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有机氯类禁限用农药抗体的制备和应用研究进展

花匠小妙招
2024-11-30 20:40

农药在作物生长、提高产量、害虫防治等方面效果显著，但一些农药因对环境和人类产生不利影响而被禁止或限制使用[1]。农药的禁限用一般不是全球性的，通常被限制于一个国家或一些国家[2]。目前我国禁用的农药有46种，限制使用的农药有20种[3]，被禁限用的主要原因包括致癌、致畸、剧毒或高残留、环境风险等，见表1和表2。

表 1 我国46种禁用农药[3]

Table 1. The 46 banned pesticides in China[3]

农药
Pesticides禁用原因
Banned reason 六六六 hexachlorocyclohexane，滴滴涕 dichlorodiphenyltrichloroethane(DDT)，毒杀芬 toxaphene，艾氏剂 aldrin，狄氏剂 dieldrin，林丹 lindane，硫丹 endosulfan，氟虫胺 sulfluramid持久性有机污染物
Persistent organic pollutants 氟乙酰胺2-fluoroacetamide，甘氟 gliftor，毒鼠强 tetramine，氟乙酸钠 sodium fluoroacetate，毒鼠硅 silatrane，甲胺磷 methamidophos，对硫磷 parathion，甲基对硫磷 parathion-methyl，久效磷 monocrotophos，磷胺 phosphamidon高毒、剧毒
High toxicity 汞制剂 mercurycompounds，砷类 arsena，铅类 acetate高毒、富集
High toxicity, enrichment 苯线磷 fenamiphos，地虫硫磷 fonofos，甲基硫环磷 phosfolan-methyl，磷化钙 calciumphosphide，磷化镁 magnesium phosphide，磷化锌 zinc phosphide，硫线磷 cadusafos，蝇毒磷 coumaphos，治螟磷 sulfotep，特丁硫磷 terbufos，三氯杀螨醇 dicofol，杀扑磷 methidathion高毒
High toxicity 甲磺隆 metsulfuron-methyl，氯磺隆 chlorsulfuron，胺苯磺隆 ethametsulfuron-methyl长残效期、强灭生性
Long residual period, strong extinction 溴甲烷 bromomethane消耗臭氧层物质
Ozone depleting substance 百草枯 paraquat对人畜毒害大无特效解药
No specific antidote for poisoning humans and animals 福美胂 asomate，福美甲胂 monzet对人类和环境高风险
High risk to people and the environment 二溴氯丙烷 1,2-dibromo-3-chloropropane，杀虫脒 chlordimeform，二溴乙烷
1,2-dibromoethane，除草醚 nitrofen，敌枯双 2,4-dichloro-1-(4-nitrophenoxy)benzene致畸、致癌、生殖毒性
Teratogenic, carcinogenic, reproductive toxicity 2,4-滴丁酯 butyl 2,4-dichlorophenoxyacetate环境危害大、高挥发性
Environmental hazards, high volatile

表 2 我国20种限制使用农药[3]

Table 2. The 20 restricted pesticides in China[3]

农药
Pesticides 限用范围
Restricted range 限用原因
Restricted reason 甲拌磷 phorate，甲基异柳磷 isofenphos-methyl，克百威 carbofuran，水胺硫磷 isocarbophos，氧乐果 omethoate，灭多威 methomyl，涕灭威 aldicarb，灭线磷 ethoprophos 禁止在蔬菜、瓜果、茶叶、菌类、中草药材上使用，禁止用于防治卫生害虫，禁止用于水生植物的病虫害防治
It is prohibited to use it on vegetables, melons and fruits, tea leaves, fungi and Chinese herbs, to prevent and control sanitary pests, and to prevent and control pests and diseases of aquatic plants 高毒
High toxicity 甲拌磷 phorate，甲基异柳磷 isofenphos-methyl，克百威 carbofuran 禁止在甘蔗作物上使用
Prohibit use on crops 高毒
High toxicity 内吸磷 systox，硫环磷 phosfolan，氯唑磷 isazofos 禁止在蔬菜、瓜果、茶叶、中草药材上使用
Prohibit use on vegetables, melons, tea and Chinese herbs 高毒
High toxicity 氟虫腈 fipronil 禁止在所有农作物上使用 (玉米等部分旱田种子包衣除外)
Prohibit use on all crops (except for some dry field seed coating such as corn) 高毒
High toxicity 氰戊菊酯 fenvalerate 禁止在茶叶上使用
Prohibit use on tea 高毒
High toxicity 氟苯虫酰胺 flubendiamide 禁止在水稻上使用
Prohibit use on rice 高毒
High toxicity 丁酰肼 (比久) daminozide 禁止在花生上使用
Prohibit use on peanuts 高毒
High toxicity 毒死蜱 chlorpyrifos，三唑磷 triazophos 禁止在蔬菜上使用
Prohibit use on vegetables 高毒
High toxicity 丁硫克百威 carbosulfan，乐果 dimethoate 禁止在蔬菜、瓜果、茶叶、菌类和中草药材上使用
Prohibit use on vegetables, melons, tea leaves, fungi and Chinese herbs 高毒
High toxicity 乙酰甲胺磷 acephate 禁止在蔬菜、瓜果、茶叶、菌类和中草药材上使用
Prohibit use on vegetables, melons, tea leaves, fungi and Chinese herbs 剧毒、高毒
High toxicity

有机氯类农药曾经是使用量最大的杀虫剂，被广泛应用于世界各国，但其大多不易挥发、脂溶性强、在生物体内代谢缓慢、可通过生物链富集和食物链传递而危害生物，因此被逐渐禁止使用。例如，在世界范围内造成了持久污染的滴滴涕和六六六；在动植物中，艾氏剂可代谢为狄氏剂[4]，从而更耐生物降解；三氯杀螨醇对野生动物和人类有雌激素效应等[5]。目前，我国有机氯类禁止使用的农药有滴滴涕、三氯杀螨醇、艾氏剂、狄氏剂、硫丹、六六六、毒杀芬、二氯溴丙烷和林丹9种，尚无限制使用的农药[3]。这些农药理化性质稳定，大多可以转换并在环境中长时间存在，较难降解，有极高的生物积累能力和毒性作用，极易通过食物链在生物体组织内富集。有机氯类禁限用农药能够引起神经毒性、生殖毒性以及会致畸、致癌和致突变等[6]，即使浓度很低时也会损害生命健康，并导致激素依赖性癌症，因而有机氯类禁限用农药给人类、动植物以及生态环境造成的影响不容忽视[7]。虽然一些有机氯农药已经被禁止或限制生产长达40多年，但由于20世纪此类农药的大量生产和使用，致使当前在大气、土壤、水体等环境介质中仍能检出其残留，甚至食品中关于有机氯禁限用农药残留超标也时有报道[8]，如滴滴涕在停止使用40多年后还能在环境和食物中检出[9]。

受食品安全问题影响，欧美等发达国家提高了食品质量安全进口门槛，并针对有机氯等多类禁限用农药残留问题对我国农产品亮起了红灯。因此，严格制定有机氯类禁限用农药相关的法律法规和检测标准，建立有效且有实际应用价值的残留检测方法，是十分有必要的。目前，有关有机氯类禁限用农药残留的检测方法主要集中在仪器分析方面[10-11]，但仪器分析存在一定的局限性，例如仪器昂贵、操作复杂、不适合大批量样品快速测定等，而免疫分析方法具有低成本、易操作、灵敏度高、样品容量大、适合现场快检等优势，在有机氯类禁限用农药残留检测方面具有广阔的应用前景。目前还没有关于有机氯类禁限用农药免疫分析方面的综述。

1 有机氯类禁限用农药抗原的合成和抗体的制备

有机氯类禁限用农药的分子质量小于1000 Da，属于小分子物质。小分子物质能与对应抗体结合，但不能单独激发机体产生针对该小分子物质的抗体，即它只有反应原性，不具免疫原性，因此需要与大分子物质结合成为完全抗原。小分子需要在保留其特殊结构的前提下，对化学结构进行适当地修饰和改造，设计合成出半抗原[12]。半抗原再与蛋白等大分子载体偶联形成抗原决定簇，进而可以刺激机体产生相应的抗体。常用的偶联蛋白包括牛血清白蛋白 (bovine serum albumin, BSA)、卵清蛋白 (ovalbumin, OVA) 以及钥孔血蓝蛋白 (keyhole limpet hemocyanin, KLH) 等。

目前已制备出抗体的有机氯类禁限用农药包括硫丹[13-14, 25-26]、狄氏剂[15, 23]、三氯杀螨醇[16-18, 24]、滴滴涕[19-22] 以及艾氏剂[23]，而有关六六六、毒杀芬、二氯溴丙烷和林丹抗体的制备尚未见报道。表3列出了有机氯类禁限用农药半抗原设计现状。

表 3 有机氯类禁限用农药半抗原设计现状

Table 3. Present situation of hapten design for banned and restricted organochlorine pesticides

针对以环戊二烯为骨架的有机氯类禁限用农药艾氏剂、狄氏剂和硫丹，设计半抗原时一般需保留其六氯环戊二烯特异性结构且保证充分暴露，在非特异性结构处引入羧基、氨基或者羟基等易与大分子蛋白质反应的基团，有利于提高机体产生特异性抗体几率。张彩芹[13]选择与硫丹具有相似结构的硫丹醇为原料，采用琥珀酸酐法将其衍生化后引入羧基，再采用活泼酯法与蛋白质偶联制备出免疫原和包被原，并通过免疫小鼠制备出了硫丹的单克隆抗体。Manclús 等[14]通过六氯环戊二烯和特定烯烃的Diels-Alder加成反应，将烯烃末端引入一个用于蛋白质偶联的羧基，设计并合成了一种用于检测有机氯农药环二烯基团的半抗原。此后，Kataoka 等[15]用该半抗原通过羟基琥珀酰亚胺 (NHS) 活泼酯法偶联蛋白后免疫小鼠获得3种单克隆抗体，可以定量测定狄氏剂。

针对以苯为骨架的有机氯类禁限用农药三氯杀螨醇和DDT，设计半抗原时主要有两种思路：一种是以连接两个芳环的碳原子作为衍生位点，引入具有活性基团的连接臂；另一种是在苯环上引入具有一定间隔臂的活性基团。Liu 等[16]在三氯杀螨醇连接两个芳环的碳原子上的羟基端引入羧基，然后通过羧基与载体蛋白偶联，该方法虽然简单易行，但阻挡了三氯杀螨醇特征结构的暴露，导致得到的抗体特异性低，甚至对特征部位不识别。Liu等[16]和Hongsibsong等[17]通对三氯杀螨醇中的 -CCl3基团进行改造，设计并合成了不含有 -CCl3基团的半抗原，其也能产生识别三氯杀螨醇的抗体。杨琳芬等[18]在离三氯杀螨醇的特征结构较远处的苯环上引入羧基，制备得到的半抗原最大程度地暴露出三氯杀螨醇独有的结构，为制备特异性强、灵敏度高的三氯杀螨醇抗体奠定了基础。Abad 等[19]利用上述两种思路制备了5种DDT半抗原，其中通过苯环衍生的半抗原所制备的免疫原，既能筛选得到特异性针对DDT的单克隆抗体，又能筛选得到识别DDT及其类似物的广谱性单克隆抗体。

目前，针对DDT、三氯杀螨醇和硫丹已经制备出了多种半抗原，而从制备出的抗体效果来看，只有尽量保持了目标分子的特征结构，并具有一定长度间隔臂的半抗原，所制备出的抗体才能具有高的灵敏度和特异性。

2 有机氯类禁限用农药抗体的应用

检测有机氯类禁限用农药的免疫分析方法主要包括酶联免疫分析法、免疫层析试纸条法、化学发光法、荧光免疫分析法和免疫传感器等。

2.1 酶联免疫分析法

酶联免疫分析法（ELISA）是各种免疫分析方法中最通用的一种，通过被酶标记的抗原或抗体检测抗原抗体相互作用产生的复合物，其中酶的催化对底物的颜色变化具有放大作用，使抗原抗体的相互作用可视化[27]。禁限用农药属于小分子化合物，检测时主要采用的是间接竞争酶联免疫分析方法 (indirect competitive enzyme linked immunosorbent assay, icELISA)。

董玉华等[28]制备了抗DDT 的多克隆抗体，并采用icELISA方法测定了海水和海洋贝类样品中的DDT及其主要代谢产物的含量，DDT的检出限为25 ng/mL，其在贝类样品中的回收率为94%~100%之间，在海水样品中的回收率为88%。丁园等[29]制备了DDT和硫丹的单克隆抗体并分别建立了其icELISA。结果表明，其对DDT和硫丹的IC50值分别为10.72 ng/mL和9.69 ng/mL，检出限分别为1.85 ng/mL和2.19 ng/mL。利用该方法测定稻田水、土壤、苹果和香蕉样品中DDT和硫丹的残留量，其平均添加回收率分别为71%~93%和74%~97%，检测结果与采用气相色谱 (GC) 以及高效液相色谱 (HPLC) 分析的结果相一致。杨星星等[22]制备了新型抗DDT的单克隆抗体并建立了其icELISA，方法的 IC50值为61.1 ng/mL，线性范围 (IC20~IC80) 为6. 6~521.8 ng/mL。

Hirano 等[21]根据制备出的抗DDT多克隆抗体建立了直接竞争酶联免疫分析法 (direct competitive enzyme linked immunosorbent assay, dcELISA)，该方法的定量限为0.41 ng/mL，检出限为0.137 ng/mL。Wigfield 等[30]开发了苹果、番茄和生菜中硫丹、狄试剂等有机氯农药残留的ELISA免疫检测试剂盒，检出限为0.01~0.03 mg/L。张骏等[31]制备出了抗硫丹的多克隆抗体并建立了其dcELISA，硫丹在葡萄、胡萝卜、菠菜和茶叶中的平均添加回收率为83%~112%，与GC结果均呈现良好的线性关系。Wang 等[26]开发出两种用于检测农产品中硫丹的dcELISA：一种是基于微孔板的实验室测定法，另一种是基于聚苯乙烯管的现场测定法。微孔板格式的检出限为 (0.8 ± 0.1) g/kg，管格式的检出限为 (1.6 ± 0.2) g/kg。硫丹在葡萄、胡萝卜、菠菜和烟草中的平均添加回收率为76%~112%，该结果与GC分析的结果一致。

盛相国[32]通过制备出的抗三氯杀螨醇单克隆抗体建立icELISA，方法IC50值为1.38 ng/mL，在水样中的添加回收率为90%~108%。Smith 等[23]根据制备出的多克隆抗体建立了检测牛奶中艾氏剂和狄氏剂的间接非竞争ELISA (indirect noncompetitive enzyme linked immunosorbent assay, incELISA)，检测范围为1~5 μg/mL。Kataoka 等[15]筛选出3种新的单克隆抗体并建立其icELISA，分别定量测定狄氏剂和七氯混合物中狄氏剂和七氯的含量，发现单抗DrA-04对狄氏剂具有较高的反应性，对七氯的交叉反应性约为20%，添加回收率为88%~125%。

酶联免疫分析法已被证明是一种能及时分析大量样本的有效方法，作为免疫分析方法中最基础、应用最广泛的方法，同时也存在灵敏度不够高、过程耗时、易受自身抗体干扰而产生假阳性等缺点。因此，今后的研究应着眼于：合理制备抗原，筛选高灵敏度和特异性抗体；开发稳定、灵敏的酶标记；构建多信号的识别体系，解决单信号偶然误差导致假阳性/阴性结果的问题；结合聚合酶链式反应 (PCR)、表面增强拉曼散射、电化学和光热效应等新技术来提高酶联免疫分析法检测农药的性能。

2.2 免疫层析试纸条法

免疫层析试纸条 (immunochromatographic test strip, ITS) 是以膜为固相，基于吸水垫的毛细管虹吸效应将抗原抗体特异性识别应用于试纸条上的免疫技术，也称为横向流动免疫分析 (lateral flow immunoassays, LFIA) [33]。

Liu 等[16]基于抗三氯杀螨醇的单克隆抗体制备了用于检测水果和蔬菜中三氯杀螨醇残留的胶体金免疫层析试纸条，检出限为3.142 ng/mL。采用该方法用肉眼检测苹果和黄瓜样品中三氯杀螨醇的可见检出限为50 ng/g，截止值为500 ng/g。万宇平等[34]研制出一种能够检测蔬菜、水果、饲料和牛奶中DDT含量的胶体金免疫层析试纸条，检出限为5 μg/kg，检测时间为15 min，假阳性率和假阴性率均为零，可用于基层实验室的大批量样本检测。杨琳芬等[18]建立了检测水果中三氯杀螨醇残留的胶体金免疫层析方法，检出限为1.0 mg/kg，重复性较好，检测速度快，从制样到得出结果仅需15 min。周嘉明等[24]开发了一种胶体金免疫层析试纸条，对茶叶中三氯杀螨醇检出限为0.2 mg/kg，检测时间8 min。Kranthi 等[35]基于多克隆抗体开发了可用于检测硫丹和拟除虫菊酯的LFIA试剂盒，与硫丹竞争抑制IC99值为2378 μg/L。周兴华等[36]基于抗硫丹单克隆抗体开发了一种快速检测硫丹的胶体金免疫层析试纸条，检出限为40 ng/g。

随着研究的深入，免疫层析试纸条结合金纳米颗粒 (AuNPs) 和磁纳米颗粒 (MNP) 等材料已经成为研究热点，它们的结合可以显著提高检测的灵敏度和特异性。Lisa 等[37]建立了以AuNPs为基础的试纸竞争免疫分析法，用于DDT的纳米级检测，DDT显色强度与DDT浓度成反比。在优化条件下，DDT的检出限为27 ng/mL，在葡萄、芒果汁、牛奶和花椰菜中的添加回收率为87%~94%。

LFIA是免疫分析方法中用于广泛筛查和现场即时筛查最理想的检测方法，具有简单、快速、携带方便、容易投入大批量生产、货架期稳定等优点。但在实际检测中有一定的局限性：检测灵敏度有限、无法精确界定和量化；通常只能检出一种靶标化合物，仅适用于对样品的初筛；在实际操作中较易出现假阳性等。因此，今后的研究应着眼于：提高LFIA的检测灵敏度，实现免疫定量分析；开发多残留免疫层析检测系统；结合其他方法或利用信号放大系统实现多信号识别，提高准确性；将快速检测与便携式记录设备相结合等。

2.3 化学发光法

化学发光酶联免疫分析方法 (chemiluminescence enzyme-linked immunosorbent assay, CL ELISA) 是将化学发光信号扩增技术与特异性的免疫分析法相结合，通过催化发光底物产生荧光信号，从而实现定量检测。基于化学发光的免疫分析方法由于具有信号增强作用，其检测灵敏度优于酶联免疫分析法，医学检测和环境监测等领域中发挥着重要作用，且该方法对小分子分析物的检测也非常灵敏，已成为农药检测中的一种常用工具[38]。

Baker 等[39]基于化学发光法研制出DDT检测简易浸出棒，可用于农业和其他来源DDT的灵敏检测。该方法的检出限为0.05 ng/mL，在葡萄、芒果汁、牛奶和花椰菜中的添加回收率为81%~96%，与GC法分析的结果一致。该方法还可以在没有实验室或设备较差的实验室中进行，适用于现场检测。Deepak 等[40]基于制备出的抗硫丹鸡卵黄抗体 (IgY) 建立了CL ELISA分析方法，并将其与比色法进行了对比。结果发现CL ELISA分析方法的灵敏度高于比色法，α-、β-硫丹在14种食品样品中的平均添加回收率为81%~96%，检出限分别为100 μg/mL和5 fg/mL。

CL ELISA的研究和应用在包括农药残留在内的多个分析领域越来越受欢迎，今后可以通过改进化学增强剂和发光剂、开发新型催化剂来优化化学发光系统；并联合其他技术，如分子印迹技术等提高检测的特异性和灵敏度，实现多残留分析或自动化检测等。

2.4 荧光免疫分析法

荧光免疫分析法 (fluorescence immunoassay, FIA) 是在抗原抗体特异性反应的基础上，将高灵敏度的荧光信号用于抗原或抗体的分析检测。目前，在禁限用农药残留的检测中常用的荧光标记物有荧光素、量子点和荧光纳米颗粒等，新型的荧光材料和荧光探针也不断被开发和应用于免疫分析[41]。常与LFIA结合来改进信号读出方式。

Pan 等[42]通过静电力成功构建了一种基于谷胱甘肽包封的Au-Ag双金属纳米簇 (Au-Ag NCs) 和聚乙烯亚胺修饰的金纳米颗粒 (PEI-Au NPs) 的双模型比色/荧光免疫探针，并应用于icELISA和LFIA检测三氯杀螨醇。在icELISA方法中，荧光信号的引入显著提高了检测的灵敏度，检出限可达到0.62 ng/mL。

FIA被认为是一种能在短时间内同时检测不同农药的可靠、稳定的筛选方法，具有灵敏度高、检测范围宽、样品干扰少、信号强度大、适合于自动检测、可实现多重检测等特点。但也有一定的局限性，样品制备步骤繁琐，若样品着色会干扰最终的荧光发射；信号放大潜力和稳定性有待提高；少数荧光染液具有毒性等。因此，今后的研究应着眼于：选择具有合适发射峰、低背景信号、长荧光寿命和高量子产率的荧光标记物，如镧系螯合物等；引入两种或两种以上的标记物，改进标记技术和简化分离工艺；开发稳定性好、低毒、灵敏度高的荧光染料用于农药检测。

2.5 免疫传感器

免疫传感器 (immunosensor) 是一种将免疫检测技术和传感技术相结合的免疫分析技术。免疫传感器基于抗体的敏感和特异性作为传感元件，将抗原与抗体的结合转换为可读的信号，从而达到识别和捕获目标分析物的目的[43]。借助传感器信号放大的作用，免疫分析的灵敏度和特异性也随之提高。免疫传感器正向着便携化、自动化、省时化、可重复使用以及能实现在线检测的方向发展。

Cervera-Chiner 等[44]研制了基于高频石英晶体微天平 (HFF-QCM) 的压电免疫传感器，用于蜂蜜中DDT的检测，检出限为0.24 μg/L，在蜂蜜样品中检出限为24 μg/kg，添加回收率为94%~130%。Alvarez 等[45]开发了一种通过测量由不同表面应力产生的微悬臂梁的纳米级弯曲来检测DDT的方法，用巯基自组装单分子膜将DDT与牛血清白蛋白 (BSA) 的偶联物共价固定在悬臂的镀金一侧，然后将悬臂暴露于单克隆抗体和DDT的混合溶液中进行竞争性反应，最后通过测量由表面应力产生的微悬臂梁的纳米级弯曲改变测定样品中DDT的含量。Liu 等[46]建立了检测水中硫丹的电化学免疫传感器，在0.01~20 ng/mL范围内电流与硫丹浓度之间存在线性关系，检出限为0.01 ng/mL，在3种环境水样中的添加回收率分别为79%、85%和93%。

免疫传感器作为新技术在检测应用中受到广泛关注, 具有广阔的应用前景。相比于其他免疫分析方法具有更高的灵敏度、更强的特异性、信号强度大、检测时间短等优势。但在应用时也存在背景干扰大、稳定性和重现性较差、读取数据时需要借助于大型仪器等不足之处。因此，今后的研究应着眼于：结合适配体等新技术，取代传统抗原抗体特异性结合的模式；结合纳米材料 (如纳米金、量子点和碳材料等) 用于增加抗体表面修饰的信号探针数量，从而放大信号和提高灵敏度；将智能手机和数据存储等人工智能技术集成到免疫传感器中，实现自动化检测等。

有机氯类禁限用农药抗体的应用现状见表4。

表 4 有机氯类禁限用农药抗体的应用现状

Table 4. Present situation of antibody application for banned and restricted organochlorine pesticides

农药
Pesticide基质
Matrix检测方法
Detection method抗体类型
Antibody type灵敏度
Sensitivity文献来源
References 滴滴涕
DDT 蜂蜜
Honey Immunosensor MAb IC50值为 1.94 µg/L，方法的检出限为 0.24 µg/L，实际样品中检出限为 24 µg/kg
The IC50 value was 1.94 µg/L, the detection limit of the method was 0.24 µg/L, and the detection limit of the actual sample was 24 µg/kg [44] — Immunosensor MAb — [45] 水
Water Immunosensor MAb IC50值最低为 0.44 µg/L
The minimum IC50 value was 0.44 µg/L [47]滴滴涕
DDT 海水、海洋贝类
Sea water, marine shellfish ic-ELISA PAb 检出限为 25 ng/mL
The detection limit was 25 ng/mL [28] 葡萄、芒果、牛奶、花椰菜
Grapes, mangoes, milk, broccoli ITS IgY 检出限为 27 ng/mL
The detection limit was 27 ng/mL [37] 水、葡萄、芒果、牛奶、花椰菜
Water, grapes, mangoes, milk, broccoli CL-ELISA, ITS IgY 线性范围为 0.05~1 ng/mL，检出限为 0.05 ng/mL
The linear range was 0.05-1 ng/mL, and the detection limit was 0.05 ng /mL [39] 白菜、苹果、饲料、牛奶
Cabbage, apples, feed, milk ITS MAb 检出限为 5 µg/kg
The detection limit was 5 µg/kg [31] 稻田水、土壤、苹果、香蕉
Rice paddy water, soil, apples, bananas ic-ELISA MAb IC50值为 10.72 ng/mL
The IC50 value was 10.72 ng/mL [29] 鲤鱼
Carp dc-ELISA PAb 定量限为 0.41 ng/mL，检出限为 0.137 ng/mLThe quantification limit was 0.41 ng/mL and the detection limit was 0.137 ng/mL. [21] — ic-ELISA MAb IC50 值为 61.1 ng/mL
The IC50 value was 61.1 ng/mL [22] 三氯杀螨醇
dicofol 水
Water ic-ELISA MAb IC50 值为1.38 ng/mL
The IC50 value was 1.38 ng/mL [32] 苹果、黄瓜
Apples and cucumbers ITS MAb 检出限为 3.142 ng/mL
The detection limit was 3.142 ng/mL [16] 蔬菜、水果
Vegetables and fruits ic-ELISA MAb IC50 值为 0.28 µg/mL
The IC50 value was 0.28 µg/mL [17] 苹果
Apples ITS MAb 检出限为1.0 mg/kg
The detection limit was 1.0 mg/kg [18] 茶叶
Tea ITS MAb 检出限为 0.2 mg/kg
The detection limit was 0.2 mg/kg [24] 茶叶
Tea ITS, Immunosensor MAb 定量限为 1.59 ng/mL
The limit of quantification was 1.59 ng/mL [42] 艾氏剂
aldrin 牛奶
Milk ic-ELISA PAb 检测范围为1 ng/mL~5 µg/mL
The detection range was 1 ng/mL-5 µg/mL [23] 狄氏剂
dieldrin 牛奶
Milk ic-ELISA PAb 检测范围为 1 ng/mL~5 µg/mL
The detection range was 1 ng/mL-5 µg/mL [23] 土壤
Soil ic-ELISA MAb IC50值为 2.32 ng/mL
The IC50 value was 2.32 ng/mL [15] 硫丹
endosulfan 稻田水、土壤、苹果、香蕉
Rice paddy water, soil, apples, bananas ic-ELISA MAb IC50值为 1.85 ng/mL
The IC50 value was 1.85 ng/mL [29] — ITS PAb IC99值为 2378 µg/mL
The IC99 value was 2378 µg/mL [35] 蔬菜、水果
Vegetables and fruits CL-ELISA IgY 检出限为 100 µg/mL~5 fg/mL
The detection limit was 100 µg/mL-5 fg/ mL [40] 葡萄、胡萝卜、菠菜、茶叶
Grapes, carrots, spinach, tea dc-ELISA PAb 检出限为 0.8 ± 0.1 µg/kg
The detection limit was 0.8 ± 0.1 µg/kg [31] 水
Water Immunosensor MAb 检出限为 0.01 µg/L
The detection limit was 0.01 µg/L [46] 梨
Pear ITS MAb 检出限为 40 ng/g，icELISA方法IC50值为 5.16 ng/mL
The limit of detection was 40 ng/g, and the IC50 value of icELISA method was 5.16 ng/mL [13] 水、土壤
Water, soil dc-ELISA PAb 检出限为0.2 µg/L
The detection limit was 0.2 µg/L [25] 葡萄、胡萝卜、菠菜、烟草
Grapes, carrots, spinach, tobacco dc-ELISA PAb 孔板格式的检出限为 0.8 ± 0.1 µg/kg，管格式的检出限为 1.6 ± 0.2 µg/kg
Detection limits were 0.8 ± 0.1 µg/kg for orifice format and 1.6 ± 0.2 µg/kg for tube format [26] 目前暂无抗体合成以及抗体应用的农药：六六六、二氯溴丙烷、林丹、毒杀芬
At present, there is no antibody synthesis and antibody application of pesticides including hexachlorocyclohexane, 1,2-dibromo-3-chloropropane, lindane, and toxaphene注：MAb 表示单克隆抗体；PAb 表示多克隆抗体；IgY 表示鸡卵黄免疫球蛋白；—表示暂未见报道。Note: MAb stands for monoclonal antibody; PAb stands for polyclonal antibody; IgY stands for chicken yolk immunoglobulin; — Indicates no report.

3 结论与展望

做好食品中有机氯类禁限用农药残留的检测，对于保障食品安全、打破食品出口技术壁垒具有十分重要的作用。随着免疫分析技术的发展，免疫分析方法在有机氯类禁限用农药检测方面的应用不断得到扩展，三氯杀螨醇等免疫检测方法已经实现商品化，极大提高了禁限用农药筛查的效率。表5比较了有机氯类禁限用农药免疫分析方法的特点及适用范围。

表 5 有机氯类禁限用农药免疫分析方法的特点及适用范围

Table 5. Characteristics and application scope of banned and restricted organochlorine pesticides immunoassay

免疫分析方法
Immunoassay method特点
Advantages适用范围
Scope of application 酶联免疫分析法
ELISA 准确稳定、适合大批量样本检测
Accurate and stable, suitable for mass sample detection 广泛通用、基础检测
Widely used, basic testing 免疫层析试纸条法
ITS 简单快速、携带方便、容易投入大批量生产、货架期稳定
Simple and fast, easy to carry, easy to put into mass production, stable shelf life 广泛筛查、现场即时筛查、初筛快速定性及半定量
Extensive screening, on-site instant screening, rapid qualitative and semi-quantitative preliminary screening
化学发光法
CL ELISA 特异性强、灵敏度高、背景干扰小、结果稳定、标记物较安全
High specificity, high sensitivity, low background interference, stable results and safe markers 短时间内准确检测
Accurate detection in short time 荧光免疫分析法
FIA 灵敏度高、检测范围宽、样品干扰少、信号强度大
High sensitivity, wide detection range, less sample interference, high signal strength 多重检测
Multiple detection 免疫传感器
Immunosensor 更高的灵敏度、更强的特异性、信号强度大
Higher sensitivity, greater specificity, higher signal strength 灵敏度要求更高的检测
Detection requires higher sensitivity

然而，有机氯类禁限用农药免疫分析技术与其他农药免疫检测方法一样，在半抗原结构的合理性，抗体的灵敏度、特异性以及稳定性，检测方法的快速、便捷、直观以及重现性和准确度等方面还存在着一些局限性和阻碍。

在半抗原设计上，有机氯类禁限用农药结构相似性极高，容易产生交叉反应，这种交叉反应既有优点也有缺陷。优点是可以利用交叉反应，通过一种抗体对大多有机氯类禁限用农药进行同时筛查，但交叉反应的缺点也很明显，利用一种抗体无法具体测定样品中某一种有机氯类禁限用农药。这就要求针对单一农药设计半抗原时，应在保留特征结构的同时又突出其与其他农药结构的不同来解决交叉反应的问题。

在抗体制备方面，有机氯类禁限用农药抗体主要是兔多克隆抗体和鼠单克隆抗体，还有少数鸡卵黄免疫球蛋白。这些传统的抗体制备方法存在制备周期长、抗体稳定性差、批次间差异大等缺点，而近年来基因工程抗体、纳米抗体和仿生抗体等新型抗体制备技术发展迅速，具有很好的应用前景，可以作为有机氯类禁限用农药抗体研究的一个方向。

在有机氯类禁限用农药抗体的应用上，新型免疫分析方法弥补了传统免疫分析方法的诸多不足但也存在局限性。例如，免疫层析试纸条法的灵敏度和精确度有待进一步提高；免疫传感器的背景干扰、稳定性和重现性有待解决；化学发光免疫分析法所需测定仪器体积较大，发光的峰值衰减快、本底较高、存在背景干扰；荧光免疫分析法需要特殊的设备对荧光信号进行定性和定量检测等。

因此，未来有机氯类禁限用农药免疫分析方法的研究应集中在以下几个方面：

1) 设计新型有机氯类禁限用农药半抗原，制备出特异性好、灵敏度高的抗体。

2) 基于纳米抗体、基因工程抗体、仿生抗体等技术，提高有机氯类禁限用农药抗体的稳定性。

3) 结合纳米材料、传感器等新材料和方法，开发灵敏度高、准确性好的有机氯类禁限用农药多残留的免疫检测方法，如生物条形码检测技术。

4) 基于微型化技术，将检测设备小型化、便携化，在降低检测成本的同时，推进小型化设备的商业化。

5) 将免疫检测方法与云计算、大数据、人工智能等相关的新兴技术结合，实现对农产品全产业链中禁限用农药的智能化和数字化监测。