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一种鉴定绣球不同品种叶斑病抗性的方法

花匠小妙招
2024-11-30 21:12

一种鉴定绣球不同品种叶斑病抗性的方法

1.本发明属于植物品种抗病性鉴定技术领域，具体涉及一种鉴定绣球不同品种叶斑病抗性的方法和应用。

背景技术：

2.绣球品种繁多、株型优美、花期较长、应用广泛，极具观赏价值、生态价值和经济价值，不仅能用于园林绿化和家庭美化，还可作为盆花、鲜切花、插花、干花及药用植物，被誉为世界三大花园植物之一，也是世界五大鲜切花之一，在花卉产业中占有重要地位。然而，在绣球的生长中，其叶片对植物病原体的侵染非常敏感，极易发生叶斑病。绣球叶斑病发生时，叶片会呈现出圆形或近圆形的叶斑，严重时出现叶片干燥、萎蔫，甚至整株死亡的现象，这在很大程度上影响了绣球的生长及产品质量。
3.目前，研究表明，棒孢菌(corynespora cassiicola)，尾孢菌(cercosospora spp.)，漆斑菌(myrothecium roridum)，围小丛壳菌(glomerella cingulata)，茎点霉菌(phoma exigua)，灰葡萄孢菌(botrytis cinerea)等病原菌均能引起绣球叶斑病的发生。其中，棒孢菌(c. cassiicola)占绣球叶斑病分离菌株的一半以上，是引起绣球叶斑病最主要的病原菌之一。棒孢菌分生孢子的典型形态呈半透明至深褐色的棒槌形或者长圆柱形，具有假膈膜，入侵叶片不需要伤口，可通过叶两面气孔自然侵入。此外，棒孢菌还可通过空气或雨水传播，寄主范围广，对不良环境的抵抗力强，能够以菌丝、厚垣孢子、分生孢子在土壤、种子、保护地的越冬植物上过冬。通常，由棒孢菌引起的叶斑病，被称为棒孢叶斑病。
4.棒孢叶斑病是一类常见的世界范围内的植物真菌病害，其极大地降低了绣球产品的观赏价值和经济价值。目前，关于绣球棒孢叶斑病的化学防控，尚无针对性强的特效药剂，常需要多种广谱药剂的大量轮换施用，不仅成本高，污染环境，而且使得病原菌的耐药性增强。同时，化学农药残留物也给人们带来的潜在的健康风险。而采用抗病品种进行生产，利用其自身的抗性进行防控是防治绣球棒孢叶斑病最为经济有效的方法，因此，亟需对绣球进行抗病性鉴定及抗病种质资源筛选。然而，目前尚无绣球种质资源叶斑病抗性鉴定的报道，只有一些自然条件下绣球叶斑病病情比较的研究，但存在周期长、结果不够精确等缺点。因此，亟需发明一种简便的非自然条件下对绣球不同品种叶斑病抗性进行精准鉴定的方法。

技术实现要素：

5.针对现有技术中存在不足，本发明提供了一种鉴定绣球不同品种叶斑病抗性的方法。本发明中，通过分离出强致病力菌株并采用菌块贴接离体叶片的方法对绣球叶斑病抗性进行鉴定，为绣球叶斑病的抗性鉴定和绣球叶斑病的抗性育种工作奠定了基础。
6.本发明提供了一种鉴定绣球不同品种叶斑病抗性的方法，具体包括如下步骤：
7.(1)观察绣球叶斑病发病症状并采集发病材料：
8.观察绣球叶斑病的病害的部位、病斑形状、颜色等，并采集叶斑病发病严重的叶
片。
9.进一步的，步骤(1)中所述绣球叶斑病的发病叶片初始时呈褪绿小点，逐渐形成圆形或近圆形叶斑，边缘呈灰紫色，病斑可连成一片。
10.(2)病原菌株的分离与纯化：
11.采用组织切块法，切取大小约为2mm
×
2mm的病健交界组织，分离病原菌，使用pda 培养基进行单孢纯化培养，得到叶斑病病原菌。
12.(3)强致病力病原菌株的筛选：
13.采集绣球品种
‘
无尽夏’从上到下第3～4叶位的健康离体叶片，冲洗、消毒，然后在不同离体叶片的叶面相同位置贴接步骤(2)中纯化培养得到的直径为5mm的各病原菌圆形菌块，接着在培养箱培养，观察叶片的发病情况并筛选出致病力最强的菌株。
14.进一步的，步骤(3)中所述冲洗为在自来水下流水冲洗30min；
15.步骤(3)中所述消毒的具体为：将叶片放入体积分数70％的酒精中消毒10s，再转入体积分数15％的过氧化氢(h2o2)中消毒15min，然后在无菌水中剧烈摇晃5min，重复上述消毒过程3次。
16.进一步的，步骤(3)中所述各病原菌均在pda培养基上活化5天；步骤(3)中所述菌块均取自各病原菌菌落外缘，且菌丝面与叶片正面紧密贴接。
17.进一步的，步骤(3)中培养箱中培养的条件为：先在28℃培养箱中黑暗培养48h；48h 后在28℃培养箱中16h光照、8h黑暗交替条件下培养13天；在接种后第0、5、10、15天观察并记录叶片的发病情况；根据叶片的发病情况筛选出致病力强的菌株。
18.其中，所述致病力最强的菌株为侵染同一品种新鲜健康的绣球离体叶片时发病最快且最严重的菌株。
19.(4)强致病力病原菌株的形态观察：
20.观察致病力强的菌株在pda培养基上的菌落形态，并使用光学显微镜观察病原菌菌丝和孢子的形态特征。
21.(5)强致病力病原菌株的分子鉴定：
22.使用真菌基因组dna提取试剂盒，提取步骤(3)中筛选出的致病力强的菌株基因组 dna，采用真菌通用引物对its1-f/its4-r来pcr扩增致病力强的菌株的its区，pcr产物送测序；测序结果采用ncbi-blast进行序列比对，并通过mega 5.05软件构建neighbor-joining系统进化树进行亲缘关系分析。
23.进一步的，步骤(5)中，扩增致病力强的菌株its区的引物对tis1-f/its4-r的序列为：
24.its1-f：5
’‑
cttggtcatttagaggaagtaa-3’(seq id no.1)，
25.its4-r：5
’‑
tcctccgcttattgatatgc-3’(seq id no.2)；
26.pcr扩增程序如下：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，共 35个循环，最后72℃延伸5min，10℃保存。
27.(6)强致病力病原菌株的贴接：
28.将步骤(3)中的强致病力病原菌株在pda培养基上活化培养5天，然后从菌落外缘取直径为5mm的圆形菌块，在清洗、消毒后的绣球不同品种新鲜健康的植株叶片同一位置贴接。
1、h-7和h-8-1为不同病原菌株侵染离体叶片。
44.图4为强致病力病原菌株h-3-1的形态观察图，图中a为菌落正面形态；b为菌落背面形态；c为菌丝形态；d为孢子形态，标尺：50μm。
45.图5为基于its基因序列菌株h-3-1的neighbor-joining系统发育树(mega 5.05)。
具体实施方式
46.下面结合附图以及具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。
47.下面实例中仅提供强致病力病原菌株的筛选方法，不对所用强致病力病原菌株进行具体限定，所述强致病力病原菌株指在同一批次中分离出的多个病原菌株中侵染离体叶片时发病最快且最严重的菌株，具有相对性。
48.实施例1：
49.(1)田间观察绣球叶斑病的发病症状并采集发病材料：
50.通过观察发现，叶斑病主要危害绣球叶片，全生长期均可发病，且老叶发病更为严重。如图1所示，发病叶片初始时呈褪绿小点，逐渐形成圆形或近圆形叶斑，边缘呈灰紫色，病斑可连成一片，采集叶斑病发病严重的植株叶片。
51.(2)病原菌株的分离与纯化：
52.采用组织切块法，切取大小约为2mm
×
2mm的病健交界组织，置于pda培养基(购自上海盛思生化科技有限公司)中进行病原菌的分离，并使用pda培养基进一步单孢纯化培养。具体方法如下：
53.用自来水冲洗采集的叶片，在超净工作台上剪取病健交界处的小块组织(约2mm
×
2 mm)，浸入70％的乙醇中消毒10s，再转入15％的过氧化氢(h2o2)中消毒15min，随后在无菌水中冲洗，并重复此消毒过程3次。然后将叶片置于灭过菌的滤纸上，吸干水分，接种于pda培养基上。将接种后的培养基置于28℃恒温培养箱中倒置培养2～3天，当培养基上植物材料周围出现小菌落时，在菌落边缘切取直径为5mm的小圆块，接种于新的pda培养基上，进一步挑单孢纯化培养。纯化后，将菌株再次接种到新的pda平板培养基上备用。
54.图2为分离出的病原菌株在pda培养基上生长情况，从图中可以看出，绣球品种
‘
无尽夏’的叶斑病发病叶片组织中经过柯赫氏法则验证共分离得到5株叶斑病的病原菌株，分别为h-3-1、h-4、h-6-1、h-7和h-8-1。将这些菌株接种到pda平板培养基上，各菌落突起呈絮状，由大量孢子生成而呈粉质。其中，h-3-1和h-4菌落正面颜色呈灰色，h-6-1、h-7和 h-8-1菌落正面颜色呈白色。
55.(3)强致病力病原菌株的筛选：
56.取绣球相同品种、相同叶位、新鲜健康的叶片，置于自来水下流水冲洗20min，洗掉叶片表面的灰尘；将冲洗后的叶片放入体积分数70％的酒精中消毒10s，再转入体积分数15％的过氧化氢(h2o2)中消毒15min，然后在无菌水中剧烈摇晃5min，上述操作重复3次；待酒精挥发后，将叶片置入铺有两层湿润滤纸(无菌水润湿)的培养皿中；分别在叶面的相同位置贴接直径5mm、在pda培养基上活化5天的不同菌株的菌块，每种菌株接种10个叶片进行重复试验，并将同样大小的无菌pda培养基菌块置于健康叶片相同部位作空白对照。
57.将培养皿先放入28℃培养箱中进行黑暗培养48h，48h后置于28℃的培养箱中16h/
8h 光暗交替条件下培养13天。分别于第0、5、10、15天观察接种了不同菌株的叶片并记录其发病情况，根据叶片的发病情况筛选出致病力最强的菌株。
58.图3为分离出的病原菌株侵染绣球品种
‘
无尽夏’的离体叶片进行强致病力病原菌株的筛选。从图中可以看出，分别用菌株h-3-1、h-4、h-6-1、h-7和h-8-1侵染绣球
‘
无尽夏’的健康离体叶片10天时，病斑直径开始呈现出明显差异；侵染15天时，菌株h-3-1侵染离体叶片的病斑平均直径最大，为4.60cm，而其他4个菌株的叶片病斑平均直径分别只有2.75 cm、3.07cm、1.23cm和1.38cm，故h-3-1的致病力最强。
59.(4)强致病力病原菌株的形态观察：
60.观察筛选出的强致病力病原菌株在pda培养基上的菌落形态，并使用光学显微镜观察病原菌菌丝和孢子的形态特征。
61.图4为强致病力病原菌株h-3-1的形态观察，包括菌落正面形态(a)；菌落背面形态(b)；菌丝形态(c)；孢子形态(d)，标尺：50μm。从图中可以看出，绣球叶斑病强致病力菌株 h-3-1的菌落在pda平板培养基正面呈灰褐色，突起絮状，由大量孢子生成而呈粉质(图4a)；菌落背面呈浅黄至黄褐色(图4b)。在显微镜下观察，可见菌丝致密、有分枝(图4c)；分生孢子形态呈圆柱形或倒棍棒形，半透明至浅褐色，具有假隔膜(图4d)。故从形态学特征的角度，绣球叶斑病强致病力菌株h-3-1符合棒孢属(corynespora spp.)菌株特征。
62.(5)强致病力病原菌株的分子鉴定：
63.使用真菌基因组dna提取试剂盒提取上述棒孢叶斑病菌h-3-1的基因组dna，然后用真菌通用引物对its1-f/its4-r来pcr扩增h-3-1的its区。
64.其中its1-f的序列为：5
’‑
cttggtcatttagaggaagtaa-3’(seq id no.1)，its4-r 的序列为：5
’‑
tcctccgcttattgatatgc-3’(seq id no.2)；pcr扩增程序如下：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，共35个循环，最后72℃延伸5min，得到的pcr产物在10℃保存。
65.将上述得到的pcr产物测序，测序结果采用ncbi-blast进行序列比对，并通过mega 5.05软件构建neighbor-joining系统进化树进行亲缘关系分析，测序结果如seq id no.3所示，分析结果如图5所示。
66.seq id no.3：
67.gccgggatctactgatcgaggtcaaattctggtgtgggggggctcatggtgcgccg acccgcagccacttcagcgcttgctctgctgcgctcgtggcctgctgggaaccggccgc caatgcttttgaggcgagtccaggcgcgcggaggcgggacagacgcccaacaccaagc taggcttgagggttgaaatgacgctcgaacaggcatgccctaaggaataccaaagggc gcaatgtgcgttcaaagattcgatgattcactgaattctgcaattcacactacttatcgca tttcgctgcgttcttcatcgatgccagaaccaagagatccgttgttgaaagttgtaaata gtttgttttgttttgttcagacgtgtacttcttgtactgcaatgggtttgtggtgggtcc ccgttggcaggcgagcctgccgaggaaacgagaggtgctcataaacaaagggtgctat ctcgaagggggcgaggcccctacgataatgatccttccgcaggttcacctacggaaacc ttgttacgacttttacttcctcaa。
68.图5为基于its基因序列菌株h-3-1的neighbor-joining系统发育树(mega 5.05)。从图中可以看出，菌株h-3-1在系统发育树上与菌株corynespora cassiicola聚为一支，结合菌株形态特征，确定该菌株为多主棒孢菌(corynespora cassiicola)，将其命名为：h-3-1。
69.(6)强致病力病原菌株贴接不同品种的绣球：
70.将筛选并分离、鉴定完成的强致病力菌株接种到pda培养基上进行活化培养；采集不同品种、相同叶位、新鲜健康的绣球叶片，每个品种3个重复，采用步骤(3)中相同的清洗方法和表面消毒方法，然后将叶片置入铺有两层湿润滤纸(无菌水润湿)的培养皿中；在叶面的相同位置接种直径5mm，在pda培养基上活化5天的h-3-1的菌饼，将同样大小的无菌 pda培养基圆块置于健康叶片相同部位作对照。将培养皿并放入28℃培养箱中进行黑暗培养；48h后置于28℃的16h/8h光暗交替条件下培养；在接种后每天观察并记录叶片的发病情况。
71.结果显示，各绣球品种的离体叶片在人工接种棒孢叶斑病菌h-3-1第10天时，叶片的发病情况和病斑直径呈现出了明显的差异，其中，绣球品种
‘
海洋之心’、
‘
爱你的吻’、
‘
佳澄’和
‘
姑娘’的离体叶片对棒孢叶斑病菌h-3-1的侵染特别敏感，病斑直径比较大；而绣球品种
‘
蒂亚娜’、
‘
白色天使’、
‘
革命’、
‘
十字架’、
‘
爱莎’和
‘
你我的永恒’的离体叶片对棒孢叶斑病菌h-3-1的侵染具有抗性，病斑直径较小。
72.(7)绣球品种的叶斑病抗性鉴定：
73.接种第15天时测定离体叶片病斑面积和叶面积，根据病斑面积与叶面积的比值进行病情分级，并计算每个品种的病情指数(dsi)，根据dsi划分抗病评价等级，对不同绣球品种的叶斑病抗性进行分类与鉴定，
74.dsi(％)＝[∑(病害级别
×
该级病叶数)/(最高病害级别
×
接种总叶数)]
×
100。
[0075]
本实施例中病情分级标准、病情指数的抗病评价标准和不同绣球品种的叶斑病的发病情况及抗性评价如表1～3所示。
[0076]
表1.接种棒孢叶斑病菌15天病情分级标准
[0077][0078]
表2.病情指数的抗病评价标准
[0079][0080]
表3.不同绣球品种的叶斑病的发病情况及抗性评价
[0081][0082]
表3为24个绣球品种通过强致病力病原菌株贴接离体叶片法进行叶斑病抗性鉴定的结果，从表3可以看出根据病情指数将24个品种划分成了免疫(i)、抗病(r)、中感(ms)、高感(hs)四个类别。其中，有6个品种(占比25％)表现为抗病，分别是
‘
蒂亚娜’、
‘
白色天使’、
‘
革命’、
‘
十字架’、
‘
爱莎’和
‘
你我的永恒’；14个绣球品种(占比58.3％)为中感，代表品种有
‘
甜蜜幻想’、
‘
无尽夏’、
‘
含羞叶’等；
‘
海洋之心’、
‘
佳澄’、
‘
姑娘’、和
‘
爱你的吻’为4个高感品种(占比16.7％)。
[0083]
所述实施例为本发明的优选的实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员能够做出的任何显而易见的改进、替换
或变型均属于本发明的保护范围。