南瓜花叶病毒RT
南瓜花叶病毒RT-PCR试剂盒产品及特点 ：
聚合酶链式反应（PCR）是体外酶促合成特异DN**段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。本产品就是为满足这一需求根据 PCR 原理开发的产品，它具有下列特点：
1. 一管式操作，用户只需要提供样品即可。
2. 根据大豆热休克蛋白基因保守区域设计引物，能专一性检测出样品中的大豆成分，但不能检测其他非大豆成分。
3. 快速，整个检测过程（按一个样品计）所需时间仅为 2.0 小时。
4. 只需要普通 PCR 仪和凝胶电泳仪，无需配置贵重仪器设备。
5. 对混合样品中大豆成分的检测下限为 0.1%，对样品中大豆成分的核酸检测下限为 1.0ng/µL。
6. 本只能用于科研，足够 50 次 40uL 体系的常规 PCR。
南瓜花叶病毒RT-PCR试剂盒包装规格及成分：
编号
成分
十孔盒包装（去纸托）
试剂一
2×PCR MagicMix
1mL（亮黄盖）
试剂二
源性成分 PCR 引物混合液
100 uL（白盖）
试剂三
源性成分 PCR 阳性对照
50 uL（黄盖）
试剂四
超纯水
1 mL（本色盖）
试剂五
DNA 释放剂试用装
50 次（成分见下）
试剂六
免 DNA 提取试剂溶液 A 成分一
50 uL（白盖）
试剂七
免 DNA 提取试剂溶液 A 成分二
100uL（绿盖）
试剂八
免 DNA 提取试剂溶液 B
400 uL（红盖）
试剂九
使用手册
1 份
运输及保存：低温运输，-20℃保存，有效期一年。使用本试剂盒提供的阳性对照时，由于其浓度较高，一定要注意不要污染其他试剂和成分。在专门的区域操作。
自备试剂：DNA 模板。
南瓜花叶病毒RT-PCR试剂盒使用方法：
一、样品 DNA 的制备
1. 用自选方法纯化样品的 DNA，本产品跟市场上绝大多数核酸纯化产品兼容。
2. 如果有 N 个样品，则需要进行 N+2 个样品提取，多出的一个用作样品制备阳性对照管、另一个用作样品制备阴性对照管。如果用本试剂盒自带的DNA 释放剂试用装。则按下面步骤操作：
3. 配制溶液 A 工作液。以配制 1mL 工作液（足够 10 个样品）为例：在一干净塑料管中加入 10uL 溶液 A 成分一，20uL 溶液 A 成分二和 970uL 超纯水，充分混合均匀即可。溶液 A 工作液可室温放置，但最好在一周内用完，不要长期放置。一次检测一个样品需要 100uL 溶液 A 工作液，1mL 工作液足够 10 个样品。如果待测样品数量为其他数字，配制的溶液 A 工作液的体积需要做相应的调整。
4. 在标记好的 N+2 个离心管中，加入 1-5mg 固体样品（半粒芝麻大小）或 5uL 液体样品待测样品。在样品制备阳性对照中加入 5uL 阳性对照，在样品制备阴性对照中加入 5uL 水。
5. 在每个管中加入 100 uL 溶液 A 工作液，确保固体样品被溶液淹埋，如果是液体样品则震荡混匀。
6. 95℃保温 10 分钟。
7. 待冷却到常温后加入 10uL 溶液 B 并混匀得 DNA 释放液。每个样品得到的 DNA释放液足够进行 50-100 次 PCR。
二、南瓜花叶病毒RT-PCR试剂盒 设置 PCR 反应（40 uL 体系）
8. 在 N+2 个 PCR 管中加入下列成分，下面以样品数为 1 举例（注意：如果一次使用DNA 释放剂，每个样品设置两个模板用量的 PCR 反应，两个反应的模板使用量差 10 倍，由此确定用量，以后就用效果好的那个模板用量）：
成份
样品（用量1）
样品（用量2）
阳性对照
阴性对照
即用型 PCR Mix 3.0
20 uL
20 uL
20 uL
20 uL
源性 PCR 引物混合液
2 uL
2 uL
2 uL
2 uL
制备的样品
18 uL
2 uL
无
无
样品制备阳性对照
不加
不加
2 uL
不加
样品制备阴性对照
不加
不加
不加
2 uL
超纯水
不加
16 uL
16 uL
16 uL
9. 轻柔混匀后上机，按下面参数进行 PCR。
过程
温度
时间
预变性
94℃
10分钟
PCR 反应
（35 个循环）
94℃
30s
60℃
30s
72℃
30s
延伸
72℃
7分
10. 电泳检测 PCR 产物。预期的 PCR 产物长度为 216bp。阳性对照必须有此条带出现，阴性对照必须无任何扩增，否则实验无效。对没有扩增产物的样品，需要用通用引物（如真核生物专一 PCR 引物，需自备）测试是否有抑制剂或样品是否浓度达到 PCR 的要求，如果通用引物也扩不出来，需要浓缩并再次纯化 DNA 样品，或者更换 DNA 提取方法，直到通用引物能够扩增出预计大小的片段。
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