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多倍体枇杷果肉颜色基因分型及其遗传规律与表达分析

花匠小妙招
2024-12-12 10:36

枇杷(Eriobotrya japonica)果实细腻多汁、营养丰富,但其种子大而多,大大影响了可食率和加工的便利性。枇杷按果肉颜色可分为白肉和红肉类型,该性状受一对等位基因控制,包括红肉显性基因(Ej PSY2A,功能正常,记为A)和白肉隐性基因(Ej PSY2A~d,片段缺失无功能,记为a),其中白肉枇杷果肉更细腻甘甜。因此,培育无核白肉类型是目前枇杷倍性育种的主要内容之一。目前,三倍体育种是培育无核枇杷最有效的方法,二倍体与四倍体杂交产生白肉三倍体效率较高,并以四倍体白肉(aaaa)与二倍体白肉(aa)组合为最优选,但目前尚未发现白肉四倍体材料。其他红肉杂合型四倍体亲本的杂交后代也能够产生白肉三倍体,但效率存在较大差异。测定杂交所需四倍体亲本的基因型并明确不同亲本获得白肉三倍体的效率并确定最佳亲本对加快育种进程大有裨益。当前,检测植物多倍体基因型的技术较少,部分现有的技术成本较高,操作复杂。因此,建立一种快速、简便的枇杷多倍体基因型检测技术十分必要。因此,本研究开发了基于定量PCR(q PCR)的枇杷多倍体果肉颜色基因分型技术,并对天然多倍体枇杷的果肉颜色基因型进行鉴定;根据基因分型结果选择不同基因型的四倍体枇杷与白肉二倍体枇杷杂交,检测杂交后代的倍性和果肉颜色类型,以明确四倍体枇杷果肉颜色基因的遗传规律;并对不同基因型多倍体枇杷果肉颜色基因的表达进行了分析,初步探讨了等位基因频率对等位基因表达的影响。主要研究结果如下:1、基于q PCR的枇杷多倍体果肉颜色基因分型技术的开发与应用根据果肉颜色等位基因对Ej PSY2A/Ej PSY2A~d序列差异,在两个基因相同区域和Ej PSY2A~d的缺失区域分别设计特异性引物,并以拷贝数恒定的SSR标记CH03g12作为参考序列。通过q PCR扩增后使用2~(-ΔΔCt)法计算等位基因相对拷贝数。利用纯合二倍体(AA和aa)按13个不同比例混合构建模拟多倍体杂合子DNA库,结果显示模拟杂合子分类结果准确。利用已知基因型的二倍体进行q PCR基因分型,分型结果符合理论值,进一步证明了q PCR基因分型系统的准确可靠性。多倍体q PCR基因分型结果显示三倍体枇杷果肉颜色具有AAA、AAa、Aaa、aaa四种基因型;四倍体具有AAAA、AAAa、AAaa和Aaaa四种基因型。目前缺乏aaaa白肉纯合基因型种质资源。2、四倍体与二倍体杂交F_1代倍性变异和果肉颜色分离规律分析通过倍性检测和后代果肉颜色基因型分析显示,F_1代具有多种倍性变异,但以亲本中间倍性为主,且四倍体做母本时三倍体的得率(93.94%)远大于做父本时(55.31%)。果肉颜色性状分离符合孟德尔定律,但因亲本不同而略有差异。其中,四倍体B431果实颜色基因型为Aaaa,当其做母本时,后代中白肉三倍体的得率较高(58.82%),可作为培育白肉无核枇杷的杂交骨干亲本。3、不同基因型多倍体枇杷果肉类胡萝卜素组分存在差异为分析不同基因型多倍体枇杷果肉颜色基因的表达,本研究特选取遗传背景相同的B431(Aaaa)、B456(AAaa)和B433(Aaaa)为主要材料(均为红肉枇杷品种‘龙泉1号’的后代)。果实色差测定结果显示,枇杷果实颜色受到基因型影响,红肉显性等位基因拷贝数增加,果肉颜色更偏向红黄色。进一步对果肉中的呈色色素(类胡萝卜素)组分进行分析,结果显示,红肉显性等位基因拷贝数增加,果肉中的类胡萝卜素总量及各组分具有明显增加,如β-胡萝卜素、β-隐黄质、紫黄质。即功能性PSY基因拷贝数的增加,对枇杷果肉颜色以及显色成分有正向影响。4、多倍体中Ej PSY2A/Ej PSY2A~d基因存在等位基因表达偏差不同基因型四倍体枇杷的绿熟期、转色期、黄熟期、完熟期的Ej PSY2A和Ej PSY2A~d表达量测定结果显示,3个株系按Ej PSY2A的表达量由高到低为:B456(AAaa)、B433(AAAa)和B431(Aaaa);Ej PSY2A~d的表达量随拷贝数的增加而明显增加,表现为正相关关系,但增加比例不成线性关系。随果实发育,等位基因对Ej PSY2A/Ej PSY2A~d的表达比例逐渐与基因组的拷贝数比例相符。由此可见,等位基因对的表达在不同基因型间存在明显差异,即基因表达受等位基因拷贝数的影响,具有剂量效应和等位基因表达偏差现象。5、不同倍性材料Ej PSY2A/Ej PSY2A~d启动子克隆及活性分析Ej PSY2A/Ej PSY2A~d启动子被成功克隆,片段长2997 bp,且不同倍性材料的启动子序列无差异。顺式元件分析发现大量光响应元件,表明Ej PSY2A/Ej PSY2A~d表达可能对光照十分敏感,此外还具有生长素、赤霉素、茉莉酸等植物激素响应元件及MYB转录因子结合元件,表明其受多种激素和MYB转录因子的调控。将Ej PSY2A/Ej PSY2A~d启动子全长和一系列5'端缺失片段融合到GUS报告基因上游,瞬时转化番茄果实。结果表明,该启动子活性关键区域位于-1405 bp到-893 bp之间,为后续系统深入地研究枇杷果肉颜色基因的表达提供参考。综上所述,本研究建立了q PCR多倍体枇杷果肉颜色基因分型技术,为其他植物多倍体的基因分型提供了参考;明确了枇杷现有代表性多倍体材料的果肉颜色基因型,解析了杂合红肉四倍体枇杷果肉颜色基因的遗传规律,筛选获得了创制白肉三倍体枇杷的核心亲本B431,为白肉三倍体枇杷的选育奠定了基础,为分析多倍体基因的遗传规律、剂量效应和等位基因特异性表达提供了参考。本研究还发现不同基因型多倍体枇杷果实的类胡萝卜素组分和Ej PSY2A/Ej PSY2A~d等位基因表达存在差异,即存在剂量效应和表达偏差,由于材料数量限制,其具体情况和作用机制还有待进一步研究。