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桂花花提取物在制备防治湿疹药物中的应用.pdf

花匠小妙招
2024-12-20 11:48

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010085478.4 (22)申请日 2020.02.04 (71)申请人成都华西珐玛生物科技有限公司地址 610000 四川省成都市高新区天府五街200号1号楼B区4-5楼 (72)发明人黄静徐一丹黄慧勤 (74)专利代理机构成都时誉知识产权代理事务所(普通合伙) 51250 代理人汪林 (51)Int.Cl. A61K 36/63(2006.01) A61P 17/00(2006.01) A61K 8/9789(2017.01) A61K 8/92(20

2、06.01) A61Q 19/00(2006.01) A61K 133/00(2006.01) (54)发明名称桂花花提取物在制备防治湿疹药物中的应用 (57)摘要本发明公开桂花（Osmanthusfragrans (Thunb.)Lour.）花提取物在制备防治湿疹药物中的应用，所述药物中的活性成分为桂花花提取物，所述桂花花提取物为申请号为 CN201710420375.7的中国发明专利申请中的公开的桂花净油。本发明将桂花花提取物作为活性物质用于防治湿疹皮肤病，桂花花提取物作为活性成分经皮肤吸收，提高了患者的免疫力，可治疗湿疹。权利要

3、求书1页说明书15页 CN 111184772 A 2020.05.22 CN 111184772 A 1.桂花花提取物在制备防治湿疹药物中的应用，其特征在于，所述药物的活性成分为桂花花提取物。 2.根据权利要求1所述的桂花花提取物在制备防治湿疹药物中的应用，其特征在于，所述湿疹包括婴儿湿疹、儿童湿疹和青少年/成人湿疹。 3.根据权利要求1所述的桂花花提取物在制备防治湿疹药物中的应用，其特征在于，所述药物为医药、医疗器械或者化妆品。 4.根据权利要求1所述的桂花花提取物在制备防治湿疹药物中的应用，其特征在于，所述桂花花提取物质量百分比浓度范围为0.01%-2%。

4、5.根据权利要求1所述的桂花花提取物在制备防治湿疹药物中的应用，其特征在于，所述药物的给药方式为外用给药。 6.根据权利要求3所述的桂花花提取物在制备防治湿疹药物中的应用，其特征在于，所述药物的剂型包括软膏、霜、凝胶、敷料、喷雾、乳液、精华素和面膜。 7.根据权利要求1-6任一项所述的桂花花提取物在制备防治湿疹药物中的应用，其特征在于，所述药物还包括辅料，所述辅料为制备药物所允许使用的相应剂型的辅料。权利要求书 1/1 页 2 CN 111184772 A 2 桂花花提取物在制备防治湿疹药物中的应用技术领域 0001 本发明属于药物制备领域，具体涉及桂花(

5、Osmanthus fragrans(Thunb.)Lour.) 花提取物在制备防治湿疹药物中的应用。背景技术 0002 特应性皮炎(atopic dermatitis， AD)是一种慢性、炎症性、复发性、瘙痒性皮肤病，具有高度异质性，涉及基因、环境、免疫等多重因素，病情十分复杂。且全球患病率呈逐年上升趋势。 0003 特应性皮炎，又称为湿疹。根据特应性皮炎患病年龄，可分为婴儿期(02岁)，儿童期(212岁)和青少年及成人期(12岁)。 0004 湿疹发病主要位于面颊部、额部和头皮，逐渐发展至躯干和四肢伸侧，伴有瘙痒、干皮症、抓痕、炎性皮损(红斑、

6、丘疹、水疱、渗出和脱屑)、苔藓样变以及反复发作等特征。湿疹还可根据其病情状态分为：干性湿疹和渗出性湿疹。 0005 婴儿期特应性皮炎，又称婴儿湿疹(infantile eczema)，民间称之为 “奶癣” 或 “胎敛疮” ，为婴儿时期最常见的皮肤病之一，婴儿湿疹如果未能及时治疗，有可能迁延至儿童期、青少年/成人期。 0006 婴儿湿疹根据病情的严重程度分为：轻度、中度和重度。 0007 目前，对于婴儿湿疹的治疗方法，是根据患儿年龄、皮损部位、性质及病情状态和严重程度，通常采用基础治疗(外用保湿剂)加外用糖皮质激素(Glucocorticoid， G

7、C)治疗方法。而基础治疗复发率高，且复发间隔时间短。糖皮质激素治疗可有效缓解症状，但停止使用后，湿疹会快速复发，且症状更严重。同时，长期使用糖皮质激素会产生皮肤萎缩、多毛、色素减退、继发或加重感染等副作用，不利于婴儿的健康生长。 0008 桂花是木樨科(Oleaceae)木犀属木犀(Osmanthus fragrans(Thunb.)Lour.)的习称，又名岩桂、九里香等，常绿乔木或灌木，花冠合瓣四裂，形小。由于桂花显著的甜美芳香的气味和味道，其作为食品加工领域中的添加成分已有广泛的应用和悠久的历史。 0009 桂花(Osmanthus frag

8、rans(Thunb.)Lour.)花中含有一定量的净油成分，是一类非挥发性脂溶性成分为主的油状物质，是一类重要次生代谢产物。净油的化学成分一般较复杂，根据其结构可分为萜类化合物、芳香族化合物、脂肪族化合物、含硫含氮杂环化合物。桂花净油的部分成分也是构成桂花特征性气味的成分。现有研究显示，尽管目前的桂花品种繁多，但至少在构成其特征性芳香成分的组成上实际并无本质差异。 0010 申请号为CN201710420375.7的中国发明专利申请中公开了一种桂花花提取物桂花净油，而目前桂花花提取物主要作为香料使用或者普通的护肤使用，关于桂花花提取物在制备防治湿疹药物中的

9、应用尚未见报道。发明内容 0011 为了解决上述问题，本发明提供一种桂花花提取物的新用途，即桂花花提取物在说明书 1/15 页 3 CN 111184772 A 3 制备防治湿疹药物中的应用。基于该应用，可以将桂花花提取物作为活性成分用于湿疹皮肤病的治疗。 0012 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案： 0013 桂花花提取物在制备防治湿疹药物中的应用，所述药物的活性成分为桂花花提取物，所述桂花花提取物为申请号为CN201710420375.7的中国发明专利申请中的公开的桂花净油。 0014 所述湿疹包括婴儿湿疹、儿童湿疹和青少年/成人湿疹。 0015 所述药物

10、为医药品、医疗器械或者化妆品。 0016 所述桂花花提取物质量百分比浓度范围为0.01-2。 0017 所述药物的给药方式为外用给药。 0018 所述药物的剂型包括软膏、霜、凝胶、敷料、喷雾、乳液、精华素、面膜等常见药剂类型。 0019 所述药物还包括其他辅料，所述辅料为制备药物所允许使用的相应剂型的辅料。 0020 与现有技术相比，本发明的有益效果在于： 0021 本发明将桂花花提取物作为活性物质用于防治湿疹皮肤病，桂花花提取物作为活性成分经皮肤吸收后，提高了患者的免疫力，可治疗湿疹，对婴儿湿疹、儿童湿疹或青少年/ 成人湿疹具有治疗效果，尤其对于婴儿湿疹，

11、治愈率高且复发率低于目前常用的基础治疗加激素治疗。桂花花提取物具有较好的免疫增强作用将其作为治疗湿疹的药物的活性成分，正是利用其增强免疫的功效，通过皮肤吸收，提高免疫，从而达到治疗湿疹的目的。具体实施方式 0022 下面结合实施例对本发明作进一步的描述，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，并不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域的普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。 0023 实施例1 0024 一种防治湿疹药物，具体为喷雾，该药物的原料为桂花花提取物、氢化蓖麻油、苯氧乙醇和纯水，其中桂花

12、花提取物的质量百分比浓度为0.01， PEG-40氢化蓖麻油的质量百分比浓度为0.01，苯氧乙醇的质量百分比浓度为0.3，余量为纯水，采用常规方法，将桂花花提取物、氢化蓖麻油、苯氧乙醇分散在纯水中，装入喷雾瓶中，制备成喷雾。使用时，将该药物喷雾喷涂在患处即可。 0025 实施例2 0026 一种防治湿疹药物，具体为敷料，该药物的原料为桂花花提取物、氢化蓖麻油、苯氧乙醇和纯水，其中桂花花提取物的质量百分比浓度为0.01， PEG-40氢化蓖麻油的质量百分比浓度为0.01，苯氧乙醇的质量百分比浓度为0.3，余量为纯水，采用常规方法，将桂花花提取物、

13、氢化蓖麻油、苯氧乙醇分散在纯水中，制备成敷料。使用时，将无纺布用该药物打湿，将打湿后的无纺布敷于患处即可。 0027 实施例3 0028 一种防治湿疹药物，具体为乳液，其中桂花花提取物的质量百分比浓度为0.05，其余为辅料。具体为桂花花提取物0.05，尿囊素0.7，甘油5，鲸蜡醇5，角鲨烷5，说明书 2/15 页 4 CN 111184772 A 4 牛油果树果脂4，鲸蜡硬脂基葡糖苷3，余量为水。采用乳液常规的制备方法，将水、尿囊素和甘油混合溶解，加热至60-70，得到热水相；将桂花花提取物、鲸蜡醇、角鲨烷、牛油果树果脂和鲸蜡硬脂基葡糖苷

14、混合，加热至60-70融化，得到混合油相；在保持60-70温度，搅拌下，将热水相缓慢加入油相中，充分乳化均匀，放冷即得乳液。使用时，将乳液涂抹在患处即可。 0029 实施例4 0030 一种防治湿疹药物，具体为精华素，其中桂花花提取物的质量百分比浓度为 0.1，其余为辅料，具体为桂花花提取物0.1， D泛醇0.5，甘油辛酸酯1，甘油十一碳烯酸酯1，生育酚乙酸酯2，角鲨烷3，余量为油茶籽油。采用精华素的常规制备方法，将油茶籽油加热到60-70，将桂花花提取物、 D泛醇，甘油辛酸酯，甘油十一碳烯酸酯，生育酚乙酸酯，角鲨烷加入到油茶籽油中，

15、溶解混合均匀，冷却，制备成精华素。使用时，将精华素涂抹在患处即可。 0031 实施例5 0032 一种防治湿疹药物，具体为霜，其中桂花花提取物的质量百分比浓度为0.5，其余为辅料，具体为桂花花提取物0.5，苯氧乙醇0.5，尿囊素0.8，甘油10，鲸蜡硬脂醇2，鲸蜡醇5，羊毛脂8，聚山梨酯-80 8，白凡士林8，余量为纯水。采用霜常规的制备方法，将苯氧乙醇、尿囊素、聚山梨酯-80和甘油溶于70-80的纯水中，得到热水相；将鲸蜡硬脂醇、鲸蜡醇、羊毛脂和白凡士林混合，加热至70-80熔化，加入桂花花提取物至油相中，完全融化分散均匀后

16、，得到热油相。在搅拌的同时，将热水相缓慢加入到热油相中，充分乳化后，静置放冷即可。使用时，将霜制剂涂抹在患处即可。 0033 实施例6 0034 一种防治湿疹药物，具体为凝胶，其中桂花花提取物的质量百分比浓度为1，其余为辅料，具体为桂花花提取物1，甘油10，卡波姆8，氢氧化钠0.5，山梨酸钾3，余量纯水。采用凝胶常规制备方法，将桂花花提取物溶于甘油中，得到甘油相；另将卡波姆撒入纯水中，搅拌成透明状，得到卡波姆溶液。将溶有桂花花提取物的甘油相加入卡波姆溶液中，搅拌均匀，得到甘油卡波姆溶液。另将氢氧化钠和山梨酸钾用水溶解，得到碱液相。

17、在搅拌下，将碱液相加入至甘油卡波姆溶液中，继续搅拌至凝胶形成即可。使用时，将凝胶制剂涂抹在患处即可。 0035 实施例7 0036 一种防治湿疹药物，具体为面膜，其中桂花花提取物的质量百分比浓度为1.5，该药物的原料为桂花花提取物、 PEG-40氢化蓖麻油、苯氧乙醇、角鲨烷、甘油、纯水，其中桂花花提取物的质量百分比浓度为1.5， PEG-40氢化蓖麻油1.0，苯氧乙醇0.3，角鲨烷 4，甘油15，余量为纯水。采用常规方法，将桂花花提取物、 PEG-40氢化蓖麻油、角鲨烷混合加热至60-70，得到油相；将苯氧乙醇、甘油溶解在纯水中，加热至60

18、-70。得到水相。在搅拌下，将热水相加入到热油相中，继续搅拌均匀，放冷制备成面膜基料。将面膜基料浸润面膜纸，即得面膜。使用时，将面膜敷于患处即可。 0037 实施例8 0038 一种防治湿疹药物，具体为软膏，其中桂花花提取物的质量百分比浓度为2，其余为辅料，具体为桂花花提取物2，鲸蜡醇5，甘油10，白油40，余量为白凡士林，采说明书 3/15 页 5 CN 111184772 A 5 用软膏常规的制备方法，将鲸蜡醇，白油，白凡士林混合加热至70-80熔化，将桂花花提取物，甘油混合，加热至70-80，最后将甘油混合物在搅拌下缓慢加入凡士林

19、中，搅拌均匀后冷却至凝固，得到软膏制剂。使用时，将软膏制剂涂抹在患处即可。 0039 将桂花花提取物为活性成分制备的药物进行功能实验。 0040 一、桂花花提取物治疗婴儿湿疹的案例 0041 1.实验对象：婴儿湿疹患者。 0042 入选标准： 1)年龄02岁； 2)符合Williams诊断标准确诊为婴儿期AD(婴儿湿疹)； 3)根据SCORAD(severity scoring of atopic dermatitis)评分，选取得分小于50分的轻中度、无渗出的干性湿疹患儿； 4)患儿及家长自愿参加研究并签署知情同意书； 5)排除标准：合并各种急慢性感染，如流感、肺

20、炎、手足口病等；合并其他慢性全身性疾病，如高血压、糖尿病、甲状腺疾病、先天性心脏病、肾病、肿瘤性疾病等。 0043 2.实验方法 0044 1)临床资料收集：所有入组研究对象由家长填写调查问卷，收集儿童基本信息，如性别、年龄、补充维生素D情况、是否母乳喂养、每日户外活动时间、既往史、过敏性疾病家族史等。 0045 2)疾病严重程度评分：婴儿湿疹患儿按照欧洲特性性皮炎的SCORAD的评分系统进行严重程度评估，包括皮损面积(A)：头颈部为17，上肢各9，躯干前后各18，下肢各 12，以1的面积为1分；症状(B)：红斑/颜色加深、水肿/丘

21、疹、渗出/结痂、剥蚀、苔藓/痒疹、干燥共6项，若无上述症状记0分；若存在上述症状，可根据其严重程度记13分；主观评价(C)：瘙痒程度和影响睡眠程度，分别记010分，计分越高，程度越高。 SCORAD的评分按公式进行计算： SCORAD评分A/5+7B/2+C。 0046 SCORAD评分范围为0103分。在临床使用中，可以根据总分来确定疾病的严重程度：轻度湿疹： SCORAD评分小于25分；中度湿疹： SCORAD评分2550分；重度湿疹： SCORAD评分大于50分(中华医学会皮肤性病学分会免疫学组、特应性皮炎协作研究中心，中国特应性皮炎诊疗

22、指南(2014版)，全科医学临床与教育， 2014， 12(6):603-606)。 0047 3)治疗药物及周期： 0048 A.治疗药物：采用桂花花提取物的质量百分比浓度为0.5的霜。 0049 使用方法：涂于患者的患处，每天4次(早、中、晚、临睡前)，共14天。 0050 B.基础治疗保湿剂：以不含桂花花提取物的霜为保湿剂。 0051 使用方法：涂于患者的患处，每天4次(早、中、晚、临睡前)，共14天。 0052 C.阳性对照药物：用0.05地奈德乳膏(生产厂家：重庆华邦制药公司，批准文号：国药准字H20060725，规格： 0.0520g)。 0

23、053 使用方法：在皮损部位涂抹一薄层地奈德乳膏，然后，再涂抹基础治疗保湿剂，每天2次，共14天。 0054 4)观察指标 0055 分别观察治疗前后皮损面积、症状(红斑/颜色加深、水肿/丘疹、渗出/结痂、剥蚀、苔藓/痒疹、干燥)、瘙痒程度、影响睡眠程度和SCORAD评分。此外，对治疗后痊愈患者， 1周内进行随访，如随访时SCORAD评分高于治疗后SCORAD分评分，则视为复发。 0056 5)疗效标准说明书 4/15 页 6 CN 111184772 A 6 0057 采用皮损面积、症状、瘙痒程度、影响睡眠程度和SCORAD评分进行评定。 005

24、8 皮损面积改善率()(治疗前皮损面积-治疗后皮损面积)/治疗前皮损面积 100。 0059 症状改善率()(治疗前症状评分-治疗后症状评分)/治疗前症状评分 100。 0060 瘙痒程度改善率()(治疗前瘙痒程度评分-治疗后瘙痒程度评分)/治疗前瘙痒程度评分100。 0061 影响睡眠程度改善率()(治疗前影响睡眠评分-治疗后影响睡眠评分)/治疗前影响睡眠评分100。 0062 SCORAD评分改善率()(治疗前SCORAD评分-治疗后SCORAD评分)/治疗前 SCORAD评分100。 0063 痊愈： SCORAD评分改善率90，皮肤红疹、瘙痒、剥蚀等症状完全消失。 0064

25、显效： SCORAD评分改善率60，皮肤红疹、瘙痒、剥蚀等症状明显改善。 0065 有效： SCORAD评分改善率为2060，皮肤、红疹、瘙痒剥蚀等症状有所改善。 0066 无效： SCORAD评分改善率20，皮肤红疹、瘙痒、剥蚀等症状无改善，皮肤损伤甚至出现加重。 0067 3.实验结果 0068 A.轻中度两组的疗效比比较结果(表1)。 0069 表1两组临床疗效比较(例) 0070 0071 由表1可见，轻度患者经过14天的治疗，总有效率达100(痊愈20例，显效1例，有效1例)。中度患者经过14天的治疗，总有效率达100(痊愈14例，显效2例和有效

26、2例)。而仅采用基础治疗方案的轻度患者的有效率仅为30；而中度患者的有效率仅为12.5。可见，采用含有桂花提取物的制剂对婴儿湿疹的效果显著高于基础治疗。 0072 B.轻中度两组治疗前后各项指标比较结果(表2) 0073表2.轻中度两组治疗前后各项指标比较结果分) 说明书 5/15 页 7 CN 111184772 A 7 0074 0075 由表2可见，本发明治疗的轻度组，治疗前后皮损面积改善率为100，症状改善率为95.92，瘙痒程度改善率为100，睡眠影响程度改善率为95.31， SCORAD评分改善率为95.86，与基础+激素治疗轻度组比较，各指标的改善率(

27、97.92， 94.12， 97.92， 95.56， 94.95)没有显著性差异(P0.05)。 0076 本发明治疗的中度组，治疗前后皮损面积改善率为97 .04，症状改善率为 94.00，瘙痒程度改善率为96.25，睡眠影响程度改善率为94.05， SCORAD评分改善率为94.37，与基础+激素治疗的中度组比较，各指标的改善率(96.67， 92.31， 98.02， 95.23， 93.70)没有显著性差异(P0.05)。 0077 C.两组痊愈患者复发率比较结果。 0078 治疗结束后，对各组痊愈的患者跟踪观察1周的结果见表3。 0079 表3.两组痊愈患者复发率比

28、较结果 0080 0081 *由于仅采用基础护理组没有达到痊愈的病例，故无法计算其复发率。 0082 由表3可见，在轻中度组中，本发明的复发率(10.00， 21.43)明显都低于基础+ 激素治疗的复发率(33.33， 50.00)。 0083 D.不良反应 0084 两组治疗期间均未发现与本发明药物有关和可能有关的严重不良反应，轻中度各组中均有1例患者在使用药物后皮肤出现轻度发红现象，未经特殊处理， 24小时后症状消失。说明书 6/15 页 8 CN 111184772 A 8 0085 二、桂花花提取物提高机体免疫力的实验 0086 为了探究桂花花提取物治疗湿疹的原理，

29、本发明还进行了桂花花提取物提高机体免疫力的实验，具体为： 0087 1 材料和方法 0088 1.1 样品：桂花(Osmanthus fragrans(Thunb.)Lour.)花提取物，由发明人加工提供，常温下为黄棕色棕色半固体。 0089 1.2 实验试剂与仪器 0090 1.2.1 主要试剂 0091 本发现所用的主要试剂见表4。 0092 表4.主要试剂 0093 0094 1.2.2 主要仪器 0095 本发现所用的主要仪器见表5。 0096 表5.主要仪器 0097 说明书 7/15 页 9 CN 111184772 A 9 0098 0099 1.3 实验动物：由四

30、川省中医药科学院实验动物中心提供的昆明种小鼠160只，全雌，体重18g-22g，生产许可证号为： SCXK(川)2018-19， SPF级。饲料来源于邳州市小河科技有限公司，生产许可证号为：苏饲证(2014)03058。实验动物房为屏障系统，实验动物使用许可证号为： SYXK(川)2016-043。温度20-25，相对湿度40-70，明暗交替周期为12h。饲养期间，动物的进食行为和饮水行为自由充分、不受干扰，饮水和饲料均为无菌状态。 0100 2 实验方法 0101 2.1 剂量设计与分组 0102 动物适应性喂养3天，随机分为第一、二、三、四组，

31、每组40只(见表6)，其中：第一组用于ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验；第二组用于抗体生成细胞实验、血清溶血素测定和迟发性变态反应实验；第三组用于小鼠碳廓清实验；第四组用于脏器/体重比值和脾细胞的Treg/Th17比值分析。每组小鼠按体重随机分为溶剂对照组(金龙鱼食用调和油)和桂花花提取物低、中、高剂量组(50mg/kgBW、 150mg/kgBW、 450mg/kgBW)，小鼠按10mL/ kgBW每天一次经口灌胃，连续给予30天，每周称一次体重，根据体重变化调整灌胃体积。 0103 表6.动物实验剂量设计及分组说明书 8/15 页 10 CN 111

32、184772 A 10 0104 0105 2.2 脏器/体重比值 0106 末次灌胃后的次日，将第四组小鼠称体重，脱颈椎处死小鼠，无菌条件下迅速取出脾脏、胸腺，用滤纸吸去脏器外部污迹，电子分析天平称重。按下式计算相应的脏器系数。桂花提取物Osthin组的脏器系数高于溶剂对照组的脏器系数，可判定该项实验结果阳性。 0107 脏器系数脏器重量(g)/体重(g) 0108 2.3 ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验(MTT法) 0109 2.3.1 试剂配制 0110 RPMI1640完全培养液： RPMI1640培养液过滤除菌，用前加入10小牛血清， 1谷氨酰胺(200

33、mmol/L)，青霉素(100U/mL)，链霉素(100 g/L)及510-5mol/L的2-巯基乙醇，用无菌的1mol/L的HCl或1mol/L的NaOH调pH至7.0-7.2，即完全培养液。 0111 ConA液：用双蒸水配制成100 g/mL的溶液，过滤除菌，在低温冰箱(-20)保存。 0112 无菌Hanks液：用前以3.5的无菌NaHCO3调pH7.2-7.4。 0113 MTT液：将5mgMTT溶于1mL pH7.2的PBS中，现配现用。 0114 酸性异丙醇溶液： 96mL异丙醇中加入4mL 1mol/L的HCl，临用前配制。 0115 2.3.2 脾细胞

34、悬液制备 0116 末次灌胃后的次日，将第一组小鼠无菌取脾，在装有无菌Hank s液平皿中，用镊子将脾磨碎，制成细胞悬液， 200目筛过滤，用Hank s液洗2次，每次离心10min(1000r/min)，然后取沉淀悬浮于1mL的完全培养液中，台酚兰染色计数(应在95以上)。将细胞浓度调整为 3106个/mL。 0117 2.3.3 淋巴细胞增殖反应 0118 将每一份脾细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1mL，一孔加75 LConA液，另一孔作对照，置5CO2孵箱37培养72h。培养结束前4h，每孔轻轻吸去上清液0.7mL，加入 0.7mL不含小牛血

35、清的RPMI1640培养液，同时加入MTT(5mg/mL)50 L/孔继续培养4h，培养结束后，每孔加入1mL酸性异丙醇，使紫色结晶完全溶解，然后分装到96孔培养板，每孔做3个平行孔，用2010型酶标仪，在570nm波长测定光密度值。说明书 9/15 页 11 CN 111184772 A 11 0119 2.3.4 结果判定 0120 用加ConA孔的光密度值减去不加ConA孔的光密度值的差代表淋巴细胞的增殖能力。桂花花提取物组的光密度差值高于溶剂对照组的光密度差值，可判定该项实验结果阳性。 0121 2.4 迟发型变态反应(DTH，足跖增厚法) 0122 2

36、.4.1 绵羊红细胞(SRBC)细胞悬液制备 0123 取羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心(2000r/min)10min。将压积SRBC用生理盐水配成2(v/v)的细胞悬液， 0124 2.4.2 致敏 0125 小鼠用2(v/v)SRBC腹腔免疫，每只鼠注射0.2mL(约1108个SRBC)。 0126 2.4.2 DTH的产生与测定 0127 免疫4天后，测量左后足跖部厚度，然后在测量部位皮下注射20(v/v)SRBC，每只鼠20 L(约1108个SRBC)，注射后于24h测量左后足跖部厚度，同一部位测量三次，取平均值。 0128 2.4.3 结果判定 012

37、9 以攻击前后足跖厚度差值(足跖肿胀度)来表示DTH的程度。桂花花提取物组的厚度差值高于溶剂对照组的厚度差值，可判定该项实验结果阳性。 0130 2.5 抗体生成细胞检测(Jerne改良玻片法) 0131 2.5.1 制备补体 0132 采集豚鼠血，分离出血清(至少5只豚鼠的混合血清)，将1mL压积SRBC加入到5mL豚鼠血清中， 4冰箱放置30min，经常振荡，离心取上清，分装， -70保存；用时以SA缓冲液按 1:15稀释。 0133 2.5.2 玻片涂膜 0134 在清洁玻片上刷上一薄层琼脂糖(0.5g琼脂糖加双蒸水至100mL，加热溶解)，干后备用。 0135

38、 2.5.3 免疫动物 0136 每只鼠经腹腔注射0.2mL2(v/v)的SRBC细胞悬液，约2108个SRBC。 0137 2.5.4 脾细胞悬液制备 0138 将免疫45天后的小鼠颈椎脱臼处死，取出脾脏，放在盛有Hank s液的平皿内，磨碎脾脏，制成细胞悬液，经200目筛网过滤，离心(1000r/min)10min，用Hank s液洗2遍，最后将细胞悬浮在5mL RPMI1640培养液中，台酚兰染色计数(应在95以上)，并将细胞浓度调整为5106个/mL，制成脾细胞悬液。 0139 2.5.5 空斑的测定 0140 将琼脂糖配制成1水溶液，水浴，温度45，

39、与等量双倍浓度Hank s液混合，分装小试管，每管0.5mL，再向管内加10(用SA缓冲液配制)压积SRBC 50 L，脾细胞悬液各20 L 做两个平行样，迅速混匀后，倾倒于琼脂糖薄层玻片上，待琼脂凝固后，将玻片水平扣放在片架上，放入二氧化碳培养箱中孵育1.5h，然后将补体加入到玻片架凹槽内，继续温育 1.5h，计数溶血空斑数。 0141 2.5.6 结果判定说明书 10/15 页 12 CN 111184772 A 12 0142 用空斑数/106脾细胞来表示。桂花花提取物组的溶血空斑数高于溶剂对照组的溶血空斑数，可判定该项实验结果阳性。 0143 2.

40、6 血清溶血素测定(血凝法) 0144 2.6.1 免疫动物及血清分离 0145 每只小鼠腹腔注射2(v/v)SRBC 0.2mL免疫，继续灌胃5天后，摘除眼球取血于离心管内，放置1h后， 2000r/min离心10min，收集血清，用生理盐水将血清作倍比稀释，每份稀释12孔，将不同稀释度的血清置于血凝板中，每孔100 L，再加入0.5SRBC悬液100 L，混匀，置湿盒373h后观察结果，记录每孔的凝集程度。 0146 2.6.2 结果判定 0147 血清凝集程度一般分为5级(0-IV)记录，按下式计算抗体积数。桂花花提取物组的抗体积数高于溶剂对照组的抗体

41、积数，可判定该项实验结果阳性。 0148 抗体水平(S1+2S2+3S3nSn) 0149 式中1、 2、 3n代表对倍稀释的指数， S代表凝集程度的级别，抗体积数越大，表示血清抗体越高。 0150 0级：红细胞全部下沉，集中在孔底部形成致密的圆点状，四周液体清皙。 0151 I级：红细胞大部分沉集在孔底成园点状，四周有少量凝集的红细胞。 0152 II级：凝集的红细胞在孔底形成薄层，中心可以明显见到一个疏松的红点。 0153 III级：凝集的红细胞均匀地铺散在孔底成一薄层，中心隐约可见一个小红点。 0154 IV级：凝集的红细胞均匀地铺散在孔底成一薄层，凝块有时

42、成卷折状。计算抗体积数。 0155 2.7 小鼠碳廓清实验 0156 2.7.1 溶液配制 0157 注射用墨汁：将印度墨汁原液用生理盐水稀释5倍。 0158 Na2CO3溶液：取0.1g Na2CO3，加蒸馏水至100mL。 0159 2.7.2 注射墨汁 0160 按体重从小鼠尾静脉注射稀释后的印度墨汁(按0.1mL/10g)，墨汁注入后立即计时。 0161 2.7.3 测定 0162 于注入墨汁后第2、 10min分别从内眦静脉丛取血20 L，加到2mL Na2CO3溶液中，以 Na2CO3溶液作空白对照，用723分光光度计在600nm处测定光密度值(OD)。 016

43、3 取血后将小鼠处死，取肝脏和脾脏，用滤纸吸干脏器表面血污，分别称重。 0164 2.7.4 结果判定 0165 以吞噬指数表示小鼠碳廓清的能力。按下式计算吞噬指数a。桂花花提取物组的抗体积数高于溶剂对照组的抗体积数，可判定该项实验结果阳性。 0166 K(lgOD1lgOD2)/(t2t1) 0167 吞噬指数a体重/(肝重+脾重)K1/3 0168 2.8 数据处理及结果判定 0169实验数据的结果用均数标准差来表示，运用SPSS 25.0软件进行统计分析，多组独立样本均数检验用单因素方差分析(即one-way ANOVA)。分析前先进行方差齐性说明书 11/15

44、页 13 CN 111184772 A 13 检验，如果方差齐，则计算F值，当P0.05时表示各样本均数差异无统计学意义；当P0.05 时表示各样本均数差异有统计学意义，并采用Dunnett-t检验进行桂花花提取物各剂量组与溶剂对照组的两两比较。如果方差不齐或数据为呈非正态分布，则用秩和检验进行分析。 0170 细胞免疫和体液免疫功能测定中的两个实验结果均为阳性，或任一个实验的两个剂量组结果阳性，可判定相应免疫功能测定结果阳性；桂花花提取物在细胞免疫功能、体液免疫功能和单核-巨噬细胞系统碳廓清功能三个方面任两个方面结果阳性，可判定桂花花提取物具有增强免疫力的作用

45、。 0171 3 实验结果 0172 3.1 桂花花提取物对小鼠体重的影响 0173 由表7可见，第一、二、三、四组动物的初始体重均衡(P0.05)；第一、二、三、四组各剂量组动物的初始体重基本一致。饲养期间各组小鼠体重呈增长趋势，但在整个实验期间每组小鼠各剂量组体重的增长无统计学意义(P0.05)。因此，实验小鼠的体重不受桂花花提取物的影响。 0174表7.桂花花提取物对小鼠体重的影响n10) 0175 说明书 12/15 页 14 CN 111184772 A 14 0176 注：表7中1、 2、 3、 4分别为第一、二、三、四组； A、 B、 C、

46、D分别代表溶剂对照组、桂花花提取物低剂量组(50mg/kgBW)、桂花花提取物中剂量组(150mg/kgBW)、桂花花提取物高剂量组(450mg/kgBW)。 0177 3.2 桂花花提取物对小鼠脏器系数的影响 0178 与溶剂对照组相比，各剂量组小鼠的胸腺系数增加(F8.440， P0.01)；其中，桂花花提取物低、中、高剂量组的胸腺系数均高于溶剂对照组的胸腺系数(P0.05或P 0.01)，桂花花提取物高剂量组的胸腺系数为0.500.08(P0.01)。与溶剂对照组相比，各剂量组小鼠的脾脏系数增加(F4.710， P0.01)；其中，桂花花提取物高剂量组的

47、脾脏系数高于溶剂对照组的脾脏系数(P0.05)，桂花花提取物高剂量组的脾脏系数为0.440.08 (见表8)。可见小鼠灌胃桂花花提取物后能有效地增加各剂量组小鼠脏器系数，提示桂花花提取物对胸腺和脾脏具有保护作用。 0179表8.小鼠脏器系数n10) 0180 0181 注： *P0.05(与溶剂对照组比较)； *P0.01(与溶剂对照组比较)。 0182 3.3 桂花花提取物对ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验的影响 0183 根据表9的结果，与溶剂对照组相比，各剂量组小鼠的光密度差值增大(F5.991， P0.01)；其中，桂花花提取物中、高剂量组的光密度差与溶剂对照组相

48、比差异具有统计学意义(P0.05或P0.01)，并呈现一定的量效关系，桂花花提取物高剂量组的光密度差值为0.300.06(P0.01)。表明桂花花提取物能提高小鼠的淋巴细胞增殖能力。 0184表9.桂花花提取物对ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验的影响n10) 0185 0186 注： *P0.05(与溶剂对照组比较)； *P0.01(与溶剂对照组比较) 说明书 13/15 页 15 CN 111184772 A 15 0187 3.4 桂花花提取物桂花花提取物对小鼠迟发型变态反应(DTH)的影响 0188 结果如表10所示，与溶剂对照组相比，各剂量组小鼠的厚度差值(mm)随着剂

49、量的增加而增加(F4.213， P0.05)；其中，桂花花提取物高剂量组的厚度差值与溶剂对照组的厚度差值相比差异具有统计学意义(P0.01)桂花花提取物高剂量组的厚度差为1.25 0.16，由此可见，桂花花提取物对小鼠由绵羊红细胞攻击产生的迟发性变态反应在24h内有增强作用。 0189表10.桂花花提取物对小鼠迟发型变态反应(DTH)的影响n10) 0190 0191 注： *P0.01(与溶剂对照组比较) 0192 3.5 桂花花提取物对抗体生成细胞的影响 0193 如表11，与溶剂对照组相比，各剂量组小鼠的溶血空斑数呈升高趋势(F5.192， P 0.01)；其中，桂

50、花花提取物中、高剂量组的溶血空斑数与溶剂对照组的溶血空斑数比较有差异(P0.05或P0.01)，桂花花提取物高剂量组的溶血空斑数达到298.7543.40(P 0.01)，表明桂花花提取物能使抗体生成细胞数增加。 0194表11.桂花花提取物对抗体生成细胞的影响n10) 0195 0196 注： *P0.05(与溶剂对照组比较)； *P0.05)。 0199表12.桂花花提取物对小鼠血清溶血素的影响n10) 说明书 14/15 页 16 CN 111184772 A 16 0200 0201 3.7 桂花花提取物对小鼠单核-巨噬细胞碳廓清功能的影响 0202 桂花花提取物能增强小鼠单核