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一种观察花芽分化过程的石蜡切片的制作方法与流程

花匠小妙招
2024-12-17 22:44

本发明涉及植物样品观察技术领域，并且更具体地，涉及到一种观察植物花芽分化过程的石蜡切片的制作方法。

背景技术：

开花是高等植物生活史中的重要阶段。近年来，随着对模式植物拟南芥成花分子机制的解析，人们对一年生草本植物花的形成与发育机制有了较为深入的了解；而多年生草本植物与一年生草本植物生殖习性存在着巨大的差异，虽然利用拟南芥成花转变研究的方法也取得了一定的进展，但到目前为止，我们对多年生草本植物成花分子机制的了解还有待进一步的探索。

在多年生植物花形成和发育的相关研究中，花芽解剖结构作为鉴定花芽分化的重要依据之一，常作为判断花芽分化程度的重要手段，主要是通过植物组织切片在显微镜下观察其结构的发育程度而得以实现。因此，探索高效、低毒获得切片的方法在鉴定花芽分化发育程度时有重要的应用价值，是一种科学有效的鉴定方法。

对于植物花芽分化的切片组织学研究，传统的方法有很多，包括传统石蜡组织切片法、冷冻切片法。传统的石蜡组织切片采用二甲苯透明，但二甲苯易挥发毒性很大，在加热的过程中，会散发到空气中，引起研究人员身体不适；同时制作周期很长；冷冻切片法则避免了上述两个问题，但冷冻切片切除的片子结构不易完整，片子较厚，切除的片子无法长久保存，而且冷冻切片每次都需要取新鲜样品进行固定和切片，受取样时间的限制，不灵活。无法很好的展现植物组织细胞的变化，同时无法为更深入的原位杂交等分子生物学研究提供植物切片。

对于肉质状的根茎，花芽产生于茎尖上。在制作切片的过程中，切片组织包括幼嫩的茎尖，肉质状较硬的根茎组织，两者连生在一起，大大增加了制作的难度。因此探索适合的石蜡切片技术应用与萱草组织解剖结构及细胞学研究中是一个重要的问题。以前虽有其他植物组织石蜡切片的报道，但不同种类的植物组织有不同的特性。以往的相关结果虽有借鉴意义，却不能完全的应用于萱草花芽分化组织切片研究。

综上所述，探索一种快速、低毒的石蜡切片技术，应用于茎尖细胞学及花芽分化观察研究，是一个重要的技术问题。

技术实现要素：

本发明针对上述问题，目的在于提供一种观察花芽分化过程的石蜡切片的制作方法，其能解决现有技术毒性大或切片不完整、取样时间受限/制作难度大等技术问题。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的实施例公开了一种观察花芽分化过程的石蜡切片制作方法，包括植物样本取材固定、脱水透明、透蜡包埋、蜡块修正切片、粘片展片、染色封固；

其中，所述植物样本取材固定包括切取植物茎尖中心组织，所述切取植物茎尖中心组织包括以茎尖中心点及叶片的基生线为轴，在平行于叶片基生线方向切取宽度为4-6mm，在垂直于叶片基生线方向切取宽度为2-4mm，在高度方向切取5-7mm。优选地，在平行于叶片基生线方向切取宽度为5mm，在垂直于叶片基生线方向切取宽度为3mm，在高度方向切取6mm。

进一步地，所述植物样本取材固定包括：剖离基生在植物根状茎上的叶片后，切取植物茎尖中心组织，浸于装有fpa固定液的容器中，并将所述容器置于真空干燥器内，使样品沉底，得到固定样本。

其中，容器可选用10ml的带盖试管，样品沉底，时打开试管盖，抽真空1-2小时，直至样品全部沉底。固定液采用fpa固定液(福尔马林-丙酮-乙醇固定液)，由以下试剂配置而成：50％乙醇：丙酮：福尔马林＝90ml:7ml:3ml；此外，每100mlfpa固定液添加5ml甘油。材料固定液体积比为1:40。

进一步地，所述脱水透明包括：将所述固定样本中的液体倒出后，向其中置换不同梯度的脱水机和透明剂进行脱水透明。

具体可以为，固定结束后，将试管内的固定液倒出，置于试管架上。依次往试管内置换不同梯度的脱水剂、透明剂中进行脱水、透明，操作全部在摇床中进行，摇床温度为25℃，转速为100r/h，能够有效的加快细胞内溶液的置换效率，提高脱水透明的质量。可包括以下步骤：50％乙醇→60％乙醇→70％乙醇→75％乙醇和叔丁醇混合液(13:7,v/v)→85％乙醇叔丁醇混合液(9:11,v/v)→95％乙醇叔丁醇混合液(1:3,v/v，以上步骤均浸泡20min)→纯叔丁醇a→纯叔丁醇b(以上步骤均浸泡1h)。即所述置换不同梯度的脱水机和透明剂进行脱水透明包括：50％乙醇浸泡处理、60％乙醇浸泡处理、70％乙醇浸泡处理、体积比为13:7的75％乙醇和叔丁醇混合液浸泡处理、体积比为9:11的85％乙醇叔丁醇混合液浸泡处理、体积比为1:3的95％乙醇叔丁醇混合液浸泡处理、纯叔丁醇a浸泡处理、纯叔丁醇b浸泡处理。所述50％乙醇浸泡处理、60％乙醇浸泡处理、70％乙醇浸泡处理、体积比为13:7的75％乙醇和叔丁醇混合液浸泡处理、体积比为9:11的85％乙醇叔丁醇混合液浸泡处理、体积比为1:3的95％乙醇叔丁醇混合液浸泡处理的处理时间均为20分钟；所述纯叔丁醇a浸泡处理、纯叔丁醇b浸泡处理的处理时间均为1小时。

增加一种脱水剂叔丁醇；单独使用乙醇容易使幼嫩组织过快脱水，叔丁醇较为温和，能够有效避免材料过度收缩的状况，提高脱水质量。采用叔丁醇作为透明剂。叔丁醇低毒，能够有效减轻在透明、浸蜡过程中，因加热而导致的二甲苯不断挥发，严重影响科研人员的身体健康的情况；同时，二甲苯容易使幼嫩组织收缩、变脆，叔丁醇较为温和，能够有效避免切片散碎的状况，提高了操作的的安全性及透明效果。

进一步地，所述透蜡包埋包括：将脱水透明后得到的材料进行预处理后，进行包埋，所述预处理包括将所述脱水透明后得到的材料依次放入体积比为1:6的石蜡和叔丁醇混合液、体积比为3:8的石蜡和叔丁醇混合液、熔化的纯石蜡a、熔化的纯石蜡b、熔化的纯石蜡c。

具体地，可以将脱水透明后的材料依次放入第一石蜡和叔丁醇混合液(1:6,v/v,50℃,3h)→第二石蜡和叔丁醇混合液(3:8,v/v,55℃,3h)→预先熔化好的纯石蜡a(60℃,5h)→纯石蜡b(60℃,5h)→纯石蜡c(60℃,5h)。随后，方可进行包埋。包埋时，用解剖针将样品尽量调整到包埋块的中部。

然后将包埋后的蜡块进行切片处理，确定植物茎尖中心点及叶片的基生线之间的轴线；将蜡块与轴线平行的一面粘固在小木头上，作为切面；同时，将植物组织倒置，茎尖垂直朝下，根部组织向上，进行裁切，蜡片厚度可为10μm。在观察判断茎尖生长点是否分化为花序分生组织结构时，切片的角度非常重要，决定了是否能切出具有完整茎尖生长点结构的片子。因此，切片时首先确定茎尖中心点及叶片的基生线之间的轴线，随后将蜡块与轴线平行的一面粘固在小木头上，作为切面。优化后的片子能够完整的呈现茎尖生长点的结构，是判断植物花芽分化程度的理想片子；同时，将植物组织倒置，茎尖(幼嫩组织)垂直朝下，根部组织向上，这个方法在处理两种不同结构的组织时，能够很大的减少切片破碎的状况，可获得高质量的切片。

进一步地，所述粘片展片包括：将蜡片用明胶粘贴剂粘在载玻片上，置于展片台上加热至完全伸展，展片台温度设定为42℃。随后可将粘贴好的载玻片烤干，烤好的片子室温保存。

进一步地，所述染色封固包括：依次采用二甲苯、体积比为1:2的无水乙醇和二甲苯混合液、体积比为1:1的无水乙醇和二甲苯混合液、无水乙醇、95％乙醇、90％乙醇、80％乙醇、70％乙醇、60％乙醇分别浸泡；

采用1％苯胺番红染液暗环境染色3-5小时后，依次采用60％乙醇、70％乙醇、80％乙醇、90％乙醇、95％乙醇浸泡20-30秒；

采用0.5％苯胺固绿染液染色后，依次采用95％乙醇、无水乙醇、体积比为1:1的无水乙醇和二甲苯混合液、纯二甲苯进行浸泡处理；

采用二甲苯稀释的加拿大树胶作为封固剂，盖上盖玻片封固。

进一步地，所述1％苯胺番红染液的溶剂为50％乙醇溶液；

所述0.5％苯胺固绿染液的溶剂为95％乙醇溶液，染色时间为30秒；

采用0.5％苯胺固绿染液染色后，所述95％乙醇的处理时间为3-5秒，所述无水乙醇、体积比为1:1的无水乙醇和二甲苯混合液的处理时间均为20-30秒，所述纯二甲苯的处理时间为2分钟。

本发明一实施例中，所示染色固封具体包括以下步骤：二甲苯(1h)→无水乙醇+二甲苯(1:2,v/v)→无水乙醇+二甲苯(1:1,v/v)→无水乙醇→95％、90％、80％、70％、60％乙醇(以上步骤均2min)→1％苯胺番红染液(50％乙醇溶液配制；暗环境，染色3-5h)→60％、70％、80％、90％、95％乙醇(以上步骤均20-30s)→0.5％苯胺固绿染液(95％乙醇溶液配制，染色30s)→95％乙醇(3-5s)→无水乙醇→无水乙醇+二甲苯(1:1,v/v，以上步骤每个20-30s)→纯二甲苯(2min)。最后用二甲苯稀释的加拿大树胶作为封固剂，盖上盖玻片封固。放于阴凉处晾干。

显微观察，可采用olympusch20光学显微镜观察切片。用olympusbx51数码显微镜观察并拍照。

本发明的有益效果是：

采用特殊的取材方法，可以真实准确的反映出植物茎尖的生长状态，为观察植物花芽分化过程提供了细胞学视角；较传统的石蜡切片固定方法，本发明的固定方法减少了幼嫩材料固定后变脆的情况。本发明的方法保证了观察测量茎尖生长点角度的准确性，比传统石蜡切片更高效，得到的切片准确性更高。

附图说明

图1a-图1d是本发明实施例1的石蜡切片图；

图2a-图2b是本发明实施例2的石蜡切片图；

图3a-图3b是本发明实施例3的石蜡切片图；

图4a-图4b是不同取材角度的石蜡切片结果比较；

图5a-图5b是不同切面方向的石蜡切片结果比较；

图6a-图6c是对比例1的石蜡切片图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1：营养期萱草茎尖的显微结构

取材固定抽气：剖离基生在萱草根状茎上的叶片后，以萱草茎尖中心点及叶片的基生线为轴，立刻小心地切取5mm(平行于叶片基生线)×3mm(垂直于叶片基生线)×5mm(高度)的萱草茎尖中心组织，浸于装有fpa固定液的10ml试管(带盖)中固定保存，材料固定液体积比为1:40。随后，将试管放入真空干燥器中，打开试管盖，抽真空1-2小时，直至全部样品沉底。

脱水透明：固定结束后，将试管内的固定液倒出，置于试管架上。依次往试管内置换不同梯度的脱水剂、透明剂中进行脱水、透明，操作全部在摇床中进行。包括以下步骤：50％乙醇→60％乙醇→70％乙醇→75％乙醇和叔丁醇混合液(13:7,v/v)→85％乙醇叔丁醇混合液(9:11,v/v)→95％乙醇叔丁醇混合液(1:3,v/v，以上步骤均浸泡20min)→纯叔丁醇a→纯叔丁醇b(以上步骤均浸泡1h)。摇床温度设为25℃，转速设为100r/h。

透蜡包埋：将上步处理后的材料依次放第一石蜡和叔丁醇混合液(1:6,v/v,50℃,3h)→第二石蜡和叔丁醇混合液(3:8,v/v,55℃,3h)→预先熔化好的纯石蜡a(60℃,5h)→纯石蜡b(60℃,5h)→纯石蜡c(60℃,5h)。随后，方可进行包埋。包埋时，用解剖针将样品尽量调整到包埋块的中部。

修蜡块、切片：修整蜡块时，确定萱草茎尖中心点及叶片的基生线之间的轴线；将蜡块与轴线平行的一面粘固在小木头上，作为切面；同时，将植物组织倒置，茎尖垂直朝下，根部组织向上，进行裁切。蜡片厚度为10μm。

粘片和展片：将蜡片用明胶粘贴剂粘在载玻片上，置于展片台上加热至完全伸展，展片台温度设定为42℃。随后将粘贴好的载玻片烤干，烤好的片子室温保存。

染色和封固：包括以下步骤操作：二甲苯(1h)→无水乙醇+二甲苯(1:2,v/v)→无水乙醇+二甲苯(1:1,v/v)→无水乙醇→95％、90％、80％、70％、60％乙醇(以上步骤均2min)→1％苯胺番红染液(50％乙醇溶液配制；暗环境，染色3-5h)→60％、70％、80％、90％、95％乙醇(以上步骤均20-30s)→0.5％苯胺固绿染液(95％乙醇溶液配制，染色30s)→95％乙醇(3-5s)→无水乙醇→无水乙醇+二甲苯(1:1,v/v，以上步骤每个20-30s)→纯二甲苯(2min)。最后用二甲苯稀释的加拿大树胶作为封固剂，盖上盖玻片封固。放于阴凉处晾干。

显微观察：使用olympusch20光学显微镜观察切片。用olympusbx51数码显微镜观察并拍照，见图1，其中，图1a，图1c为物镜放大倍数10x；图1b，图1d为物镜放大倍数20x。

实施例2：花芽分化期萱草花芽的显微结构

在实施例1的取材固定抽气阶段：剖离基生在萱草根状茎上的叶片后，以萱草茎尖中心点及叶片的基生线为轴，立刻小心地切取5mm(平行于叶片基生线)×3mm(垂直于叶片基生线)×5mm(高度)的萱草茎尖中心组织，浸于装有fpa固定液的10ml试管(带盖)中固定保存，材料固定液体积比为1:40。随后，将试管放入真空干燥器中，打开试管盖，抽真空1-2小时，直至全部样品沉底。

在实施例1的脱水透明阶段：固定结束后，将试管内的固定液倒出，置于试管架上。依次往试管内置换不同梯度的脱水剂、透明剂中进行脱水、透明，操作全部在摇床中进行。包括以下步骤：50％乙醇→60％乙醇→70％乙醇→75％乙醇和叔丁醇混合液(13:7,v/v)→85％乙醇叔丁醇混合液(9:11,v/v)→95％乙醇叔丁醇混合液(1:3,v/v，以上步骤均浸泡20min)→纯叔丁醇a→纯叔丁醇b(以上步骤均浸泡1h)。摇床温度设为25℃，转速设为100r/h。

在实施例1透蜡包埋阶段：将上步处理后的材料依次放入第一石蜡和叔丁醇混合液(1:6,v/v,50℃,3h)→第二石蜡和叔丁醇混合液(3:8,v/v,55℃,3h)→预先熔化好的纯石蜡a(60℃,5h)→纯石蜡b(60℃,5h)→纯石蜡c(60℃,5h)。随后，方可进行包埋。包埋时，用解剖针将样品尽量调整到包埋块的中部。

在实施例1修蜡块切片阶段：修整蜡块时，确定萱草茎尖中心点及叶片的基生线之间的轴线；将蜡块与轴线平行的一面粘固在小木头上，作为切面；同时，将植物组织倒置，茎尖垂直朝下，根部组织向上，进行裁切。蜡片厚度为10μm。结果如图2所示，其中，图2a为物镜放大倍数10x；图2b为物镜放大倍数20x。

实施例3：小花蕾形成期萱草花芽的显微结构

在实施例1修蜡块切片阶段：修整蜡块时，确定萱草茎尖中心点及叶片的基生线之间的轴线；将蜡块与轴线平行的一面粘固在小木头上，作为切面；同时，将植物组织倒置，茎尖垂直朝下，根部组织向上，进行裁切。蜡片厚度为10μm。结果如图3所示，其中图3a为物镜放大倍数10x；图3b为物镜放大倍数20x。

对比例1

对比例1中的脱水透明方法为常规乙醇二甲苯脱水透明法，具体操作为，将固定后的材料依次置于50％、60％、70％、80％、90％、95％乙醇中进行脱水，每次1.5小时；再放入无水乙醇中脱水两次，每次1小时；随后，将脱水处理后的材料分别置于二甲苯+无水乙醇(1:1,v/v)、纯二甲苯a、纯二甲苯b中进行透明，每次2小时。则脱水透明完成。再将材料置于等体积的二甲苯+石蜡中浸蜡10小时，恒温40℃。此后进行包埋，切片，封片等步骤。见图6，其中，图6a,营养期萱草茎尖的石蜡切片结构；图6b,花芽分化期萱草花芽的石蜡切片结构；图6c,小花蕾分化期萱草花芽的石蜡切片结构；图6a，物镜放大倍数5x；图6b–图6c:物镜放大倍数10x。

本发明还对不同取材方法的萱草花芽石蜡切片结果比较，如图4所示为小花蕾分化期的取材，其中，图4a为本发明的石蜡取材方法；图4b为普通石蜡取材方法；物镜放大倍数10x。本发明还对不同切面方向的萱草花芽石蜡切片结果比较，如图5所示为营养期的取材，其中，图5a为本发明的切面方法；图5b为传统切面方向；物镜放大倍数10x。

为了进一步证明本发明的制作方法用于其他植物也可以产生与萱草同样的效果，对多年生草本植物芍药、百合、大丽花等也制作了石蜡切片，并观察其花芽分化过程，实验证明，本发明所提供的观察植物花芽分化过程的石蜡切片的制作方法，通过获得的植物根茎端材料经取材，fpa固定液固定保存；乙醇、乙醇叔丁醇混合液梯度脱水；叔丁醇透明；石蜡包埋；修整蜡块、切片、展片、粘片、烘干、封片等步骤后，制作出的石蜡切片用于花芽分化过程的观察研究。与传统石蜡切片方法相比，本发明的取材方法，可以真实准确的反映出茎尖的生长状态，为观察花芽分化过程提供了细胞学视角；较传统的石蜡切片固定方法，本发明的固定方法减少了幼嫩材料固定后变脆的情况。同时，选择上述脱水剂和透明剂，可以获得高质量的石蜡切片，降低制作过程中加热产生的毒性。而且本发明优化的脱水透明方法，大大缩短了利用石蜡切片观察花芽分化过程的制作时间，提高了时间效率。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非用来限定本发明的实施范围；如果不脱离本发明的精神和范围，对本发明进行修改或者等同替换，均应涵盖在本发明权利要求的保护范围当中。