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骨关节炎中软骨下骨病理改变及细胞分子机制研究进展

花匠小妙招
2024-11-29 14:53

骨关节炎(osteoarthritis，OA)是一种缓慢的、进行性的退行性骨关节疾病，主要表现为关节肿胀、疼痛、关节活动受限，导致残疾、功能丧失、生活质量下降，加重患者经济负担。人口老龄化和肥胖导致OA的发病率不断增加 [ 1 ]，其特点是关节软骨和韧带的进行性退变，以及慢性滑膜炎和异常骨重塑。以往认为OA是一种发生在关节软骨的退行性疾病，但越来越多的研究表明，它是一种涉及全关节组织结构的疾病，软骨、软骨下骨、滑膜和滑囊液在OA的发生和进展中均起到关键作用。既往的研究主要是针对软骨及关节滑膜，对软骨下骨的认识较少。本文就软骨下骨的改变及细胞分子机制进行综述。

1　软骨下骨的结构、骨-软骨结构单元及其功能

软骨下骨是指钙化软骨下的骨组织，包括软骨下骨板和软骨下骨小梁。软骨下骨板是紧贴在钙化软骨下面的一层薄薄的皮质骨，在其间有神经、血管从骨小梁向钙化软骨层穿过，营养软骨细胞。软骨下骨与覆盖在其上的软骨之间的生物串扰，由非钙化软骨、潮线、钙化软骨、粘合线和软骨下骨组织组成关节软骨-软骨下骨系统，成为一个紧密组合的功能单位，称之为骨-软骨结构单元(见图1 )。软骨下骨为骨-软骨单结构单元的软骨提供了营养和机械支持，表明软骨下骨微环境的变化可以影响软骨的代谢 [ 2 ]。

软骨下骨板作为关节软骨的基座，其主要功能是提供支撑作用和作为软骨下骨小梁与钙化软骨通道。软骨下骨小梁位于软骨下骨板下方，其特点为空间率高、代谢强，神经、血管和骨髓丰富，起到吸收负荷和营养软骨的作用 [ 3 ]。

2　OA中软骨下骨的病理改变

在不同的OA阶段中，软骨下骨的病理变化不尽相同。早期OA中，软骨下骨病理改变为破骨细胞黏附在骨表面，起到溶骨作用，表现为软骨下骨小梁数量变少，骨小梁间距变大，空隙变多。在横截面观察骨小梁出现更多的间距和受损的网络，说明早期骨小梁发生了明显的骨折，此时的软骨下骨板变得更薄，空隙率增加更明显，矿物质/基质比值逐渐增加 [ 4 ]。早期的软骨下骨的病理改变机制尚未完全了解，但与成骨细胞介导的骨形成和以破骨细胞介导的骨吸收之间的失衡、软骨下毛细血管异常增加、软骨与软骨下骨串扰增强密切相关 [ 5 ](见图2 )。晚期OA中，软骨下骨病理改变为骨形成增加，进展为软骨下骨钙化。从软骨下骨的微结构观察，与正常的软骨下骨相比，表现为骨小梁数量减少、厚度增加、排列分散，而骨体积指数增加，由原来的棒状骨小梁转变为板状骨小梁 [ 6 ]。部分晚期OA出现软骨下骨囊肿(见图2 )。

Chen等 [ 7 ]研究报道了肥胖患者骨-软骨单位界面存在水平裂隙，其特征是不规则软骨侵蚀、纤维肉芽组织浸润、游离软骨/骨碎片和微毛细血管破裂。这可以被认为是一种新的病理特征，在退行性骨软骨组织中也发现了神经血管侵犯。减轻体重对预防OA的进展已形成共识，而预防或阻止软骨下骨的神经血管向软骨层增生可能是防治OA进展的潜在靶点。

3　OA中软骨下骨细胞的分子机制

成年骨骼通过骨重塑不断更新，骨重塑是由破骨细胞、成骨细胞和骨细胞直接进行，这些细胞的正常功能是维持正常骨骼的关键。成骨细胞负责骨基质的合成、分泌和矿化，破骨细胞负责骨溶解、骨吸收，而骨细胞在软骨下骨骨重建中起到调节作用。成骨细胞和破骨细胞在骨细胞的调节作用下，在时间和空间上维持动态平衡，维持正常骨骼 [ 8 ]。软骨下骨重建异常现在被认为是OA发展的关键因素，它会破坏骨-软骨单元的完整性，导致软骨和软骨下骨之间的串扰增加。OA软骨下骨的细胞分子的病理改变机制是软骨下骨对异常的机械应力及各种生物信号刺激反应，打破了破骨细胞、成骨细胞与骨细胞生理动态平衡，从而导致骨重建异常。因此，了解软骨下骨细胞分子机制有助于破解OA的发生发展。

3.1　破骨细胞

破骨细胞是由骨髓祖细胞分化而成，在骨吸收中起重要作用。破骨细胞可通过自身分泌因子或对骨细胞的骨溶解产生的因子影响骨-软骨单元骨平衡。成熟的破骨细胞出现在骨表面形成一个封闭区，释放氢离子和催化酶进行骨溶解。骨基质中有许多与骨代谢密切相关的因子，如转化生长因子(transforming growth factor，TGF)-β1、胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factors，IGF-1)和磷酸钙复合体，这些因子可以调节骨代谢，从而影响关节状态 [ 9 ]。Liu等 [ 10 ]发现，早期OA中含有miRNAs的破骨细胞衍生外泌体增加，阻断破骨细胞来源的外泌体的分泌，可显著延缓OA的进展。此外，静脉注射循环外泌体破骨细胞来源的miRNA通过抑制基质金属蛋白酶(tissue inhibitor of matrix，TIMP)-2和TIMP-3的组织抑制剂加重OA进展，表明破骨细胞和软骨细胞之间的外泌体miRNA串扰通过循环发生。因此，将破骨细胞miRNA外泌体转移至软骨细胞是可能解决OA进展的潜在治疗途径(见图3 )。Cherifi等 [ 11 ]的另一项研究表明，鞘氨醇1-磷酸(sphingosine 1-phosphate，S1P)作为涉及破骨细胞-成骨细胞串扰的耦合因子，也参与了破骨细胞和软骨细胞之间的分解代谢串扰(见图4 )。

图3

细胞因子介导软骨细胞、破骨细胞、骨细胞和成骨细胞所致的OA示意图

注：1-骨基质中TGF-β通过骨细胞影响软骨下骨的稳态；2-含有miRNAs破骨细胞衍生外泌体增加，S1P增加，影响软骨细胞；3-破骨细胞通过MMP对骨-软骨单元降解；4-破骨细胞分泌TGF-β1，对软骨细胞影响；5-破骨前细胞分泌PDGF-BB刺激h型毛细血管形成；6-SOST通过腔隙小管网到达骨表面，抑制成骨细胞的经典Wnt/β-连环蛋白信号转导，调节骨量；7-DMP1的表达增加延迟成骨细胞的分化，导致矿化障；8-机械负荷可抑制TGF-β-smad2/3通路，导致皮质骨增加；9-骨细胞分泌的核因子κB受体活化因子配体(receptor activator for nuclear factor-κ B ligand，RANKL)可间接诱导破骨细胞的募集和分化。

图4

破骨细胞、成骨细胞和骨细胞在OA软骨下骨中窜扰示意图

有研究发现，破骨细胞降解骨-软骨单元连接，主要通过基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)和半胱氨酸蛋白酶依赖的方式实现，从而导致骨密度降低 [ 12 ]。何小文等 [ 13 ]研究结果显示，长链非编码RNA GAS5能抑制TIMP-3的表达，促进软骨细胞胶原蛋白降解，导致OA进展。Zhang等 [ 14 ]的研究表明，在一定的机械刺激下，TGF-β1在破骨细胞中表达水平显著升高，且与刺激强度正相关。对比分析表明，当软骨细胞与破骨细胞共同培养时，软骨细胞凋亡水平明显升高。此外，TGF-β1受体抑制剂可逆转大鼠OA，抑制软骨细胞凋亡，减轻软骨退变。这些研究表明软骨下骨中的TGF-β1可以转移到软骨层，对软骨细胞有不良影响。Liu等 [ 15 ]的研究表明，在OA期间软骨下骨骨重建中h型毛细血管的形成增加，并确定了相关的因素和分子途径。破骨前细胞分泌血小板源性生长因子β多肽b(platelet-derived growth factor-BB，PDGF-BB)刺激h型毛细血管形成 [ 16 ](见图3 )。Cui等 [ 17 ]的研究表明，血小板源性生长因子β受体(platelet-derived growth factor receptor beta，PDGFR-β)的表达主要发生在OA患者和啮齿动物OA模型的内皮细胞中，在啮齿动物OA模型的软骨下骨中显著升高。小鼠OA模型显示内皮细胞中PDGFR-β缺失时，h型毛细血管生成较少，故其改善了软骨下骨恶化，减轻了软骨变性。内皮细胞PDGFR-β通过PDGFR-β/talin1/黏附激酶(focal adhesion kinase，FAK)复合物的形成促进血管生成，证实其为血小板衍生生长因子在OA病理生理中的直接靶点。而Zhang等 [ 18 ]的研究表明，抑制破骨细胞形成的淋巴细胞胞浆蛋白1可改善前交叉韧带断裂后膝OA软骨下骨重塑和软骨降解。这与部分预防前交叉韧带断裂诱导的软骨下h型血管形成、增加氧和降低软骨中缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor，HIF)-1α的表达有关。

由此可见，破骨细胞在OA中直接或间接参与其发生发展机制，所以抑制破骨细胞的过度增殖或调节破骨细胞相关因子的分泌可能是防治OA的研究方向。

3.2　成骨细胞

成骨细胞从间充质细胞分化而来，经历四个成熟阶段——成骨前细胞、成骨细胞、骨内衬细胞和骨细胞，促进骨形成。生理状态下，成骨细胞正常分化，维持正常的软骨下骨的骨重建。

OA中成骨细胞活性发生了改变，与正常的成骨细胞相比，OA软骨下成骨细胞的碱性磷酸酶活性、RANKL、骨保护素、TGF-β1、IGF-1和血管内皮生长因子释放水平增加。成骨细胞分泌前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)可作用于破骨细胞的受体，刺激破骨细胞生成，抑制作用可改善OA的发生。Jiang等 [ 19 ]报道，破骨细胞中的PGE2/E前列腺素4(E prostanoid 4，EP4)信号介导软骨下骨的血管生成和感觉神经元神经支配，促进OA的进展和疼痛，并且HL-43抑制EP4对OA具有治疗潜力。Zhu等 [ 20 ]发现了一种新的EP4拮抗剂HL-43，能够抑制软骨下骨的破骨细胞和成骨细胞数量(见图4 )。Li等 [ 21 ]研究发现，拉伸应变刺激软骨细胞分泌外泌体miR-9-5p，软骨细胞高表达miR-9-5p的外泌体可以通过靶向Krüppel样因子5(Krüppel-like factor 5，KLF5)抑制成骨细胞分化，关节内注射外泌体miR-9-5p可减轻小鼠内侧半月板不稳定手术引起的OA。

以上研究表明，OA中成骨细胞通过自身活化或分泌因子，对OA起到改善或加速的作用，因此，了解其机制有助于防治OA。

3.3　骨细胞

骨细胞由成骨细胞分化而成，是矿化骨基质中的细胞，占成人骨中所有细胞的90%～95%。骨细胞是一种机械感应细胞，能分泌多种因子，它们在软骨下骨重建调节骨稳态中发挥着重要的多功能作用。在最近一项关于骨细胞的全基因组关联研究中，发现了与OA相关的新候选位点，这些基因在骨细胞中的表达可能有助于软骨下骨重建，而这在OA的发病机制中起着重要作用 [ 22 ]。

Tanaka等 [ 23 ]研究发现，生理情况下细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinases，CDKS)可调控成骨细胞分化为骨细胞，并且在骨量的获得及维持骨量中起到重要作用。而在OA中软骨下骨的改变与骨细胞标志物水平相关 [ 24 ]，表现为OA中硬化蛋白(sclerostin，SOST)表达减少，牙本质基质酸性磷蛋白(dentin matrix acidic phosphoprotein，DMP)-1表达增加，说明硬化蛋白是维持骨稳态的分子调节剂。其机制为硬化蛋白通过腔隙小管网到达骨表面，硬化蛋白抑制成骨细胞中经典的Wnt/β-连环蛋白(wingless-type/β-catenin，Wnt/β-catenin)信号转导，基因抑制刺激骨细胞，Wnt/β-catenin信号传导，防止骨吸收并减弱骨溶解。因此，OA骨细胞中硬化蛋白表达的降低可能是OA中软骨下骨质量增加的原因。与硬化蛋白水平相反，牙本质基质酸性磷蛋白水平的升高可导致矿化紊乱，并显著延迟成骨细胞的分化 [ 25 ]。OA软骨下骨细胞中牙本质基质酸性磷蛋白水平的升高对OA中软骨下骨的正常矿化过程有害，导致类骨体积增加，骨矿化不规则。这些结果表明，骨细胞的不规则形状可能会改变骨感知机械刺激的能力，从而导致矿物质密度的变化，进而导致OA的发生。

骨细胞通过分泌TGF-β1、RANKL来调节软骨下骨的骨稳态，从而影响OA。Dai等 [ 26 ]发现在部分和全部缺损软骨下的软骨下骨中TGF-β信号被激活。此外，有研究发现，负荷可导致皮质骨合成代谢的增加，其机制与抑制骨细胞中TGF-β-smad2/3通路有关 [ 27 ]。骨细胞分泌的RANKL可间接诱导破骨细胞的募集和分化，从而间接调节软骨细胞 [ 28 ](见图3 )。研究表明，减少小鼠骨细胞数量会导致骨骼老化更快，并影响健康骨骼和骨髓生长所需的不同细胞类型的平衡 [ 29 ]。未来的研究可能集中于寻找能让骨细胞在衰老过程中继续发挥作用的药物，从而有助于维持骨骼健康。

4　OA中软骨下骨骨重建的信号通路

4.1　Wnt信号通路

Wnt是一种细胞外糖蛋白，其信号转导涉及不同的Wnt受体，包括调节β-连环蛋白(β-catenin)依赖和非典型的β-连环蛋白依赖通路。通过旁分泌和自分泌效应，Wnt信号被证明在骨骼发育中发挥了间充质干细胞凝结、软骨分化、软骨细胞肥大、生长板软骨细胞组织和成骨细胞分化和成熟等方面的重要作用。高水平的Wnt信号转导可诱发骨硬化。

Dickkopf相关蛋白3(Dickkopf-related protein 3，DKK3)是Wnt拮抗性DKK家族的非典型成员。Liang等 [ 30 ]通过免疫组织化学和免疫荧光分析发现，骨细胞中β-catenin的表达与OA的进展呈正相关，而DKK3表达与OA进展呈负相关。蛋白质印迹分析显示β-catenin表达在中度OA中较高，然后在重度OA中降低。另一方面，DKK3水平随着从正常、轻度到中度OA的进展而下降，表明β-catenin和DKK3表达随OA程度的不同而不同。该研究表明了DKK3和β-catenin在OA软骨下骨重塑中可能发挥相反的作用，说明软骨细胞中的β-catenin信号通过调控破骨细胞的活性在骨生长和骨重塑中发挥关键作用。

4.2　TGF-β/骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)信号通路

TGF-β超家族由BMPs、TGF-βs、生长/分化因子等因子组成。TGF-β超家族控制着软骨下骨重建及维持稳态并调控骨再生，因此对关节软骨下骨的研究逐渐聚焦在TGF-β/BMP信号通路。既往研究表明，在体外和体内模型实验中，骨吸收时释放的活性TGF-β1通过诱导骨髓基质细胞的迁移来协调骨形成。Zhen等 [ 31 ]发现，关节软骨中TGF-β的激活集中在机械应力高的区域，表明机械应力介导了潜在TGF-β的激活。在分子水平上，机械应力激活软骨细胞的αV整合素，进而结合潜伏相关肽，从而掩盖TGF-β的活性(见图3 )。Bailey等 [ 32 ]发现，激活的TGF-β会通过骨细胞影响软骨下骨板的稳态。DMP1-Cre小鼠的骨细胞特异性TGF-β受体Ⅱ(TGF-βRⅡ)缺失导致16周龄雄性小鼠的软骨下骨厚度增加，同时伴有软骨下骨硬化蛋白水平升高和软骨退行性变水平增加；另一方面，在内侧半月板、韧带损伤后，骨细胞特异性TGF-βRⅡ敲除小鼠中没有观察到软骨下骨板增厚，这表明骨细胞TGF-β信号是对损伤的机械敏感反应所必需的。总的来说，过度的机械负荷激活了TGF-β信号，导致软骨下骨板增厚和软骨退行性变，这些证据表明针对软骨下骨板的TGF-β信号的靶向治疗存在可能。

OA患者的BMP信号通路异常且不稳定 [ 33 ]，软骨细胞中BMP-2和BMP-4的早期表达显著上调，并随着OA程度的增加而增加。BMP-4在骨-软骨连接处的表达随着OA的进展而增加，可能通过诱导肥大软骨细胞和成骨细胞的分解代谢和组织重塑程序来促进骨-软骨连接的病理重塑 [ 34 ]。

4.3　丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路

MAPK信号通路由细胞外信号调节蛋白激酶、c-Jun氨基末端激酶、蛋白38激酶组成。丝裂原激活蛋白激酶/细胞外信号调节激酶通路与细胞增殖、分化、迁移、衰老和凋亡相关，细胞外信号调节激酶通路对骨和软骨生长发育及代谢起调控作用，且在OA中呈高表达 [ 35 ]。

研究表明，蛋白38、细胞外信号调节蛋白激酶在OA中的软骨表达水平增高，通过抑制MAPK通路相关因子，可阻止细胞外基质的降解，表明MAPK信号通路与OA进展存在内部相关性 [ 36 ]。MAPK信号通路的失调会加速炎症反应，导致大量软骨基质降解酶的释放，加重软骨退行性变 [ 37 ]，因此，MAPK被认为在OA的进展中起着重要作用，目前被认为是调控OA的主要信号通路。

4.4　骨保护素(osteoprotegrin，OPG)/RANKL/核因子KB受体活化因子(receptor activator of nuclear factor κB，RANK)信号通路与OA

OPG/RANKL/RANK系统是由美国骨与矿物质协会把OPG、RANK、RANKL作为一个整体提出命名。OPG主要由成骨细胞、B细胞分泌，是一种二聚体形式的诱饵蛋白，目前认为其在骨重塑过程中OPG可以竞争性与RANKL结合(见图4 )，减少破骨细胞前体的成熟、分化，减少骨量丢失 [ 38 ]。RANKL是由成骨细胞谱系细胞产生，作用为促进破骨细胞募集和分化。另一方面，RANKL与其受体RANK结合，而RANK是位于破骨细胞前体或成熟破骨细胞表面的跨膜蛋白，当RANKL与RANK结合成为RANKL-RANK复合体后，将激活破骨细胞内部一系列因子，发挥成熟破骨细胞溶骨作用，导致骨量丢失 [ 39 ]。

5　总结与展望

OA是一种非常复杂的涉及全关节结构的疾病，其发病的机制具有多因素、多层次特点，目前对其发病分子信号通路和具体机制的了解有限，导致OA的药理靶向治疗极为困难。本文综述了软骨下骨重塑的关键细胞和分子作用，以及关节炎软骨下骨骨细胞发病机制的变化，这些因素和相关通路是软骨下骨重塑异常导致OA的靶点。值得注意的是，文献中报道的在小鼠和细胞培养实验中得到的结果需谨慎看待，因动物模型及体外实验条件尚无法完全复制人类的OA发生发展的条件。人类的OA发生发展更为复杂，它与年龄、性别、遗传、负重、肥胖、创伤以及免疫代谢功能等多因素有关。无论如何，防病于未然仍然是上策，在OA早期进行干预以防止其进展是一种更有效的策略，可以获得更好的结果。因此，找出早期显著改变的关键信号通路和关键分子，控制分子通路之间的串扰以及关节软骨下骨-软骨之间的相互作用，是未来研究及治疗的重点。今后应全面了解各种早期OA中各病理信号的功能和调控，有助于制定更具体的解决方案来预防或逆转OA。