2;表S3，‘DEE’בOld Blush’流式细胞术检测的DNA量见补充文件2:表S4。gydF4y2Ba

全尺寸工作台gydF4y2Ba

“橙火”ד老红脸”倍性特征的遗传分析。gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba“橙色火焰”。gydF4y2BabgydF4y2Ba橘火的体细胞染色体。gydF4y2BacgydF4y2Ba流式细胞术检测的‘Orange Fire’染色体倍性图，荧光强度为560,660。gydF4y2BadgydF4y2Ba“老脸红”的花。gydF4y2BaegydF4y2Ba“老脸红”的体细胞染色体。gydF4y2BafgydF4y2Ba流式细胞术检测“Old Blush”染色体倍体图，荧光强度为252,300。gydF4y2BaggydF4y2Ba2号F1花(2n = 3x = 21)来自' Orange Fire ' × ' Old Blush '。gydF4y2BahgydF4y2Ba来自‘Orange Fire’בOld Blush’的2号F1 (2n = 3x = 21)体细胞染色体。gydF4y2Ba我gydF4y2Ba用流式细胞术检测‘Orange Fire’בOld Blush’2号F1的染色体倍体图，荧光强度为381577。gydF4y2BajgydF4y2Ba9号F1花(2n = 4x = 28)出自' Orange Fire ' × ' Old Blush '。gydF4y2BakgydF4y2Ba来自‘Orange Fire’בOld Blush’的9号F1 (2n = 4x = 28)体细胞染色体。gydF4y2BalgydF4y2Ba用流式细胞术检测‘Orange Fire’בOld Blush’9号F1的染色体倍体图，荧光强度为497,566gydF4y2Ba

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“老红脸”2n花粉自然产生率和活力gydF4y2Ba

天然1n和2n花粉直径均服从正态分布。2n花粉的直径为44.20±2.33 μm，比1n花粉的直径约大30%以上(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Baa, g)。' Old Blush '的自然2n花粉产生率约为1.39%(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Baa, g)。亚历山大染色法测定2n花粉的存活率约为25%(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Baa)。然而，四倍体在F1杂交种中的比例为44.00%(表2)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)，远高于自然的2n花粉产生速率。这可能是由于2n花粉在受精和发育过程中具有一定的竞争优势。结果表明，在4个杂交组合中，2n花粉是较强的竞争者。此外，花粉管宽度与花粉粒直径呈显著正相关(Pearson相关系数r = 0.97)， 2n花粉管宽度是1n花粉宽度的1.3倍以上(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2BaB, g)，可用于确定雌蕊中2n花粉管。gydF4y2Ba

' Old Blush '天然1n和2n花粉的形态特征和萌发。gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba“Old Blush”天然花粉1n和2n的活性，用亚历山大染料染色，其中蓝色染料表示花粉无活性，红色表示有活性。gydF4y2BabgydF4y2Ba' Old Blush '花粉的离体萌发。氟。扫描电镜下‘老红脸’花粉粒的形态特征。gydF4y2BacgydF4y2Ba赤道的观点。gydF4y2BadgydF4y2Ba极地的观点。gydF4y2BaegydF4y2Ba外膜装饰。gydF4y2BafgydF4y2Ba2n和1n花粉。gydF4y2BaggydF4y2Ba测定阈值为1n和2n的花粉粒直径和花粉管宽度。R(直径和宽度)= 0.97。bar A,B = 30 μmgydF4y2Ba

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在扫描电镜下观察到“Old Blush”的花粉呈过长形，具有纵向和平行的外部雕刻，宽而平的脊，穿孔的脊沟深度(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba氟)。gydF4y2Ba

“老红脸”二倍体2n花粉的细胞学观察gydF4y2Ba

考虑到我们获得了' Orange Fire ' (4x) × ' Old Blush ' (2x)的F1四倍体后代，我们推测未还原的2n花粉是在' Old Blush '二倍体中产生的，并参与了受精。在减数分裂过程中发现了一些异常，而整个细胞分裂过程基本正常，细胞核和细胞质都有两次连续分裂。在前I期，核染色体复制完成，染色质逐渐收缩，同源染色体配对发生在合子期。兄弟染色单体片段在二倍体期交换。在中期I阶段，染色体在赤道板两侧排列，达到最短长度，并以二价形态明显可见。在后期I，同源染色体分离，在纺锤体纤维的牵引下向两极移动，而在末期I，染色体逐渐向两极靠近。染色体开始打破螺旋，回到染色质状态。在前期II，染色质逐渐集中，并螺旋形成具有兄弟染色单体的七条染色体。中期，染色体在赤道板上按顺序排列，正常条件下可观察到垂直纺锤体。在后期，每个染色体着丝粒分离，同时两个兄弟染色单体也分离，导致两条染色体在纺锤体纤维的引导下表现出偶极子运动。 In telophase II, the chromosomes reached their fixed positions under the guidance of the spindle fibers, while the chromosomes gradually broke the spiral, returning to the chromatin state with the reformation of the nucleolus. Most cells became tetrads after cytoplasmic division, including a plane-shaped tetrad, a tetrahedral tetrad, or a line-shaped tetrad (Fig.3.gydF4y2Ba一个)。gydF4y2Ba

自然花粉产生的不同途径。gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba正常PMC的减数分裂。经突触和同源染色体分离后，PMC发育为二联体，染色体消失，细胞核可见。减数分裂后，双体各细胞的染色体重新出现并形成染色体。“Old Blush”中的减数分裂是连续的类型，并且是异步的。gydF4y2BabgydF4y2Ba．两种FDR 2n花粉的生产过程。一个过程是具有融合纺锤体的PMC，在正常减数分裂II后发展成由两个细胞核融合的细胞组成的FDR二分体，另一个过程是垂直纺锤体发展成由三个纺锤体中的两个1n细胞和一个2n细胞组成的FDR三分体。gydF4y2BacgydF4y2Ba．SDR 2n花粉的两条生产途径。正常减数分裂I后形成二分体，细胞质分裂丧失，或形成由一个2n细胞、两个1n细胞和一个透明细胞组成的SDR四分体，形成一个双核细胞和两个1n细胞的SDR三分体gydF4y2Ba

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与正常减数分裂相比，“Old Blush”可以自然产生两种2n花粉:FDR和SDR。FDR 2n花粉有两种发育方式，一种是熔融纺锤体发育，另一种是垂直纺锤体发育;即前者由于减数分裂I期两个细胞核分离失败，在减数分裂II后形成两个融合核的FDR二联体，后者最终形成由两个1n细胞和一个2n细胞组成的FDR三联体，从减数分裂I后期纺锤体的第一次减数分裂发展到第三次纺锤体(图1)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab). SDR 2n花粉是由正常减数分裂i后发生的两种异常分裂发育而来。一种是SDR三联体，其中有一个2n融合核细胞和两个1n细胞，这是由于细胞分裂不足造成的。另一种是SDR四分体，具有一个2n细胞，两个1n细胞和一个由于缺乏核分裂而产生的空位细胞(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bac). FDR二分体(0.60%)产生2个2n花粉，FDR三分体(0.80%)、SDR三分体或四分体(合计1.60%)各产生2n花粉，最终产生0.51%的FDR 2n花粉和0.41%的SDR 2n花粉。gydF4y2Ba

通过SSR和SRAP鉴定，2n个配子参与F1四倍体的产生gydF4y2Ba

RW55C6引物在亲本中扩增，获得了特异性亲本条带，扩增产物重复性高，目标条带大小分别为200 bp和180 bp(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Baa, b).引物在后代中也可以表现为良好的多态性条带。如果后代具有父本和母本的特定带，则我们认为后代是杂合的。根据分离规律和独立配种规律，父本“老红脸”的180和200 bp条带分别独立或同时遗传给F1杂交种是正常的。使用该引物在‘Orange Fire’בOld Blush’中检测到的29个杂交品种构成了真正的杂交品种。gydF4y2Ba

‘橙火’ב老红脸’F1的SSR和SRAP分析结果。注:YYF， ' Old Blush ';JH，“Orange Fire”;a. F1(1-7)由“Orange Fire”דOld Blush”。b.F1(8-15)由“Orange Fire”דOld Blush”。c. F1(1-14)来自' Orange Fire ' × ' Old Blush '。d. F1(15-25)来自' Orange Fire ' × ' Old Blush '。a, b.黑色箭头表示雄性亲本的特定波段出现的位置。c, d.白色箭头表示亲本特定波段出现的位置gydF4y2Ba

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‘橙火’ב老红晕’杂交组合成熟率77.78%，种子发芽率较低，为35.71%，共25株。利用SSR和SRAP分子标记验证了F1植株是否为真杂交种。gydF4y2Ba

对于SRAP，最终选择的引物组合为:Me9: TGAGTCCAAACCGGGCT，帝国5:GACTGCGTACGAATTGTA，这是最适合扩增的引物组合。‘橙火’ב老红晕’F1植株的SRAP分子标记如图所示。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba图中的箭头指向只出现在雄性父母身上的带。我们选择这个条纹作为一个特定的条纹，它出现在每个F1植株上(图中没有箭头)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bac, d)。这意味着所有的F1植株都可能是父本和母本的真正杂交，排除了不完全阉割的近亲繁殖，并得出结论，2n配子可能来自F1四倍体的父本。gydF4y2Ba

‘老红脸’2n花粉萌发、生长及‘橙火’和‘DEE’雌蕊结实性状的研究gydF4y2Ba

授粉约4小时后，‘Old Blush’的花粉在‘Orange Fire’和‘DEE’的柱头表面萌发(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba一个,gydF4y2Ba6gydF4y2Baa).发芽率在4-6 h显著上升至24.00±7.20%，12 h后继续缓慢上升，稳定在‘橙火’的27.60±4.80%和‘DEE’的39.70±4.80%(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Bab). 1n和2n花粉的发芽率以及“Old Blush”和“DEE”母本的发芽率均无显著差异。这说明2n花粉的竞争优势在花粉萌发期并未出现。' Old Blush '花粉管开始进入柱头的内浅层，并在6小时后传递给' Orange Fire '的组织(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Bab,gydF4y2Ba6gydF4y2Baa)，并在24 h后成功进入样式(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Bac,gydF4y2Ba6gydF4y2Baa)花柱中花粉管的生长速度加快，72 h后最终进入子房(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Bad,gydF4y2Ba6gydF4y2Baa)。与2n花粉自然生成率(1.39%)相比，“橙火”和“DEE”母本的柱头上2n花粉的比例分别为4.50%和1.73%(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Bac). 8 h内浅层传递组织中2n花粉的比例分别显著增加10.00和12.24%，增加率分别增加122.20%和607.50%。20 h时柱头内深层传递组织中2n花粉的比例分别为25.45%和23.53%，‘橙火’的增幅持续增加至154.50%，而‘DEE’的增幅下降了92.20%。进入花柱后(24 h)， 2n花粉所占比例分别逐渐增加约30.90%和37.20%，增幅分别为21.40%和58.10%。子房中2n个花粉管的增加率仍然增加了约33.90%，这使我们推测“橙火”的四倍体F1后代为44.00%(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Bac).以上结果表明，‘橙火’中2n花粉比例增加最快的是柱头内深层传递组织(20 h)，其次是柱头内浅层传递组织(8 h)，最后是子房(48 h)。内部的深层企业因此表现出强大的竞争优势。相反，“DEE”的2n花粉增加速率最大的是表层传递组织(8 h)，其次是内部深层传递组织(20 h)，然后是花柱(24 h)。因此，内部表层表现出很强的竞争优势。gydF4y2Ba

桔梗雌蕊上1n和2n花粉的萌发。gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba' Old Blush '花粉在' Orange Fire '柱头表面发芽。gydF4y2BabgydF4y2Ba柱头和花柱交界处的传递组织中花粉管的花粉竞争强度最强。花粉管的一部分在顶端区域扭曲并停止生长，而正常的花粉管通过柱头生长到花柱中。gydF4y2BacgydF4y2Ba授粉后48 h花柱中的花粉管。d.花粉管在授粉后72小时进入子房。图:花粉管，cp:胼胝质塞。A bar =25 μm, B~D bar = 40 μmgydF4y2Ba

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' Old Blush '花粉管在' Orange Fire '和' DEE '雌蕊中的生长过程。gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba' Old Blush '花粉在雌蕊生长的时间和位置的进展。gydF4y2BabgydF4y2Ba花粉发芽率随授粉后时间的变化而变化。gydF4y2BacgydF4y2Ba授粉后每小时2n个花粉管的生长速率比例。gydF4y2BadgydF4y2Ba授粉后每小时花粉管长度的增长速度。gydF4y2BaegydF4y2Ba授粉后每小时花粉管生长速率。gydF4y2BafgydF4y2Ba花粉管进入子房后(72 h)雌蕊不同位置胼胝质栓的厚度。gydF4y2BaggydF4y2Ba花粉管进入子房后(72 h)雌蕊不同位置胼胝质塞密度gydF4y2Ba

全尺寸图像gydF4y2Ba

授粉8 ~ 24 h后，2n花粉管长度比1n花粉管长约300 μm，此时正处于传递组织进入花柱的阶段。在这一阶段，母本双方的生长速率表现出明显的竞争关系(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Bad).进入花柱前，在“橙火”和“DEE”中，2n花粉管在8 h时生长最快，分别为100.06 μm/h和131.42 μm/h，其中1n花粉管的花粉生长速度最慢，分别为17.69 μm/h和31.47 μm/h(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Bae).此时花粉管在传质组织内生长，观察到相应的形态特征。在柱头和花柱的连接区域观察到花粉管顶端区域的扭曲，以及胼胝质积累导致的花粉生长停止(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Bac).花柱进入花柱后，花粉管生长速率显著提高，达到100 ~ 400 μm/h, 72 h后到达子房(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Bad).授粉后8 ~ 24 h，柱头内通向花柱上部的2n花粉比例增加，表明双亲中2n花粉具有竞争优势。2n花粉管增加比例稳定，构成“一次性竞争型”(柱头内深层强竞争模式)。相反，“DEE”型柱头内2n花粉管的比例在受精前呈波动趋势，花柱内先增加后减少，表现为“二断竞争型”(柱头内表层强竞争模式)。gydF4y2Ba

为了研究体内不同倍性花粉管中胼胝质塞的分布特征，测量了花粉管进入子房后(72 h)雌蕊不同区域胼胝质塞的厚度和密度(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Baf, g)。雌蕊各部位2n花粉管的胼胝质塞比1n花粉管的胼胝质塞极显著变薄(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Baf).‘橙火’柱头处2n花粉管的胼胝质塞密度显著低于1n花粉管，而‘DEE’到达子房前2n花粉管的胼胝质塞密度低于1n花粉管。其他不同倍性的花粉管在花粉管进入子房后(72 h)雌蕊不同部位差异不显著。结合观察到的两母本不同倍性之间的花粉竞争，确定胼胝质塞的厚度和密度特征与强竞争的2n花粉密切相关。gydF4y2Ba

‘橙火’ב老红脸’F1植株表型性状的主成分及相关分析gydF4y2Ba

对‘橙火’ב老红晕’F1植株的表型性状进行了研究，结果见表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba．表型性状的主成分分析结果见表gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba和gydF4y2Ba4gydF4y2Ba．贡献方差的主成分相对分散，累积贡献增加缓慢，直到第5主成分累积贡献达到84.53%。在分析中，提取出特征根大于1的3个主成分，占变异总量的63.07%。第1组分的贡献率为29.39%，在顶叶长度、顶叶宽度和倍性上的负荷量均大于其他性状，其绝对值均大于等于0.70。第一主成分表明，小叶大小与F1植株的倍性有关。gydF4y2Ba

全尺寸工作台gydF4y2Ba

全尺寸工作台gydF4y2Ba

全尺寸工作台gydF4y2Ba

第二主成分解释了17.73%的变异，在花瓣、植株类型和小叶形状上的负荷较大，绝对值大于等于0.50。该成分主要反映了花、叶和植物在F1植物特定形态上的特征。第三组分的贡献为15.95%，在花色和花径上的负荷较大，主要反映了F1植株花的观赏特性。gydF4y2Ba

三个主成分性状不重叠，呈现高负荷得分，即没有任何一个性状对三个主成分施加更高的负荷。这表明我们不能确定任何特定的性状是这一代F1植株表型的主要特征。每一代所涉及的表型性状都在F1形态发生中发挥作用，需要进行全面的描述和评价。gydF4y2Ba

‘橙火’ב老红’F1植株的倍性与花径、顶小叶宽、小叶形状呈极显著正相关，而小叶长度和小叶形状呈极显著正相关(表1)gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。因此，倍性与花和叶的大小均呈正相关，即高倍性F1植株的花和叶较大，这与高倍性植物品种的特定器官比同一物种的低倍性植物的较大的理论是一致的，这是由于高倍性品种的染色体数量较多[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

全尺寸工作台gydF4y2Ba

除了前面提到的性状之间的相关性外，表gydF4y2Ba5gydF4y2Ba显示了其他的相关性，没有一个是统计上显著的。试验选择的每一个性状或特征都是完全独立的，不能被另一个性状所取代。将来我们可能会考虑提高后代的倍性，以选择性地培育出花更大的新品种。gydF4y2Ba

讨论gydF4y2Ba

产生2n花粉gydF4y2Bar .矮牵牛gydF4y2Ba

本研究揭示了月季2n花粉产生的细胞学机制。但未见相关分子机制和基因的报道，有待进一步研究。在我们的研究中，在正常的减数分裂细胞中，在“Old Blush”子细胞的中期II存在两个纺锤体，纺锤体彼此呈90°gydF4y2Bar .矮牵牛。gydF4y2Ba然而，在异常的，未分裂的细胞中，当两条染色体互补体移动到细胞的同一区域并在后期II形成二联体和三联体时，两条纺锤体彼此平行或类似于三极纺锤体装置。因此，我们认为2n花粉主要产生于玫瑰的两个异常分裂过程，即融合纺锤体和由垂直纺锤体发育而来的三纺锤体，以及细胞质分裂缺失或核分裂异常。在植物减数分裂过程中，会出现一些异常的减数分裂现象，如小孢子四分体阶段发生减数分裂，二元或三元配子的出现为2n配子的形成提供了最直接的证据[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba]。植物中存在两种2n配子:FDR和SDR。理论上，fdr型和sdr型配子分别携带来自亲本的80%和40%的杂合性。fdr型配子每对同源染色体有一条染色体，而sdr型配子每对同源染色体有两条兄弟染色单体，如百合[gydF4y2Ba37gydF4y2Ba]。在FDR型中，同源染色体要么没有配对和分离，要么配对的频率很低，染色体在减数分裂期间以单价形式出现[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba]。同源染色体的两个兄弟染色单体在第二次分裂时移动到相反的极点。fdr型配子除了交叉交换的片段外，保留了亲本的所有基因。在sdr型配子中，同源染色体配对和分离在第一次减数分裂中是正常的，尽管在第二次减数分裂中着丝粒分裂异常，导致染色单体不向两极移动。在这种情况下，只有一半的亲本染色体出现在SDR配子中，这些染色体有两个副本，例如在gydF4y2Ba秋海棠属植物gydF4y2Ba［gydF4y2Ba39gydF4y2Ba]。根据其遗传影响，fdr型2n配子的发生通常是突变和纺锤体异常的结果，而sdr型2n配子则是细胞质分裂异常的结果。fdr型配子的高杂合性决定了其能够有效地转移亲本杂合性和上位性，因此在育种中具有较高的利用价值。基于一系列集中于fdr类型的减数分裂观察的2n花粉的产生已在之前讨论过，包括平行纺锤体的二分体产物和垂直纺锤体的三分体产物的细胞过程[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34gydF4y2Ba]。两个百合品种的杂交后代(gydF4y2Bal . auratumgydF4y2Ba×gydF4y2Bal .苦丁gydF4y2Ba)产生2n个配子，并与另一个百合杂交种(东方杂交种)杂交，产生三倍体后代[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]。二倍体自花授粉的后代gydF4y2Ba柑橘tamuranagydF4y2Ba' Nishiuchi Konatsu '是四倍体，而其他后代的组合是二倍体[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba]。根据百合基因组后代通过原位杂交(GISH)产生的2n个配子的数量，研究表明fdr型占多数，IMR(不确定减数分裂恢复)型占少数[gydF4y2Ba37gydF4y2Ba]。通过诱导2n配子，充分利用其遗传多样性和杂种优势，可以获得植物自多倍体或异源多倍体gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba［gydF4y2Ba42gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

在小孢子发生过程中，异常的减数分裂行为与2n花粉的形成有关，如无合胞。gydF4y2Ba43gydF4y2Ba]，微管细胞骨架和细胞器类核的分布gydF4y2Ba杨树gydF4y2Ba［gydF4y2Ba44gydF4y2Ba]，以及MT(微管)s和MF(微丝)s在空间构型上的偏差gydF4y2Ba茄属植物gydF4y2Ba［gydF4y2Ba45gydF4y2Ba]。此外，植物中2n花粉的产生主要受基因控制。一个与减数分裂有关的等位基因gydF4y2Ba杰森gydF4y2Ba先前被克隆，并在2n配子发生过程中负责倍性调节gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba［gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]。的gydF4y2Ba团队gydF4y2Ba该基因负责启动减数分裂的第二次分裂，形成sdr型2n雄性和雌性配子[gydF4y2Ba46gydF4y2Ba]。的gydF4y2BaSWITCH1 /双gydF4y2Ba基因具有诱导2n配子产生的潜力gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba［gydF4y2Ba47gydF4y2Ba]。在一个微弱的gydF4y2Ba瑞士gydF4y2Ba基因突变体gydF4y2Ba二分体gydF4y2Ba的gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba，兄弟姐妹染色单体配对受到干扰，突触失效，产生非减数分裂雌配子。进一步的实验表明，这些没有减数分裂的雌性配子可以与正常的1n花粉杂交，产生三倍体后代[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba]。异常胼胝质积累导致缺陷细胞形成板，并在减数分裂末期产生2n个配子gydF4y2Bapmcd1gydF4y2Ba［gydF4y2Ba49gydF4y2Ba]。gydF4y2BaDcPS1gydF4y2Ba基因可能在康乃馨花粉形成中起作用(gydF4y2Ba石竹类植物caryophyllusgydF4y2Ba)作为对温度胁迫的响应，这可归因于雄性减数分裂II时纺锤体取向异常[gydF4y2Ba50gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

几种四倍体的gydF4y2BaBrachiariagydF4y2Ba可以自然产生FDR 2n花粉[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba]，而在有性繁殖的二倍体物种和无杂交的四倍体物种中均观察到非同步减数分裂[gydF4y2Ba51gydF4y2Ba]，如《老脸红》中所述。马铃薯作为减数分裂的连续类型，产生正常的二体，染色体桥和滞后染色体出现在后期I和II [gydF4y2Ba52gydF4y2Ba]。平行纺锤体导致玫瑰减数分裂异常[j]。gydF4y2Ba29gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34gydF4y2Ba]，而其他研究表明，平行纺锤体是正常四分体形成的一个常见过程，而融合纺锤体表明减数分裂异常[gydF4y2Ba53gydF4y2Ba]。在我们的研究中，融合纺锤体和三纺锤体是从垂直纺锤体发展而来的，因此我们认为2n花粉主要是由玫瑰的两种异常分裂方式产生的。gydF4y2Ba

2n花粉竞争优势gydF4y2Bar .矮牵牛gydF4y2Ba

许多四倍体和二倍体玫瑰的杂交组合产生的四倍体数量相对较高(> 25%)，并且认为2n花粉可能在授粉过程中具有选择优势[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba]。实验结果表明，2n配子的自然产率约为1.39%。在2n配子产生率如此低的情况下，每个杂交组合中仍会有一些四倍体后代，这表明2n花粉与正常的1n花粉相比具有相当大的竞争优势。目前尚不清楚2n花粉的表现是否比1n花粉更有活力，或者2n花粉管在柱头上的延伸速度是否比1n花粉管快。在此基础上，我们建议在未来的研究中进一步探讨这些问题。gydF4y2Ba

此外，应该注意的是，大量的卷心菜品种通常是二倍体。而秋水仙碱或2n花粉的自然性交配诱导产生四倍体。与普通二倍体相比，四倍体具有品质好、风味好、产量高的优点gydF4y2Ba芸苔属植物学报gydF4y2Ba这也表明2n个配子比1n个配子具有一定的竞争优势[gydF4y2Ba54gydF4y2Ba]。在大多数被子植物中，在双受精中，2n个配子对1n个配子处于不利地位，例如在gydF4y2BaPopulus tomentosagydF4y2Ba．然而，虽然2n花粉具有潜在的萌发能力，但与1n花粉相比，其萌发过程相对缓慢，在参与受精时相对于1n配子处于不利地位，这是三倍体育种率低的主要原因[gydF4y2Ba55gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

' Dien '和' Phuc Trach '的柱头上的1n和2n花粉(gydF4y2Ba植物gydF4y2Ba)授粉后均正常发芽;但与1n花粉相比，2n花粉发芽较晚，花粉管延伸较慢，在竞争受精能力上处于劣势[gydF4y2Ba56gydF4y2Ba]。在一些植物中，2n配子相对较强。例如，gydF4y2Ba茄属植物phurejagydF4y2Ba没有减数分裂的配子比正常减数分裂的配子有更大的生存能力[gydF4y2Ba57gydF4y2Ba]。在柱头上，2n花粉的花粉管比1n花粉的花粉管生长得快gydF4y2Ba茄属植物tuberosumgydF4y2Ba［gydF4y2Ba58gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

倍性与花粉大小的关系gydF4y2Ba

在我们的研究中，天然2n花粉的直径比1n花粉的直径大30%左右。众所周知，花粉的大小随着DNA的增加而增加[gydF4y2Ba59gydF4y2Ba]。花粉直径各不相同gydF4y2Ba蝴蝶兰属gydF4y2Ba多倍体呈正相关。正相关(r = 0.935);gydF4y2BaPgydF4y2BaZhu等发现倍性与花粉直径之间存在< 0.065的差异。[gydF4y2Ba60gydF4y2Ba]。四倍体物种的花粉粒(二倍体花粉)的平均大小是二倍体物种(单倍体花粉)的1.3倍[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33gydF4y2Ba]，提供了一种根据花粉大小估算2n花粉的直接方法。花粉大小可以影响授粉后在同一柱头上竞争的不同个体的相对传代成功率gydF4y2Ba番薯紫竹gydF4y2Ba［gydF4y2Ba61gydF4y2Ba]。较大的花粉比正常大小的花粉具有更大的竞争潜力。gydF4y2Ba

“老红脸”中2n花粉的萌发、生长及雌蕊的结实性状gydF4y2Ba

在萌发强度不明显增强的情况下，通过柱头内部传递组织的竞争优势，2n花粉管的比例、长度和生长速度逐渐超过1n花粉管，在受精过程中具有较强的竞争优势。因此，2n花粉的强竞争优势不是由花粉粒本身决定的，而是与雌蕊选择密切相关。2n花粉在穿越柱头内部传递组织时的关键时期对其竞争优势起作用。对于大多数途径，组织的解剖结构可以机械地限制花粉管的生长，并且需要雌蕊组织中的脂质、水和糖基化蛋白作为补充，包括提供信号引导[gydF4y2Ba62gydF4y2Ba]。柱头特异性蛋白1 (STIG1)与花粉受体激酶LePRK2结合，可以促进离体花粉管生长，并且在体内降低了柱头特异性蛋白1 (STIG1)的花粉管伸长率和种子产量。gydF4y2Ba茄属植物lycopersicumgydF4y2Ba) ［gydF4y2Ba63gydF4y2Ba]。谷氨酸受体样通道(GLRs)促进CagydF4y2Ba2 +gydF4y2Ba通过质膜内流调节花粉管顶端钙浓度梯度，是影响花粉管生长和形态发生的关键因素[j]。gydF4y2Ba64gydF4y2Ba]。双受精前，玉米的卵器分泌94-aa肽ZmEA1，以指导花粉管生长。当其下调时，花粉管失去引导，导致败育[gydF4y2Ba65gydF4y2Ba]。利用双光子激发(TPE)显微镜进一步证实了MYB98和ZmEA1对Ca的响应gydF4y2Ba2 +gydF4y2Ba和NO信号，在花粉管中起着重要的引导作用gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba［gydF4y2Ba66gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

被子植物花粉管中胼胝质塞的作用是定位顶端花粉管的细胞质和生殖单位，并将顶端区隔开，使生殖单位远离花粉管顶端的活动区[gydF4y2Ba67gydF4y2Ba，gydF4y2Ba68gydF4y2Ba]。在一些基因型的花粉管gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba，胼胝质塞随着花粉管生长期的增加而变厚[gydF4y2Ba69gydF4y2Ba]。由此我们可以推测，越薄的胼胝质塞可能导致花粉管活性越高，对生殖单位运动的阻碍越弱，而密度越低的胼胝质塞则导致花粉管生长速度越快。2n花粉管中胼胝质塞的厚度和密度普遍与1n花粉管存在显著差异，这与花粉竞争优势有关。花粉管细胞壁主要由多糖与果胶、纤维素、胼胝质组成，它们影响细胞的刚度和花粉粒的粘弹性，并对花粉管的周向拉应力有抵抗作用[gydF4y2Ba70gydF4y2Ba]。此外，胼胝质周期性沉积并形成胼胝质塞，以维持花粉管的顶端扩张区，并将活跃区与退化区分开。生长缓慢的花粉管不会继续在细胞壁上呈现稳定的胼胝质，也不会有胼胝质塞沉积[gydF4y2Ba71gydF4y2Ba]。胼胝质由β- 1,3 -葡聚糖组成，后者通过质膜中的胼胝质合成酶(Callose synthase, CalS)合成。复合物沉积在预先存在的纤维素细胞壁和质膜之间的旁膜空间中[gydF4y2Ba72gydF4y2Ba]。用S4B和ABF染料溶液对dstorm染色证实了该模型[gydF4y2Ba73gydF4y2Ba，gydF4y2Ba74gydF4y2Ba]。花粉胼胝质的合成与花粉管生长的调控密切相关。花粉管生长依赖于极化质膜转运体、钙浓度梯度振荡以及与其他传导机制的协同作用，构成了花粉管生长的中心调控机制[qh]gydF4y2Ba75gydF4y2Ba]并参与花粉管生长的下游调控，如NO信号或LURE [gydF4y2Ba62gydF4y2Ba，gydF4y2Ba76gydF4y2Ba，gydF4y2Ba77gydF4y2Ba]。NO供体s -亚硝基-n -乙酰青霉胺(SNAP)促进NO信号转导，细胞外CagydF4y2Ba2 +gydF4y2Ba内流，肌动蛋白含量增加。平行伸长的微灯丝束向花粉管顶端延伸，最终导致顶端花粉管中胼胝质合酶的形态和分布以及花粉管生长显著增加，说明胼胝质合酶依赖于微灯丝的运输;由钙信号调节的过程[gydF4y2Ba78gydF4y2Ba]。胼胝质分布影响着花粉管的正常生长，与花粉管生长的调控密切相关。胼胝质塞的形态是花粉管生长的体现，是影响花粉竞争力的重要因素。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

我们得出结论，2n花粉参与杂交，在那里它具有竞争优势。细胞学观察结果表明，花粉母细胞PMC在减数分裂中期失败的细胞质分裂或核分裂产生了2n花粉。“老红脸”(2x)的2n花粉自然产生率约为1.39%，而F1后代的四倍体自然产生率高达44.00%。对“橙火”和“DEE”花粉在柱头上萌发和雌蕊生长的时空特征进行了观察，结果表明，2n花粉在柱头上的发芽率并不优于1n花粉，但在穿越柱头进入花柱的过程中，2n花粉的发芽率分别增加到30.90%和37.20%。2n花粉管的胼胝质塞明显比1n花粉管薄，这可能是影响竞争过程的重要因素gydF4y2Bar .矮牵牛gydF4y2Ba．我们实验中涉及的每个性状对F1形态表型都非常重要。gydF4y2Ba

方法gydF4y2Ba

混合实验gydF4y2Ba

4个杂交组合的试验结果见表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba于2013年5月至2017年7月进行。杂交前两天，将‘Old Blush’未开放花的花药(即父本)收集在培养皿中，然后将花药储存在干燥通风的地方，在那里花药自然破裂并脱落花粉。我们从“橙火”未开放的花朵上，即杂交实验中的母本，从外到内剥去花瓣和所有雄蕊。雄花粉被放置在开花的雌柱头上，用刷子处理掉整个雄蕊。授粉后，我们把羊皮纸装袋并贴上标签。20天后，从花序上取下纸袋。果实和种子于2013年10月18日收获，放置在1-4°C的湿沙储存中，之后从沙中取出，在25°C的温室中播种。用统计学方法测定发芽率。2014年6月1日，在一片空地上种植F1幼苗。于2015年5 - 10月对2年生F1植株的形态进行了研究。 The plant materials in the experiment were collected from and approved by the Beijing Institute of Landscape Architecture.

流式细胞术及茎尖染色体压缩法鉴定倍性gydF4y2Ba

每株植物鲜叶约1.0 g。样品用蒸馏水洗涤，滤纸干燥，放置在冷冻的培养皿上，加入预冷的LB01裂解缓冲液(约1-2 mL)，用锋利的刀片快速切碎一次。在整个过程中，样品都浸泡在裂解缓冲液中，以便有效地解离细胞核。裂解缓冲液被培养皿中的样品吸收，通过400 μm孔过滤膜过滤到1.5 mL埃彭多夫管中，置于冰箱中，4°C孵育5 min。然后将样品在4°C下以1500 r/min离心5min。丢弃上清后，每个样品加入100 μL冷冻裂解缓冲液和150 μL冷冻碘化丙啶(PI)染料。然后将样品保存在黑暗的冰箱中，在4°C下染色10分钟。将样品转移到样品管中，使用流式细胞术(FCM) (BD公司Accuri C6流式细胞术)检测并收集了5000-10,000个颗粒。以已知的‘Old Blush’倍性作为倍性的外部标准，通过比较其荧光信号的强度来确定倍性样品。gydF4y2Ba

将生长旺盛的芽尖浸泡在饱和的三氯胺水溶液中2小时，用水冲洗，然后在卡诺固定液(乙醇:乙酸= 3:1)中固定2小时至24小时，之后在裂解缓冲液(盐酸:95%乙醇= 1:1)中放置20 - 30分钟，温度为20°C。然后洗涤三次15分钟，压缩，用改良的碱性品红染色后观察。gydF4y2Ba

“老红脸”2n花粉自然产生率和活力gydF4y2Ba

采集‘Old Blush’天然花粉1n和2n花粉的混合物，用0.1%乙酰胭脂红染色，用徕卡DM 2500荧光显微镜用Digimizer图像分析软件V 4.2.6测量花粉直径。这个实验重复了三次。我们在显微镜下计数花粉的数量，通过15次观察，确定了2n花粉的自然产生率。gydF4y2Ba

使用Crespel等人的方法鉴定了' Old Blush '的2n花粉。[qh]gydF4y2Ba29gydF4y2Ba]。简而言之，在显微镜下进行Alexander染色后测量花粉直径，每个样品测量500粒以上的花粉粒。采用2 μm梯度对不同大小的花粉数量进行计数，以花粉数量最多的梯度的平均直径作为1n花粉群体的平均直径，2n花粉的直径是1n花粉平均直径的1.3倍以上。用同样的方法计算花粉管宽度，并评价离体萌发6 h时花粉管宽度与花粉直径是否呈正相关gydF4y2Ba．gydF4y2Ba如果二者呈正相关，则花柱中2n花粉管的判定标准可用于我们的实验。gydF4y2Ba

“老红脸”二倍体2n花粉的细胞学观察gydF4y2Ba

在花粉母细胞到成熟花粉的不同发育阶段收集' Old Blush '二倍体的花蕾，洗涤后在卡诺固定液(乙醇-乙酸溶液)中固定2-24小时。然后在盐酸溶液(95%乙醇= 1,1)中在室温下解离20-30分钟，再次解离并洗涤三次，每次15分钟。从花蕾中剥离花粉，用0.10%乙酰胭脂红染色，压缩，用徕卡DM 2500和徕卡DFC 500显微镜观察。为了研究‘Old Blush’花粉的超微结构，我们用专用胶带将花粉固定在显微镜台上，用扫描电子显微镜(HITACHI TM3000)观察。gydF4y2Ba

利用SSR和SRAP分子标记对F1子代真杂交种进行分子鉴定gydF4y2Ba

采用DP320植物基因组提取试剂盒(Tiangen Bioch)提取基因组DNA。科技。Com。，Beijing, China). The samples were separated by electrophoresis on 0.8% (wgydF4y2Ba/gydF4y2BavgydF4y2Ba)琼脂糖凝胶，用紫外分光光度计评估DNA的质量和浓度。实验期间将其稀释至25 ng/μL，保存于- 20°C的冰箱中。gydF4y2Ba

在SSR实验中以基因组DNA为模板，以‘Orange Fire’的母本和‘Old Blush’的父本，共引物21对(附加文件)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:表S5)进行扩增，筛选亲本中的多态性引物对F1杂交后代进行SSR扩增。引物组合由北京瑞博星科(gydF4y2Bawww.ruibiotech.comgydF4y2Ba生物科技股份有限公司gydF4y2Ba

在SRAP实验中，由上海生物工程技术服务有限公司设计筛选并合成了14对上下游引物组合，筛选出1对扩增带清晰稳定的引物组合用于正式扩增。gydF4y2Ba

每个25 μL PCR混合物由12.5 μL 2 × Taq PCR MasterMix、1 μL引物溶液、1 μL模板溶液和10.5 μL ddH组成gydF4y2Ba2gydF4y2BaO.采用以下PCR条件:94°C初始变性5min，然后94°C变性1min, 35°C退火1min, 72°C延伸1min，然后94°C变性1min, 50°C退火1min, 72°C延伸1min，最后72°C延伸10min。样品在2% (w/v)琼脂糖凝胶上电泳分离。每次凝胶电泳在150 V恒定电压下，在20°C下运行30分钟，然后使用凝胶成像系统进行观察和拍照。gydF4y2Ba

‘橙火’和‘DEE’花粉柱头萌发和雌蕊生长的时空特征gydF4y2Ba

分别于‘Old Blush’花粉授粉后0、4、6、8、12、16、20、24、48、72 h采集‘Orange Fire’和‘DEE’母本花，剥去完整的心皮，在4°C的FAA(福尔马林-乙酸-酒精)溶液中保存过夜。在紫外荧光显微镜下，用苯胺蓝染色、软化后观察‘Old Blush’和‘Orange Fire’花粉在柱头上萌发、花粉管运动和伸长以及子房进入的时间和空间特征。结合结实率统计结果，证实了2n花粉竞争优势。每个处理使用3个芽，每个样品中观察到10个授粉雌蕊。gydF4y2Ba

遗传性状的主成分分析gydF4y2Ba

采用Spss统计v17.0软件进行主成分分析(PCA)统计，对‘橙火’ב老红脸’F1杂交品种的倍性、株型、颜色、花瓣、花径、顶小叶长、顶小叶宽、小叶形状、尖尖等9个特征性状进行分析。进一步研究了花径、顶小叶长度、花粉极轴长度和保卫细胞长度4个表型数量性状之间的相关性。gydF4y2Ba

缩写gydF4y2Ba

扩增片段长度多态性gydF4y2Ba

扩增片段长度多态性gydF4y2Ba

胼胝质合成酶gydF4y2Ba

第一代孝顺gydF4y2Ba

Formalin-acetic acid-alcoholgydF4y2Ba

流式细胞术gydF4y2Ba

流式细胞术gydF4y2Ba

一级赔偿gydF4y2Ba

基因组原位杂交gydF4y2Ba

谷氨酸受体样通道gydF4y2Ba

不确定的分割返还gydF4y2Ba

微纤丝gydF4y2Ba

微管gydF4y2Ba

聚合酶链反应gydF4y2Ba

Propidium碘化gydF4y2Ba

小孢子母细胞gydF4y2Ba

二级联赛的恢复gydF4y2Ba

二级联赛的恢复gydF4y2Ba

S-nitroso-N-acetylpenicillaminegydF4y2Ba

序列相关的扩增多态性gydF4y2Ba

简单序列重复gydF4y2Ba

STIGMA-SPECIFIC PROTEIN1gydF4y2Ba

紫外线gydF4y2Ba

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文章gydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

下载参考gydF4y2Ba

致谢gydF4y2Ba

本研究得到绿化植物育种北京市重点实验室、树木育种国家工程实验室、林木与观赏植物遗传育种教育部重点实验室和国家林业局树木与观赏植物育种与生物技术实验室的支持。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

SMG和YZ设计了研究并构思了实验。YZ和LJF进行实验，分析数据，撰写论文。MHY和FZ参与分析和撰写稿件。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。gydF4y2Ba

资金gydF4y2Ba

本研究由北京市自然科学基金(项目No. 6162014)、北京市公园管理中心科技项目(项目No. 6162014)资助。zx 2018014)，国家自然科学基金项目(项目编号:31870573)。各基金支持实验材料费、论文修改费等。gydF4y2Ba

数据和材料的可用性gydF4y2Ba

在当前研究中使用和/或分析的数据集可根据通讯作者的合理要求获得。gydF4y2Ba

作者信息gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

北京林业大学生物科学与技术学院林木育种国家工程实验室，北京市海淀区清华东路35号，100083gydF4y2Ba

高淑敏，杨慕涵，张帆，范丽娟，周燕gydF4y2Ba

北京市园林研究所，北京市绿化植物育种重点实验室，北京市朝阳区花家地7号，100102gydF4y2Ba

杨慕涵，张帆，范丽娟，周燕gydF4y2Ba

作者gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba燕周gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

道德声明gydF4y2Ba

伦理批准并同意参与gydF4y2Ba

本研究中使用的所有植物材料(包括种子)均允许从北京园林研究所收集。植物(栽培或野生)的实验研究，包括植物材料的收集，都符合机构、国家或国际准则。稿件中已附有一份声明，声明我们的实地工作已根据当地相关立法和相关指导方针获得批准。gydF4y2Ba

发表同意书gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者宣称他们没有竞争利益。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

施普林格·自然对已出版的地图和机构关系中的管辖权要求保持中立。gydF4y2Ba

附加文件gydF4y2Ba

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图S1。gydF4y2Ba‘橙火’ב老红脸’F1杂交种茎尖体细胞染色体及染色体倍性图。A1。来自' Orange Fire ' × ' Old Blush '的4号F1花(2n = 3x = 21)。A2。4号F1体细胞染色体。A3。流式细胞术检测4号F1染色体倍性图，荧光强度为361,282。B1。来自' Orange Fire ' × ' Old Blush '的5号F1花(2n = 4x = 28)。B2。 somatic cell chromosomes of No.5. B3. chromosome ploidy picture of No.5 F1 detected by flow cytometry with a fluorescence intensity of 489,697. C1.flower of No.7 F1 (2n = 4x = 28) from ‘Orange Fire’ × ‘Old Blush’. C2. somatic cell chromosomes of No.7 F1. C3. chromosome ploidy picture of No.7 F1 detected by flow cytometry with a fluorescence intensity of 452,313. D1.flower of No.11 F1 (2n = 4x = 28) from ‘Orange Fire’ × ‘Old Blush’. D2. somatic cell chromosomes of No.11 F1. D3. chromosome ploidy picture of No.11 F1 detected by flow cytometry with a fluorescence intensity of 533,757. E1. flower of No.12 F1 (2n = 4x = 28) from ‘Orange Fire’ × ‘Old Blush’. E2. somatic cell chromosomes of No.12 F1. E3. chromosome ploidy picture of No.12 F1 detected by flow cytometry with a fluorescence intensity of 479,809. F1. flower of No.14 F1 (2n = 4x = 28) from ‘Orange Fire’ × ‘Old Blush’. F2. somatic cell chromosomes of No.14 F1. F3. chromosome ploidy picture of No.14 F1 detected by flow cytometry with a fluorescence intensity of 511,126. G1. flower of No.16 F1 (2n = 3x = 21) from ‘Orange Fire’ × ‘Old Blush’. G2. somatic cell chromosomes of No.16 F1. G3. chromosome ploidy picture of No.16 F1 detected by flow cytometry with a fluorescence intensity of 369,934. H1. flower of No.17 F1 (2n = 3x = 21) from ‘Orange Fire’ × ‘Old Blush’. H2. somatic cell chromosomes of No.17 F1. H3. chromosome ploidy picture of No.17 F1 detected by flow cytometry with a fluorescence intensity of 420,158. I1. flower of No.18 F1 (2n = 3x = 21) from ‘Orange Fire’ × ‘Old Blush’. I2. somatic cell chromosomes of No.18 F1. I3. chromosome ploidy picture of No.18 F1 detected by flow cytometry with a fluorescence intensity of 424,627. J1. flower of No.19 F1 (2n = 3x = 22) from ‘Orange Fire’ × ‘Old Blush’. J2. somatic cell chromosomes of No.19 F1. J3. chromosome ploidy picture of No.19 F1 detected by flow cytometry with a fluorescence intensity of 404,424. K1. flower of No.24 F1 (2n = 4x = 28) from ‘Orange Fire’ × ‘Old Blush’. K2. somatic cell chromosomes of No.24 F1. K3. chromosome ploidy picture of No.24 F1 detected by flow cytometry with a fluorescence intensity of 494,438. L1. flower of No.25 F1 (2n = 4x = 28) from ‘Orange Fire’ × ‘Old Blush’. L2. somatic cell chromosomes of No.25 F1. L3. chromosome ploidy picture of No.25 F1 detected by flow cytometry with a fluorescence intensity of 459,819.图S2。gydF4y2Ba流式细胞术检测‘Orange Fire’בOld Blush’亲本和F1杂种的倍性图。gydF4y2Ba图S3。gydF4y2Ba流式细胞术检测‘春潮’ב斯莱特中国深红’亲本和F1杂种的倍性图。gydF4y2Ba图S4。gydF4y2Ba用流式细胞术检测' DEE ' x ' Slater ' s Crimson China '亲本和F1杂种的倍性图。gydF4y2Ba图S5。gydF4y2Ba用流式细胞术检测‘DEE’בOld Blush’亲本和F1杂种的倍性图。(DOC 2564kb)gydF4y2Ba

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表S1。gydF4y2Ba流式细胞术检测‘Orange Fire’בOld Blush’亲本和F1杂交体的DNA含量。gydF4y2Ba表S2。gydF4y2Ba流式细胞术检测‘春潮’ב斯莱特深红中国’亲本和F1杂种的DNA含量。gydF4y2Ba表S3。gydF4y2Ba流式细胞术检测' DEE ' x ' Slater ' s Crimson China '亲本和F1杂交体的DNA含量。gydF4y2Ba表S4。gydF4y2Ba流式细胞术检测‘DEE’בOld Blush’亲本和F1杂交种的DNA含量。gydF4y2Ba表S5。gydF4y2Ba21对玫瑰SSR引物用于亲子鉴定。(DOCX 29kb)gydF4y2Ba

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高,Sm。，Yang, Mh., Zhang, F.et al。gydF4y2Ba2n花粉在几种多倍体杂交中的强竞争作用gydF4y2Ba罗莎矮牵牛gydF4y2Ba．gydF4y2BaBMC Plant BiolgydF4y2Ba19，gydF4y2Ba127(2019)。https://doi.org/10.1186/s12870-019-1696-zgydF4y2Ba

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收到了gydF4y2Ba：gydF4y2Ba2018年10月7日gydF4y2Ba

接受gydF4y2Ba：gydF4y2Ba2019年2月26日gydF4y2Ba

发表gydF4y2Ba：gydF4y2Ba2019年4月4日gydF4y2Ba

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