用于鉴定Me毒性根结线虫的LAMP引物组及其方法与流程

• 花匠小妙招
• 2025-01-05 14:50

本发明属于分子生物学的技术领域，更具体地，涉及一种用于鉴定me毒性根结线虫的lamp引物组及其方法。

背景技术：

根结线虫(meloidogynespp.)的寄主范围很广，超过3000种植物，其危害遍及粮食作物和蔬菜等，尤其以茄科、葫芦科、十字花科植物等最为严重。最常见的为南方根结线虫(m.incognita)、爪哇根结线虫(m.javanica)、花生根结线虫(m.arenaria)、和北方根结线虫(m.hapla)。

根结线虫侵染植物的危害主要表现为两个方面：一方面根结线虫在植物的根系上形成根结，从而破坏水分和养分的吸收能力，导致减产在这种情况下其危害与线虫的密度紧密相关。另一方面根结线虫与其他的病原物发生联合侵染，形成复合病害加重对寄主的危害。在根结线虫侵染时造成的伤口有利于疫病、枯萎病、及立枯病菌的侵染，在这种情况下根结线虫往往很小的群体就可以造成严重的危害。植物寄生性线虫每年造成的很大的损失，南方根结线虫几乎侵染所有的栽培植物。在感病番茄上至少要造成50％以上的损失，甚至绝产。控制根结线虫病的主要途径有选育抗病品种、实施轮作和施用杀线虫剂等等。利用抗线虫品种是控制根结线虫最有效的策略，具有安全、经济、高效等特点。植物抗根结线虫的基因中研究较多的是番茄抗根结线虫的mi基因及辣椒中的me3基因，这两个基因均是单显性基因，已经被定位于番茄第6号染色体及辣椒的第9号染色体上，这些抗性基因可以对植物提供有效的保护，防御根结线虫的侵染及危害。

在一年生野生辣椒及其近缘种中，已经发现了大约有100份材料对根结线虫具有抗性，其中绝大多数都抗南方根结线虫。我国的辣椒资源丰富，但是缺乏系统的材料抗性鉴定，目前只有一个抗根结线虫基因被报道(通过报道已经证实，在茄科植物中抗植物寄生性线虫的r基因中nbs-lrr结构为共同的保守区域，包括mi-1,heroa,gpa2,gro1,andma等均属于nbs-lrr基因家族。一个主要的抗根结线虫基因me存在于在辣椒中，应用双单倍体辣椒株系me基因已经发现，其中有6个为抗性热稳定型基因，并且它们的基因簇被定位于p9染色体上，属于同一个基因簇，基因组范围内从0-28cm，且这些基因与抗细菌的bs2抗细菌属于同一簇。其中，me3基因的抗性广谱，抗三种主要的根结线虫南方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫。

随着抗线虫品种的推广，根结线虫新的变异群体的快速出现，可以克服植物的抗性，这种新的线虫类型被称作“毒性线虫”。虽然抗性品种在农业生产上应用不断增加，但是植物寄生性线虫的危害仍然很高，其中一个重要的原因就是毒性线虫的产生及扩展。在番茄及辣椒中的根结线虫毒性群体已在世界范围内多次报道。me毒性南方根结线虫是指能够克服辣椒中me3基因抗性的南方根结线虫，它们可以侵染含有me3抗性基因的辣椒品种，并成功寄生繁殖，而非毒性南方根结线虫则不能在me3抗性基因的辣椒寄生繁殖。在番茄、马铃薯、棉花、桃、鹰嘴豆、咖啡等其他作物中也发现了能够克服抗根结线虫基因的毒性线虫，如番茄上能够克服mi基因抗性的mi毒性根结线虫，鹰嘴豆上能够克服rk基因抗性的rk毒性线虫，野生马铃薯上能克服rmc2基因抗性的rmc2毒性线虫，以及能克服咖啡mex-1基因的mex毒性线虫等。毒性线虫不但能够成功克服抗线虫基因，而且在侵染及适应性等方面都表现出了较强的竞争优势，相对于普通自然群体线虫，毒性线虫侵染快、繁殖快等特点，而且毒性线虫的特征可以稳定的遗传给后代。南方根结线虫毒性群体的发生，使南方根结线虫的防治更加困难，因此对于线虫毒性群体和无毒性群体的快速鉴定，有助于了解毒性线虫的发生规律，并对抗性品种布局及线虫防治至关重要。

根结线虫的毒性群体与无毒群体在形态上的差异并不明显，但在基因遗传上存在显著的差异，因此采用快速、高效而准确的分子标记技术来鉴定毒性与非毒性线虫是急需且非常必要的。根结线虫以无性生殖方式为主，转位因子、染色体重排或者染色体组型的变异等是毒性变异的来源，目前已有很多分子标记技术如rapd、aflp、issr、ssr等用于特异的毒性线虫分子标记的挖掘利用，如针对mi毒性线虫的分子多态性研究相应的展开，发现了许多与mi毒性相关的分子标记，为毒性线虫的鉴定及抗性基因的持久利用奠定了基础，针对me毒性线虫也报道了检测scar标记。

目前已有报道关于毒性线虫的检测方法，均是基于特异性引物，利用pcr技术对毒性线虫进行分子鉴定的方法，该方法具有准确、灵敏的优点，但仍然存在着一定的限制。比如需要用精密的pcr仪，检测过程复杂、时间较长，结果必须通过琼脂糖凝胶电泳及成像系统，并结合基因测序技术才可以判定，这些技术在科学研究中可以应用，但是不能满足快速检疫以及田间监测的需求。关于毒性根结线虫的lamp检测技术仍然没有相关报道。

环介导恒温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplication,lamp)是2000年开发的一种新型循环恒温扩增技术，该技术具有特异性强、灵敏度高、扩增速度快、对实验设备要求低，以及检测结果易于观察等特点。

目前关于毒性线虫的lamp检测仍然没有相关的研究及报道，特别是针对辣椒上me毒性线虫的lamp检测技术急需解决。

技术实现要素：

为了解决现有技术的问题，本发明的目的在于提供一种于鉴定me毒性根结线虫的lamp引物组及其方法。

本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种用于鉴定me毒性根结线虫的lamp引物组，该引物组包括如seqidno.1所示的外侧正向引物，如seqidno.2所示的外侧反向引物，如seqidno.3所示的内侧正向引物，如seqidno.4所示的内侧反向引物。

本发明还提供了含有所述lamp引物组的用于鉴定me毒性根结线虫的试剂盒。

进一步的，所述试剂盒还包括引物dntps、bst、dna聚合酶、扩增缓冲液中的一种或多种。

本发明还提供了一种鉴定me毒性根结线虫的lamp方法，该方法包括以下步骤：

(1)提取待测线虫的dna；

(2)以步骤(1)提取的dna为模板，使用所述的引物组进行lamp扩增反应，得到lamp反应产物；

(3)在lamp反应产物中加入显色剂，混匀后观察颜色变化，如有颜色变化，则该待测线虫鉴定为me毒性根结线虫。

进一步的，步骤(2)中，每25μl的lamp扩增反应体系中，含有外侧正向引物和外侧反向引物各0.5pmol，内侧正向引物和内侧反向引物各4pmol。

进一步的，步骤(2)中，lamp扩增反应条件为：62-66℃保温30-90min，82℃保温5-10min。

进一步的，步骤(3)中，显色剂为sybrgreeni，如果溶液变为绿色，该待测线虫鉴定为me毒性根结线虫。

本发明还提供了所述的引物组或所述的试剂盒在制备检测me毒性根结线虫制剂中的应用。

本发明的有益效果：

(1)本发明是基于特有的序列片段设计特定的lamp引物组，在6个位点设计出4对特异性引物用于me毒性根结线虫的鉴定，检测效果准确且稳定。

(2)本发明含有lamp引物组的试剂盒适合在田间及现场直接操作，不需要pcr仪器及凝胶检测等复杂的仪器设备，只需要试剂盒并按照步骤即可实现鉴定。而且样品分离中不需要显微镜等仪器进行线虫分离鉴定，重点针对田间直接取样、现场操作、鉴定结果灵敏且可以通过肉眼直接判断，因此本发明检测方法的实用性强，可满足对发病植物组或是土壤样品中存在的根结进行现场快速检测和鉴定的需要。

(3)应用本发明的检测方法，对发病的植物的根系及土壤样品中的南方根结线虫现场直接进行取样操作，不需要专业的分子生物学技术，以及显微镜等高级仪器配合线虫分离技术要求，而且一般整个检测过程在1小时内即可以完成，比常规的pcr检测节省大量的时间。相比较现有的pcr检测方法，本发明的检测方法具有较好的特异性、实用性、操作简便且快速性等特点，适合在田间及现场直接检测应用。

附图说明

图1为南方根结线虫侵染辣椒hda149后的根部症状；其中，a为me毒性南方根结线虫侵染辣椒hda149的根部症状，b为非me毒性线虫侵染辣椒hda149的根部症状。

具体实施方式

以下将对本发明的具体实施方式进行详细的说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

实施例中所使用的仪器和试剂均可以通过购买市售产品的方式获得。

实施例1me毒性南方根结线虫的dna提取及lamp反应体系优化

1、me毒性南方根结线虫的dna提取

me毒性南方根结线虫的dna提取方法参考王江岭等(2011)的方法并略加改动，挑取单头的me毒性根结线虫(根结线虫来自于中国农业科学院蔬菜花卉研究所)，放入10μlddh2o的0.2ml的pcr管中，加入7μl的线虫裂解溶液(20mmtris-hcl(ph8.3)、1.5mmmgcl2、60mmkcl，10mg/mltritonx-100、0.2mmddt)及3μl的蛋白酶k(2mg/ml)在65℃条件温浴45min，95℃下10min，然后冷却至室温静置5min，然后吸取上清液即可以作为dna模板。

2、特异性lamp引物设计

利用引物mef(5’-cttacaacgccgctctgaat-3’)、mer(5’-cgactcctataggggcgaat-3’)，扩增me毒性根结线虫的特有序列。反应体系为：dna模板1μl(50ng)，10×pcrbuffer(+mg2+)50μl，250μmol·l-1dntps2μl，引物p46f/r各1μl(0.3μmol·l-1)，taq酶0.5μl(3u)，采用灭菌的双蒸水补足50μl。pcr扩增退火温度为55℃。pcr反应程序为：94℃4min；94℃30s，55℃1min，72℃1.5min，35个循环；72℃10min。pcr产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，并送交上海生工生物有限公司进行测序，获得776bp的序列，如seqidno.5所示。在genebank数据库中进行blast对比发现获得靶标序列与me毒性根结线虫的特有序列jx258155相似度达到100％。

本发明主要是针对靶基因3’端的f3c、f2c和flc区以及5’端的bl、b2和b3区等6个不同的位点设计4-6种引物：

设计的lamp反应引物分别为：

mef3(外侧正向引物)：5’-ggtagatgctatgggaaca-3’(seqidno.1)；

meb3(外侧反向引物)：5’-atcgaacgtaatcgacaatg-3’(seqidno.2)；

mefip(内侧正向引物)：5’-ggaaagtctgccgccattag-gattggggtgtaatgcgt-3’(seqidno.3)；

mebip(内侧反向引物)：5’-aagggatttcgggattgatttgatt-aaagtgtaacggccactg3’(seqidno.4)；

3、lamp反应检测及优化

在0.2ml的离心管中分别取引物溶液、扩增缓冲液、dna模板，用灭菌双蒸水配置反应体系，具体为：扩增缓冲液2.5μl(包含20mmtris-hcl、10mm(nh4)2so4、10mmkcl、8mmmgso4、0.1％tritonx-100)、10μmdntps3.5μl、5μm甜菜碱4.0μl，lamp引物溶液(外侧引物mef3/meb30.2μm、内侧引物mefip/mebip1.6μm)2.5μl，bst2.0dna聚合酶1.0μl，dna模板1.0μl，灭菌双蒸水补全到25μl。反应中以清水作为阴性对照。

lamp反应程序为62-66℃保温30-90min，95℃保温5-10min。

lamp反应程序后产物中加入显色剂sybrgreeni1000倍稀释液2μl，混匀后肉眼直接观察颜色变化。在lamp反应离心管中me毒性根结线虫反应溶液显色后呈现为明亮的绿色，而阴性对照反应液仍然为原反应溶液颜色(透明的浅棕黄色)没有转变为绿色。

在反应条件优化中，发现扩增温度在62-66℃时，且保温30-90min时，检测结果没有显著差异。所以基于简便高效及稳定的原则将扩增温度在65℃时，保温45min。

实施例2lamp反应灵敏度及特异性检测

参照实施例1中的方法提取单头me毒性根结线虫的dna，依次稀释，梯度为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，分别取上述稀释的dna1μl为模板，按照实施例1的优化体系进行lamp检测，并以双蒸水作为阴性对照。同时采用相同量的dna为模板按照实施例1的反应程序进行pcr检测，并采用凝胶电泳检测扩增条带。结果表明采用lamp方法检测到的模板浓度级别为10-4级别，而采用pcr方法检测的反应浓度为10-2，也就是说明lamp方法的检测灵敏度是pcr反应的100倍。

参照实施例1中的方法提取单头me毒性根结线虫(meloidogyneincongnita)、南方结线虫非毒性线虫(meloidogyneincongnita)、爪哇根结线虫(meloidogynejavanica)、象耳豆根结线虫(meloidogyneenterolobii)、花生根结线虫(meloidogynearenaria)的dna，这些线虫均为我国的主要线虫类型，本发明采用的线虫种类均来自中国农业科学院蔬菜花卉研究所病害实验室提供。按照实施例1的lamp反应体系进行lamp检测，并以双蒸水作为阴性对照进行检测，每个线虫种类重复3次检测。结果表明只有me毒性根结线虫在lamp检测反应中呈现出了明亮的绿色，其他几种线虫均与阴性对照相同，仍然呈现为透明的浅棕黄色。这个结果证实本发明中检测me毒性南方根结线虫的lamp引物组、试剂盒及其方法可以有效的检测鉴定me毒性南方根结线虫，可以用于鉴定区分其他常见线虫种类，检测具有特异性和准确性。

实施例3me毒性南方根结线虫lamp检测试剂盒及技术田间应用验证

分别从前往河北廊坊、北京顺义、河南新乡等地，针对根结线虫发生田块，分别采集根系上的根结或是土壤中的卵块。在北京顺义从番茄根系上采集到根结及卵块进行检测(样品编号sy-123)；在河北廊坊采集到辣椒上的根结及卵块进行检测(样品编号lf-123)；在河南新乡采集到黄瓜根系上的根结及卵块(样品编号xx-123)。每个地点的样品重复三次。

按照lamp检测方法及试剂盒对样品进行现场检测，同时以双蒸水作为阴性对照进行检测。操作程序如下：

(1)从发病植株根部根结或是卵块中提取dna样品

从根结线虫发病的植株根部冲洗干净，剪取新鲜的小根结(长度1-2mm)1个，放入装有48.0μlla缓冲液的1.0ml离心管中，采用一次性塑料研磨棒磨碎根结，加入2.0μl的lb提取液，继续研磨1-2min，然后离心管放在65℃热水袋上保温45min，然后95℃热水袋上保温10min，然后冷却至室温静置5min，然后吸取上清液即为dna模板。

(2)lamp反应检测

在0.2ml的反应管中分别加入实施例1中lamp检测试剂盒中的引物溶液、扩增混合液，以及步骤(1)提取的dna模板，用灭菌双蒸水配置反应体系25.0μl。具体为：lamp引物溶液2.5μl、扩增混合液11.0μl、dna模板1.0μl、灭菌双蒸水补全到25μl。

将步骤(2)中的lamp反应管在62-65℃的热水袋上保温45min，95℃的热水袋保温5-10min，然后自然冷却至室温。然后在lamp反应液中加入显色剂sybrgreeni1000倍稀释液2μl，轻轻摇匀1-2min，混匀后肉眼直接观察颜色变化。

(3)结果鉴定

检测结果证实发现只有在河北廊坊辣椒采集到样品中有一个样品lf-1呈现出了阳性反应，lamp检测管中样品呈现为绿色，证实其为me毒性南方根结线虫，而其他8个样品来自河北廊坊、北京顺义、河南新乡等地样品(lf-2、lf-3、sy-1、sy-2、sy-3、xx-1、xx-2、xx-3)均呈现为阴性反应。

(4)检测结果验证

将各地采集到的样品中的根结线虫卵块进行扩繁，然后分别接种到含有抗线虫基因me的辣椒材料hda149上，检测结果如图1所示。根据图1的结果，发现只有lf-1样品中扩繁的根结线虫可以成功的侵染辣椒hda149，说明该线虫可以克服辣椒的抗性，为me毒性南方根结线虫，各个样品的lamp检测结果与实际结果是相符的。同时我们将在hda149上繁殖的线虫采用本发明的lamp的试剂盒及检测方法进行检测，再次证实lf-1样品中线虫呈现出阳性反应呈现出明亮的绿色，两次检测结果一致。

研究结果证实，本发明的lamp的引物组、试剂盒及检测方法可以成功应用于me毒性南方根结线虫的田间检测，检测体现出了特异性、准确性、简便性及实用性；为田间快速检测毒性线虫提供了重要技术支持。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明实质内容上所作的任何修改、等同替换和简单改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>中国农业科学院蔬菜花卉研究所

<120>用于鉴定me毒性根结线虫的lamp引物组及其方法

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(未知)

<400>1

ggtagatgctatgggaaca19

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(未知)

<400>2

atcgaacgtaatcgacaatg20

<210>3

<211>38

<212>dna

<213>人工序列(未知)

<400>3

ggaaagtctgccgccattaggattggggtgtaatgcgt38

<210>4

<211>43

<212>dna

<213>人工序列(未知)

<400>4

aagggatttcgggattgatttgattaaagtgtaacggccactg43

<210>5

<211>776

<212>dna

<213>根结线虫(meloidogynespp)

<400>5

cttacaacgccgctctgaatgatctgggcaggcctaaaggtgatagccatcgcattgccc60

tggctgtttcaggcgatgatgccaaagcaaagaaaattgtgtttcagctggtagatgaat120

tgggtttcgatgcttttgatatggggatgattgctcaatcctggaggcaacaaccaggtt180

ctgccatttattgcagggatattaatttggatgagctcaaaaaaagggtagatgctatgg240

gaacagattggggtgtaatgcgtaaggtgatcataggtaaacatcatgctgaccagatgc300

taatggcggcagactttccggcctggttaaagggatttcgggattgatttgattttcccg360

atctgtttcgatagcttgtccggaagggtgggaaaccagtggccgttacactttcattgt420

cgattacgttcgattaacgttaaatgcgaaaatcatccgattgaagattttacaatctgg480

gttgataattcattacaatggctagcatgtttttaatatctgtttgattccgaatggttg540

cccagaagttagcgggaaatgaatctgttttctctttttgtctaattgtgatgacaagtt600

cagtttcaccgcctttttttcttagtcctatataagtctggtatccgttataggtttcgg660

ctttgtagtaaatgcagtcgcctttaaatttctctgacatatgtgtacccgccatcagac720

caatatcatagaaaatcaatagatctgaactctttaattcgcccctataggagtcg776

相关知识

蓝莓枝枯病的重要病原真菌鉴定及LAMP快速检测技术研究
植物线虫病害如何诊断？
蔬菜大棚根结线虫病防治方法
一种适用于南方根结线虫无菌培养的消毒方法与流程
正确使用威百亩防治根结线虫
马铃薯培养根结线虫效果的研究
6种药剂对红麻根结线虫的防治效果
黄栀子根结线虫病防治初探
一种基于杜鹃花转录组数据的ssr分子标记引物及其筛选方法与应用
一种花生根结线虫诱杀剂及其制备方法与流程

网址: 用于鉴定Me毒性根结线虫的LAMP引物组及其方法与流程 https://m.huajiangbk.com/newsview1457790.html