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2020诺贝尔化学奖花落CRISPR基因编辑，生物学又一次跨界大放异彩！

花匠小妙招
2024-11-30 21:12

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图片来源：www.businessinsider.com

2020年10月7日，诺贝尔化学奖揭晓。Emmanuelle Charpentier（埃马纽埃尔·卡彭蒂耶）和Jennifer A. Doudna（詹妮弗·杜德纳）获此殊荣，以表彰她们在“凭借开发基因组编辑方法”方面作出的贡献，两位获奖者将分享1000万瑞典克朗奖金（折合人民币约763万）。华裔科学家张锋憾失此奖，其原因可能他不被认为是CRISPR 的奠基者，而诺贝尔奖更倾向于颁给新技术领域的开创者。

上海交通大学医学院上海市免疫学研究所王颖认为，“能在这么短的时间里拿到诺贝尔奖，说明学界充分肯定这项技术，它从原创到应用已呈现出爆发性增长，未来将会给人类健康带来巨大变化。”王颖介绍，“基因剪刀”技术在很多领域都有商业应用价值，这一成果诞生之初就拥有专利，获得了巨额融资，堪称产学研结合的典范。

一、CRISPR的发展简史

关于这个技术，老编我也确实很震惊，想当年（2014年下半年），公司的大老板就跟我提及这个技术，不曾想到，这才6年多竟然直接就获得诺贝尔奖了...让我们来翻看一下关于CRISPR的发展史：

1987年，Nakata研究组偶然地发现大肠杆菌在位于iap的3’端存在含有29个碱基的高度同源序列重复性出现，且这些重复序列被含32个碱基的序列间隔开。

1989年-1999年，陆续有相关研究指出类似的重复序列存在于多种细菌及古生菌中。2000年，Mojica等人通过比对发现这种重复元件存在于20多种细菌及古生菌中，并将这种核酸序列命名为短规律性间隔重复序列（Short Regularly Spaced Repeats, SRSRs)，因其高度保守性，猜测其一定具有重要的生物学功能。

2002年，CRISPR一词正式登上历史舞台。Jansen实验室通过生物信息学分析发现，这种新型DNA序列家族只存在于细菌及古生菌中，而在真核生物及病毒中没有被发现，并将这种序列称为规律间隔成簇短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)。他们将临近CRISPR locus的基因命名为cas（CRISPR-associated），并发现了4个cas基因（cas1, cas2, cas3, cas4）。

2005年，Mojica，Bolotin和Pourcel三个研究组指出CRISPR中的间隔序列来自于外来噬菌体或质粒，其中Mojica实验室惊喜地发现病毒无法感染携带有与病毒同源间隔序列的细胞，而易侵入那些没有间隔序列的细胞，由此他们提出CRISPR可能参与细菌的免疫功能的假说。

2007年，CRISPR能在细菌的免疫功能中起作用首次得到实验证实。Horvath研究组发现嗜热链球菌被病毒入侵后整合了来自噬菌体基因组新的间隔区序列，同样的病毒再次入侵时细菌就有了抗性，使其免遭攻击。同时人为地去除或添加特定的间隔区序列，会影响细菌的抗性表型。因此，他们认为CRISPR及cas基因一起为嗜热链球菌提供了对噬菌体的抗性作用，同时抗性的特异性取决于CRISPR中的间隔区序列，细菌的这种免疫性是可以遗传的。至此，虽然科学家并不清楚CRISPR/Cas抵抗病毒的具体机制，但他们开始逐渐揭开其神秘的面纱。

2008年，Oost实验室揭示了宿主细胞中CRISPR的间隔序列如何在cas蛋白的协助下介导发挥抗病毒作用。他们发现在CRISPR转录后，cas蛋白会形成一个称为Cascade的复合物，裂解每个重复单元中的CRISPR RNA前体（pre-crRNA），但裂解产物都保留了间隔序列。在解旋酶cas3的作用下，成熟的CRISPR RNA(crRNA)发挥小向导RNA（small guide RNA）的角色，促使Cascade干预病毒的增殖。

2009年，Mojica团队指出前间隔序列临近的PAM序列为原核生物中CRISPR/Cas发挥免疫识别提供了靶标。

2011年，Charpentier研究组通过对人类病原体化脓性链球菌的差异化RNA测序，揭示了反式编码crRNA（tracrRNA）参与pre-crRNA的加工成熟过程。他们指出，tracrRNA通过24个核苷酸与pre-crRNA中的重复序列互补配对，在保守的内源性RNA酶III和CRISPR相关的Csn1蛋白的参与下指导pre-crRNA的成熟过程，这些组分对保护化脓性链球菌免受噬菌体DNA的入侵必不可少，研究揭示了crRNA成熟的新途径。

以上我们一直在介绍CRISPR/Cas的发现及细菌、古细菌如何利用该系统来沉默外来核酸以抵御病毒及质粒的入侵。

CRISPR/Cas作为基因编辑系统被应用最早开始于2012年两位女神（即此次的诺贝尔化学奖得主）的强强联合。她们通过体外实验证明：成熟的crRNA通过碱基互补配对与tracrRNA形成特殊的双链RNA结构，指导cas9蛋白在目标DNA上引起双链断裂。在与crRNA指导序列互补的位点，cas9蛋白的HNH核酸酶结构域切割crRNA的互补链，而cas9蛋白RuvC样结构域切割非互补链。当双tracrRNA：crRNA被嵌合到一条RNA时，同样可以指导cas9切割双链DNA。她们的研究证明，在双链RNA指导下切割双链DNA断裂的内切酶家族并揭示了CRISPR/Cas系统在RNA指导下进行基因编辑的巨大潜力。

CRISPR/Cas系统发现历程中的主要贡献者△

之后就一发不可收拾...

2013年初，两篇Science和一篇Cell文章，它们分别由来自于哈佛大学医学院的George Church、麻省理工学院博德研究所的张锋以及加州大学旧金山分校系统及合成生物学中心的Lei S. Qi（目前就职于斯坦福大学）实验室，这三篇文章都将CRISPR/Cas系统成功应用到哺乳动物细胞中。其中Church研究组设计了II型CRISPR/Cas系统，在人类细胞中设计特定的gRNA。对于内源性AAVS1基因座，他们成功获得了293T细胞中10％至25％，K562细胞中13％至8％以及诱导多能干细胞中2％至4％的靶向率。他们同时表明这个过程依赖于CRISPR组件，是特定的序列；在同时引入多个gRNA时，可以实现对目标基因座的多重编辑。张锋实验室证实了cas9可以在小RNA的指导下在人类及小鼠细胞中对内源基因座实现精确切割，同时他们将cas9改造为缺口酶促进同源修复。Qi与同事则将II型CRISPR/Cas系统中的cas9蛋白改造成失去核酸内切酶活性的dCas9，将其与gRNA共表达，产生一种DNA识别复合物使其特异性地干扰转录延伸，RNA聚合酶或转录因子与DNA的结合达到抑制目标基因表达的目的。他们将其称为CRISPRi，实现了对大肠杆菌中基因的有效抑制，且没有明显的脱靶效应。而且可以实现同时抑制多个基因，他们表明CRISPRi也适用于哺乳动物细胞。很快人们利用CRISPR/Cas系统实现了对斑马鱼、真菌及细菌的基因编辑。

2013年5月，Jaenisch研究组利用CRISPR/Cas介导的基因工程技术制造了在多个基因上含有多重突变的小鼠，极大地促进了体内多基因的功能学研究。随后，人们实现了对果蝇、线虫、大鼠、猪、羊、以及水稻、小麦、高粱等多种生物的基因编辑。

2013年12月，李劲松研究组和Hans Clevers研究组利用CRISPR/Cas9系统分别校正了小鼠白内障及人干细胞中一种与囊肿性纤维化相关联的基因缺陷。同时，研究者通过向人类细胞转染慢病毒包装的sgRNA库，实现了对基因组范围的功能性筛选。

2015年4月，黄军就和团队首次修饰人类胚胎DNA，为治疗一种在中国南方儿童中常见的遗传病——地中海贫血症提供了可能。

随着对CRISPR系统研究的不断深入，也暴露了一定的缺陷和局限性，如严重的脱靶效应。

2015年9月，张锋研究组报道了一种不同于Cas9的新型2类CRISPR效应因子Cpf1。他们的研究证明，Cpf1是一种不依赖tracrRNA，由单个RNA介导的核酸内切酶。Cas9是在同一个位置同时剪切DNA分子的双链，形成的是平末端；而Cpf1剪切后形成是两个不同长度的链，被称之为黏性末端。同时Cpf1能够识别富含胸腺嘧啶（T）的PAM序列，可以扩展CRISPR的编辑范围。

......

更多历史请看：基因编辑技术CRISPR的发展简史：从发现到爆炸

所以，满打满算，其实也就才8年多时间...看来，想要在生物学领域有所建树的小伙伴们，未来可期啊！

二、CRISPR技术的另一面

技术无罪，但使用者分三六九等。曾轰动一时的基因编辑婴儿事件，想必很多人都有所了解。贺建奎，原南方科技大学副教授，主要研究实验室用物理，统计和信息学的交叉技术来研究复杂的生物系统。研究集中于免疫组库测序，个体化医疗，生物信息学和系统生物学。2018年11月26日，贺建奎“基因编辑婴儿”事件引发轩然大波。业内专家对实验的动机和必要性、实验过程的合规性、实验影响的不可控性提出质疑。他也因此入选《自然》2018十大人物，但却不是正面人物，而是被称为CRISPR流氓。2019年12月30日，“基因编辑婴儿”案在深圳市南山区人民法院一审公开宣判，贺建奎被依法判处有期徒刑三年，并处罚金人民币三百万元。

人民日报曾评论：“相关事件仍然迷雾重重，但公众焦虑挥之不去：潘多拉魔盒一旦打开，谁来收场？技术无罪，但失控的技术可能带来灾难。弘扬学术道德和科研伦理，这是科技工作者的安身之本。无治理则无伦理，让科技趋利避害，除了寄希望于科学家的道德自觉，更须立法跟进。”

三、过去5年诺贝尔化学奖得主名单

2019年——美国和日本3位科学家 John B Goodenough、M. Stanley Whittlingham、Akira Yoshino获奖，获奖理由是“在锂离子电池的发展方面作出的贡献”。

2018年——美国科学家Frances H. Arnoid获奖，获奖理由是“研究酶的定向进化”；另外两位获奖者是美国的George P. Smith和英国的Sir Gregory P. Winter，获奖理由是“研究缩氨酸和抗体的噬菌体展示技术”。

2017年——瑞士、美国和英国3位科学家Jacques Dubochet、Joachim Frank和Richard Henderson获奖，获奖理由是“研发出冷冻电镜，用于溶液中生物分子结构的高分辨率测定”。

2016年——法国、美国、荷兰3位科学家Jean-Pierre Sauvage、J. Fraser Stoddart和Bernard L. Feringa获奖，获奖理由是“分子机器的设计与合成”。

2015年——瑞典、美国、土耳其3位科学家Tomas Lindahl、Paul Modrich和Aziz Sancar获奖，获奖理由是“DNA修复的机制研究”。

四、诺贝尔化学奖小知识

——截至2019年，诺贝尔化学奖共颁发了111次，没有颁发的8年分别是1916、1917、1919、1924、1933、1940、1941和1942年。

——1901年至2019年，共184人次获奖，实际获奖个人为183人，因为英国科学家Frederick Sanger于1958年和1980年两次获奖。

——111次颁奖中，63次为单独获奖者，23次为2人共享，25次为3人共享。

——最年轻的获奖者是法国科学家Frédéric Joliot，1915年因“合成新的放射性元素”与妻子Irène Joliot-Curie一起获奖，时年35岁。

——最年长的获奖者是美国科学家John B. Goodenough，2019年因“在锂离子电池的发展方面作出的贡献”获奖，时年97岁。他也是诺奖得主中获奖时最年长的一位。

——在此次诺贝尔化学奖之前，只有5位女性获得过诺贝尔化学奖。分别是1911年的居里夫人（居里夫人另外还获得1903年的物理学奖）、1935年的Irène Joliot-Curie（居里夫人的女儿）、1964年的Dorothy Crowfoot Hodgkin、2009年的Ada Yonath，以及2018年的Frances H. Arnold。