首页 > 分享 > 通过转基因方法获得安全标记的露地菊火焰早花品系与流程

通过转基因方法获得安全标记的露地菊火焰早花品系与流程

花匠小妙招
2024-09-02 20:50

本发明属于基因工程技术领域，涉及获得一种露地菊‘火焰’的早花新品系。

背景技术：

露地菊(Chrysanthemum morifolium)，为菊科菊属、多年生草本植物，是我国传统露地栽培观赏植物之一，具有花色丰富、花期长、株型整齐等特点，广泛应用于规模化园林绿化。在高纬度的寒冷地区，露地菊能够正常生长，但其受光周期依赖，开花时间大多集中在9月至10月，盛花期恰遇霜冻期，露地菊在霜降后花色开始褪变，致使其观赏性下降、观赏期大幅缩短。然而基因工程技术的兴起，可以进行定向育种而不改变其它性状，即采用先进的分子生物学技术，将目的基因或DNA片段通过载体或直接导入受体细胞，使遗传物质重新组合。由于转基因技术的安全性问题备受关注，本发明以利用对生物安全的非抗生素标记基因——6-磷酸甘露糖异构酶基因(PMI)，以甘露糖为筛选介质，只有转入了PMI基因的外植体细胞能代谢6-磷酸甘露糖，从而为细胞正常生长分化提供能量，而未转入PMI基因的细胞则不能在筛选培养基上继续生长。

菊花遗传转化方法主要有农杆菌介导法和直接导入法，农杆菌介导法以其易操作、低费用、高效率、插入DNA片段大、稳定性好等优点，成为转基因技术中的首选方法。转基因花卉可明显克服当前常规育种的盲目性，缩短育种周期，可创造出技术含量高、市场竞争优势明显的花卉新品种。花卉具有极高的观赏价值，同时也蕴涵的巨大经济利益，花卉基因工程的发展十分迅速，自1987年Meyer等获得转基因矮牵牛以来，花卉基因工程已成为花卉育种的新趋势。它通过抑制内源基因或导入外源基因从而定向改造花卉，缩短了新品种选育的时间，而且可以突破种间不亲和的限制，引入其他物种的基因，改良花卉品质。

技术实现要素：

本发明目的是为了获得提前开花的露地菊‘火焰’新品系，通过基因工程技术，从拟南芥中克隆出LEAFY基因。利用Gateway技术构建植物过表达载体，将构建的载体pCAMBIA1301-PMI-AtLFY电转入农杆菌EHA105中。通过农杆菌侵染外植体露地菊‘火焰’叶片进行遗传转化，经过预培养、共培养、前期筛选培养、后期筛选培养、生根筛选培养等阶段，利用载体上生物安全标记phosphomannose isomerase(PMI)基因在含有甘露糖的培养基进行筛选，最终获得转AtLFY基因的抗性植株218株。然后对这些抗性植株利用PCR、GUS染色、Western blot等方法进行分子生物学检测。PCR检测时分别检测了抗性植株的PMI基因和特异基因AtLFY，检测获得转AtLFY基因的阳性植株13株。将这13株转基因植株和野生型同时转入田间，观察转基因植株现蕾时间、始花时间、盛花时间并与野生型植株进行比较，筛选获得露地菊‘火焰’早花品系，使其盛花期早于霜降期，延长观赏时间，因此本发明开展对露地菊‘火焰’的花期调控是十分必要的。

附图说明

图1为pCAMIB1301载体图；图2为抗性植株PCR检测电泳图；图3为转基因植株的GUS染色检测结果图；图4转基因植株的表型鉴定(现蕾期)；图5转基因植株的表型鉴定(露红期)；图6转基因植株的表型鉴定(初开期)；图7转基因植株的表型鉴定(盛花期)。

具体实施方式

本发明技术方案如下：

(一)目标基因AtLEAFY的克隆及过表达载体构建

首先利用RT-PCR的方法，从拟南芥中克隆得到基因LEAFY(Sequence ID:ref|NM_125579.1，Length:1263)，利用Gateway技术构建过表达载体，构建表达载体的引物为：

attB-LFY–F 5′-AAAAAGCAGGCTATGGATCCTGAAGGTTTCACG-3′

attB-LFY–R 5′-AGAAAGCTGGGTCTAGAAACGCAAGTCGTCGC-3′

attB-adapter-F 5′-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3′

attB-adapter-R 5′-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3′

然后利用农杆菌反复冻融法，将构建好的过表达在体转入农杆菌感受态细胞中，将农杆菌菌液全部涂于一个LB固体培养基平板上，20℃静置培养24hrs。挑取单个菌落在LB液体培养基中(Kana和rif抗性)，在28℃摇菌培养后使用attB-adapter-F/R引物进行PCR检测，将PCR产物送测序并保存菌种备用。

(二)露地菊‘火焰’的遗传转化及转基因植株鉴定

首先利用农杆菌介导的方法进行露地菊‘火焰’遗传转化，具体方法如下：

(1)预培养：以露地菊‘火焰’无菌苗幼嫩叶片为试材，将叶片切成1cm×1cm小块，接种到预培养基上进行预培养1天。

(2)摇菌：3mL LB液体+3μL Kana+3μL rif中加入5μL农杆菌菌液，28℃160rpm 12hrs。

(3)侵染与共培养：将过夜摇的菌液取1ml加入50ml LB液体中并加入50μL Kana，28℃160rpm两个小时左右，测其OD600值，使其达到0.5-0.6。将预培养的叶片放入菌液中并加入乙酰丁香酮浓度为500mg/L，侵染10min，侵染时要轻轻摇动菌液，使每一块外植体都能与菌液充分接触。用灭菌滤纸吸去叶片表面附着的多余菌液，待叶片表面无明显水分后，然后将其接入共培养培养基上，暗培养2天。

(4)筛选培养：采用选择压递增的方式进行筛选，将共培养的叶片在超净工作台内转入到前期筛选的培养基中，当外植体叶片上可以看到微小的愈伤组织后将其转入后期筛选培养培养基中进一步的筛选，每15天换一次培养基。

(5)生根培养：当分化的芽长度为1cm到2cm的时候，将抗性苗转入生根培养基中，促进生根，每15天到20天换一次培养基，获得抗性植株。

然后以获得的露地菊‘火焰’抗性植株总DNA为模板，以LR反应的质粒为阳性对照，以野生型菊花为阴性对照，分别以PMI基因和AtLFY基因特异引物进行PCR检测。

(6)培养基配方

预培养培养基：MS+BA 0.5mg/L+NAA 1.5mg/L+sucrose 30g/L

共培养培养基：1/2MS+BA 0.5mg/L+NAA 1.5mg/L+sucrose 30g/L

延迟培养培养基：MS+BA 0.5mg/L+NAA 1.5mg/L+sucrose 30g/L

前期筛选培养基：MS+BA 0.5mg/L+NAA 1.5mg/L+sucrose 22g/L+mannose 8g/L+cef 300mg/L

后期筛选培养基：MS+BA 0.5mg/L+NAA 1.5mg/L+sucrose 20g/L+mannose 10g/L+cef 300mg/L

生根培养培养基：1/2MS+sucrose 20g/L+mannose 10g/L+cef 100mg/L

然后对初步PCR鉴定的转基因露地菊‘火焰’，取幼嫩叶片，浸泡到GUS染液中，用真空抽滤器对其进行真空渗透，反复几次后，将其放入37℃温箱中保温20-22hrs。将叶片转入75％的乙醇中进行脱色3到5天，期间不断换新的75％的乙醇，至阴性对照材料呈现出黄白色。在肉眼或显微镜下进行观察，白色背景上的蓝色小斑点即GUS表达位点。

最后对转基因植株的进行表型鉴定，将检测获得的阳性植株13株转基因植株和野生型同时转入田间，观察转基因植株现蕾时间、始花时间、盛花时间与野生型植株进行比较，筛选获得花期提前7-11天的露地菊‘火焰’早花品系9个。