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一种用于空间代谢组学分析的叶片和/或花瓣样本制备方法、样本压制装置及应用与流程

花匠小妙招
2024-12-26 23:11

本发明属于组织样本处理，涉及一种用于空间代谢组学分析的叶片和/或花瓣样本制备方法、样本压制装置及应用。

背景技术：

1、质谱成像技术发展十几年来，已经相对成熟，且基于质谱成像技术，也已发展提出空间代谢组（spatial metabolomics）的概念，突破传统代谢组研究损失空间信息的瓶颈，可对不同组织器官中的代谢物进行定性、定量、定位三个维度的分析。空间代谢组学广泛应用于临床医学、植物科学、药物研发等生命科学领域，为传统代谢组学分析提供了全新的可视化视角和多维的信息深度。

2、但目前已报道的空间代谢组学相关研究进展，大部分集中在基于动物样本的研究，小部分基于可切片的植物样本研究，如根茎、种仁等，对于植物叶片花瓣因表皮蜡或绒毛，既不可切片又不可直接成像扫描的样本，目前主流的方式是植物印迹成像于膜材上，通过扫描印迹后的膜材展开成像研究。印迹效果受阻于细胞内容物转移效率及空间分布位移等问题。故目前已报道的植物叶片成像分析研究进展，远不及动物组织成像研究提供到的明显的空间分布层级效果。故发明一种应用于空间代谢组学质谱成像分析的植物叶片及花瓣前处理方法有其必要性。

技术实现思路

1、为了解决现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种用于空间代谢组学分析的叶片和/或花瓣样本制备方法、样本压制装置及应用。

2、本发明提供的是一种适用空间代谢组学植物叶片和/或花瓣样本简单快速质谱成像的前处理方法，对叶片和/或花瓣的处理方法简单可靠，可保证叶片和/或花瓣的细胞内容物的全面暴露，且完全不受叶片和/或花瓣是否具表皮蜡或是否具绒毛影响，实现对叶片和/或花瓣直接进行成像扫描。

3、本发明提供了一种适用空间代谢组学植物叶片和/或花瓣样本简单快速质谱成像的前处理方法，包括如下步骤：

4、步骤一、将叶片和/或花瓣固定于多孔物质性缓冲材料上；

5、步骤二、固定有叶片和/或花瓣的缓冲材料置于可覆盖叶片和/或花瓣的两块硬质材料之间；所述硬质材料的尺寸一般需要大于所述缓冲材料的尺寸；

6、步骤三、以程序压强印压上下两块硬质材料，在多孔物质性缓冲材料上透印叶片和/或花瓣轮廓后停止印压；所述透印是指缓冲材料上印出叶片和/或花瓣整体轮廓,并且边缘及主要叶脉/脉络清晰；

7、步骤四、取出压制完成后固定有叶片和/或花瓣的缓冲材料，完整地将叶片和/或花瓣与缓冲材料分开；

8、步骤五、将叶片和/或花瓣固定至样品玻片上，获得最终用于空间代谢组学分析的叶片和/或花瓣样本。

9、在步骤五中的叶片和/或花瓣样本获得后，可以直接对已细胞破裂的叶片和/或花瓣进行afadesi空间成像扫描分析。

10、缓冲材料的种类、其自身的结构等对于叶片和/或花瓣处理后的完整性有一定影响，一般来说，缓冲材料的孔数越多越致密，越有利于压印后获得效果好的叶片和/或花瓣样品，在具体实施过程中，所述缓冲材料推荐但不限于以下多孔物质性材料：棉布、尼龙网布、多孔聚四氟乙烯（ptfe）等；

11、所述多孔聚四氟乙烯的厚度为0.5mm，表观密度为2.1-2.3 g/cm3，拉伸强度≥14.0 mpa/min，断裂拉伸率≥150%；

12、所述棉布的支数为40~80支；优选地，所述棉布的支数为80支；

13、所述尼龙网布的目数为100~300目；优选地，所述尼龙网布，目数为150目。在实际使用过程中，当尼龙网布的目数大于150目后，不同目数的尼龙网布的压印效果区别不大，并不限制使用300目的尼龙网布。

14、在本发明的实际实施过程中，尼龙网布的压印效果相对更好。

15、步骤一中，所述叶片包括绒毛叶片、蜡质叶片、革质叶片等；

16、所述花瓣包括绒毛花瓣、蜡质花瓣等；

17、步骤一中，可以通过透明或者半透明粘性材料，例如透明胶、双面胶等材料将叶片和/或花瓣固定在缓冲材料上；

18、步骤二中，所述硬质材料包括铝板、铁板、木板、塑料板等；所述铝板、铁板的厚度为3-5mm，所述塑料板、木板的厚度为5-8mm；

19、步骤三中，印压压强及时间对叶片和/或花瓣细胞破裂程度及完整性均有影响，程序压强针对不同叶片类型推荐如下程序但不限于以下程序，可以根据实际使用时的叶片和/或花瓣状态进行进一步调整：

20、绒毛叶片：初始压强2.5 mpa，保持1~2 min，以2 mpa/min的增加速率升至8 mpa，保持1~2 min，透印后立即释放压力；

21、蜡质叶片：初始压强2.5 mpa，保持2~3min，以2 mpa/min的增加速率升至8 mpa，保持2~3 min，透印后立即释放压力；

22、革质叶片：初始压强3 mpa，保持2~3min，以2 mpa/min的增加速率升至10 mpa，保持2~3 min，透印后立即释放压力；

23、绒毛花瓣、蜡质花瓣：初始压强2.5 mpa，保持2~3min，以2 mpa/min的增加速率升至6 mpa，保持2~3 min，透印后立即释放压力；

24、在多孔物质性缓冲材料上透印叶片和/或花瓣轮廓后停止印压的操作流程，整个过程简称“拓印”。

25、本发明还提供了一种叶片和/或花瓣样本压制装置，能够用于实现上述制备方法，所述样本压制装置包括：叶片和/或花瓣固定机构、叶片和/或花瓣夹持机构、拓印印压机构、叶片和/或花瓣剥离机构、叶片和/或花瓣粘合机构；

26、所述叶片和/或花瓣固定机构用于通过透明或半透明状粘性材料将叶片和/或花瓣固定在缓冲材料上；

27、所述叶片和/或花瓣夹持机构用于将固定有叶片和/或花瓣的缓冲材料夹持在两块硬质材料之间；

28、所述拓印印压机构用于对放置有叶片和/或花瓣的硬质材料施加程序压强；

29、所述叶片和/或花瓣剥离机构用于将压印完成的叶片和/或花瓣从缓冲材料上剥离；

30、所述叶片和/或花瓣粘合机构用于将剥离后的叶片和/或花瓣粘合到样品玻片上。

31、所述拓印压印机构是本发明中较为重要的样品制备机构，进一步包括：由侧壁和装置底板共同形成的样品容纳腔、压印盖、卡位块；

32、所述样品容纳腔用于放置待压印的夹持有固定着叶片和/或花瓣的缓冲材料的硬质材料；

33、所述侧壁的内部设置有连续的内螺纹；

34、所述装置底板连接有压力传感器，用于检测拓印压力；

35、所述装置底板的上表面十字设置有两条相互垂直的凹槽；

36、所述压印盖包括上下两层结构，下层结构的侧壁设置有与所述内螺纹匹配的外螺纹；上层为直径稍小的筒状结构，所述筒状结构的中间部分镂空，减小所述压印盖的重量和材料需求，所述上层的筒壁上部设置有圆柱形的连接孔，用于和外部的旋转机构连接，通过所述旋转结构转动所述压印盖，将所述压印盖逐渐旋入所述样品容纳腔中，固定并向底部缓慢施压，对放置于所述样品容纳腔中的样品施加程序压强；

37、所述卡位块的上部为长方形，下部为类梯形，其厚度与所述装置底板上的凹槽宽度匹配，所述凹槽中设置有与所述卡位块下部类梯形形状匹配的卡位结构；当所述卡位块在所述凹槽中竖向放置时，即卡位块的长边指向所述装置底板的圆心时，可以在所述凹槽中自由滑动，当所述卡位块需要将放置在所述样品容纳腔中的样品卡位固定时，所述卡位块沿凹槽移动到所述样品的边缘，并旋转90°，使所述卡位块固定在所述凹槽中，进而固定样品。

38、本发明还提供了上述样本制备方法，或上述样本压制装置在空间代谢组学叶片和/或花瓣样品快速制备中的应用。

39、本发明的有益效果包括：

40、(1)本发明提供了一种新的空间代谢组学叶片和/或花瓣制备方法，简单可靠稳定，在样品制备完成后可直接扫描叶片和/或花瓣，更能反应叶片和/或花瓣中真实的代谢物空间分布，可用于空间代谢组学质谱成像的植物叶片和/或花瓣检测分析。

41、(2)本发明因采用拓印后取植物叶片和/或花瓣直接扫描的方式，避免印迹方式因叶片和/或花瓣结构，印迹到膜材上的主要是脉络，且叶片和/或花瓣印压过程细胞破碎不完全，物质转移到膜材上的效率不均一，转移后也易出现扩散，导致成像叶片和/或花瓣轮廓模糊的问题。

42、(3)本发明选择拓印的方式破碎叶片和/或花瓣细胞，暴露细胞内容物，选择多孔物质性材料对拓印过程进行缓冲，细胞破碎的同时，保护叶片完整性。