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植物组织冰冻切片技术的比较研究 冷冻切片是将生物组织置于低温下，快速冷冻，达到一定硬度后的一种实验技术。与常规的石蜡切片相比, 它不经脱水、透明、浸蜡等步骤, 因此组织不会收缩, 易保持原有生活形态, 具有快速、简便、易操作等优点, 常用于组织化学、免疫定位及原位杂交等研究 (李和平, 2009) 。冰冻切片目前在动物和人体组织的研究中得到非常广泛的应用。植物细胞因具有液泡, 含水量比相同体积的动物和人体细胞多, 使得在进行低温切片时易形成冰晶, 造成植物组织的细胞结构受到伤害。同时, 由于具有细胞壁也使得植物组织在冰冻后硬度变大易破碎, 致使多数情况下难以切出结构完整的切片, 因此该技术在植物组织切片上的应用较少。近几年来, 有一些报道 (林月惠等, 2001;万怡震和贺普超, 2001;陈丹和赵洁, 2005;刘剑锋等, 2006a, 2006b;宁代锋等, 2008;张新成等, 2008;陆叶等, 2009;谢佩松等, 2009;李儒海和强胜, 2010) 对冰冻切片技术在植物不同器官和组织的应用及方法进行了探讨, 但这些方法大多数是将实验材料经过FAA或多聚甲醛等固定液固定、冰冻保护剂保护或液氮速冻等处理后才能得到较好的切片效果, 不仅过程较为复杂, 而且切片条件各异, 对于初学者较难掌握。 新鲜材料不经处理直接包埋冷冻切片的方法在动物组织中经常被采用且效果良好。在植物组织中, 陈丹和赵洁 (2005) 、陆叶等 (2009) 报道未经固定的材料直接切片效果差, 难以得到结构完整的切片;而宁代锋等 (2008) 则采用直接包埋和适当回温相结合的方法, 取得了较好的切片效果。 根据资料和我们的实验观察, 新鲜材料能否获得组织结构完整的高质量的冰冻切片, 主要取决于材料冷冻时的温度 (包括冷箱温度和冷台温度) 以及冷冻时间等因素。基于以上情况, 本研究以毛白杨 (Populus tomentosa) 子房为实验材料, 尝试比较了15种冰冻切片条件, 获得了适合新鲜材料直接包埋冷冻切片的冷箱温度、冷台温度和冷冻时间。在此基础上, 将这些条件应用于大叶黄杨 (Euonymus japonicus) 、旱柳 (Salix matsudana) 、南蛇藤 (Celastrus orbiculatus) 、油松 (Pinus tabuliformis) 4种植物新鲜材料的不同组织上, 也获得了良好的切片效果。实验证明这一方法是可行的, 并具有一定的普适性。该方法不仅简化了切片过程, 节省了时间, 也避免了使用固定剂和保护剂的弊端, 便于在植物学教学和研究中广泛应用。 本研究以毛白杨、旱柳、望春玉兰 (Magnolia biondii) 、国槐 (Sophora japonica) 、丝棉木 (Euonymus maackii) 5种植物的不同组织为实验材料, 对新鲜材料直接冰冻切片和固定后材料石蜡切片在植物组织化学中的应用作了比较, 观察两种切片技术在鉴定多糖、蛋白质、脂肪和角质等不同化学成分上的异同及其各自的适用特点, 以期为人们在组织化学分析中对两种切片技术的选择和应用提供参考。 1 材料和方法 1.1 实验材料的选择 毛白杨 (Populus tomentosa Carr.) 取自中国科学院半导体研究所内的行道树, 选取生长良好的雌花进行实验。大叶黄杨 (Euonymus japonicus Thunb.) 、旱柳 (Salix matsudana Koidz.) 、南蛇藤 (Celastrus orbiculatus Thunb.) 、望春玉兰 (Magnolia biondii Pampan.) 、丝棉木 (Euonymus maackii Rupr.) 、国槐 (Sophora japonica L.) 和油松 (Pinus tabuliformis Carr.) 均取自北京林业大学校园, 分别选择生长良好的花、果实、种子和叶作为实验材料。 1.2 光学显微镜检测 实验仪器包括Leica CM1950冰冻切片机、Leica RM2126RT切片机、Olympus BX51光学显微镜及其附带的Olympus DP75数码相机。 1.3 方法和步骤 1.3.1 新鲜材料2不同处理 为了对不同冰冻切片条件进行比较, 将实验材料分3类情况进行处理, 具体实验步骤如下。 第1类为新鲜材料直接切片 (表1, 序号1–6) 。将材料浸没在OCT包埋剂中20分钟, 之后移入样品台上使样品深埋其中, 将样品台放入不同冷箱温度 (chamber temperature) 和冷台 (样品头) 温度 (specimen-head temperature) (操作温度见表1中序号1–6) 的机箱中冷冻20–40分钟后, 再将其固定后切片, 切片
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