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实时荧光定量PCR检测南方根结线虫的引物、探针及应用

花匠小妙招
2025-01-05 14:50

实时荧光定量pcr检测南方根结线虫的引物、探针及应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及用于实时荧光定量pcr检测南方根结线虫的引物、探针及应用。

背景技术：

2.根结线虫(meloidogyne spp.)是一类植物根系专性内寄生线虫，其引起的土传病害为仅次于真菌的第二大病害。根结线虫的寄主范围广，可侵染超过3000种植物，涉及蔬菜、水果及粮食作物，我国每年因根结线虫危害造成的损失已超过了人民币50亿元，经济损失严重，制约了我国农业产业的健康发展。因此，在作物播种或移栽前明确田间线虫群体密度，依据不同的群体密度制定相应的防治策略，对降低危害损失具有重要意义。
3.现有技术采用形态学鉴定方法鉴定根结线虫，该方法借助显微镜进行检视，对检测人员的专业知识背景要求较高，且检测速度慢。

技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种实时荧光定量pcr检测南方根结线虫的引物、探针组合物。
5.本发明的再一目的在于提供上述引物探针组合物的应用。
6.本发明的再一目的在于提供含有上述组合物的试剂盒。
7.本发明的再一目的在于提供检测南方根结线虫的方法。
8.根据本发明具体实施方式的用于实时荧光定量pcr检测南方根结线虫的引物和探针，所述引物和探针的核苷酸序列如下：
9.正向引物序列mi
‑
f2:5'
‑
ctacccttatcggtggatcacta
‑
3'，
10.反向引物序列mi
‑
r2:5'
‑
aatgaccctgaaccagacgtt
‑
3'；
11.探针序列mi
‑
p2:5'
‑
agtttgacctcaatgcggccatttgcgt
‑
3'。
12.根据本发明具体实施方式的用于实时荧光定量pcr检测南方根结线虫的引物和探针，所述探针的5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团，其中，其中，荧光基团可选fam、hex、tet等，本发明的优选方案为fam；淬灭基团可选tamra、bhq等，本发明的优选方案为tamra。
13.本发明的用于实时荧光定量pcr检测南方根结线虫的引物和探针的应用，尤其是在检测南方根结线虫方面。
14.根据本发明具体实施方式的检测南方根结线虫的试剂盒，所述试剂盒包含本发明的引物和探针，该试剂盒可用于检测南方根结线虫。
15.根据本发明具体实施方式的实时荧光定量pcr检测南方根结线虫的方法，所述方法包括利用本发明的特异性引物和探针对南方根结线虫的dna进行pcr扩增的步骤。
16.其中，所述pcr反应体系包括以下组分：rtaq 0.5μl、mgcl
2 3μl、10xpcr buffer 2.5μl、dntps 2μl、探针1μl、引物2μl(mi
‑
f2、mi
‑
r2各1μl)、0.1％bsa 5μl、h2o 4μl、模板5μl。
17.所述pcr扩增程序为：95℃30s；94℃5s；60℃30s，45个循环。
18.本发明的有益效果：
19.本发明所提供的引物和探针，能够特异性检测南方根结线虫，对其他线虫dna和土传病害病原菌dna为模板均未得到阳性；其能够实现对南方根结线虫的快速定量检测，对南方根结线虫dna的检测灵敏度为50拷贝，当南方根结线虫dna浓度在1
×
101～1
×
108拷贝/μl范围内，线性关系良好，可用于qpcr准确定量检测。
附图说明
20.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
21.图1显示本发明引物与现有引物采用qpcr(taqman)方法扩增南方根结线虫基因组dna的对比结果，其中，(1)引物mi
‑
f2/r2探针mi
‑
p2；(2)引物mi
‑
f3/r3；(3)引物mi
‑
f4/r4探针mi
‑
p2；(4)引物mi
‑
f5/r5；(5)引物rknf/r；
22.图2显示本发明的引物和探针的特异性实验结果；
23.图3是南方根结线虫qpcr标准曲线图。
具体实施方式
24.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
25.实施例1设计引物
26.本发明根据南方根结线虫的基因组dna，自行设计检测南方根结线虫的引物和探针核苷酸序列，
27.正向引物序列mif2:5'
‑
ctacccttatcggtggatcacta
‑
3'，
28.反向引物mir2:5'
‑
aatgaccctgaaccagacgtt
‑
3'；
29.taqman探针序列mip2:5'
‑
agtttgacctcaatgcggccatttgcgt
‑
3'，其5’端标记荧光素fam基团，3’端标记tamar淬灭基团。
30.将本发明的引物与软件设计的得分较高的2组引物进行比较，结果见表1、图1。
31.表1同一模板、不同引物和探针的qpcr检测结果
[0032][0033][0034]
结果如表1所示，在同一模板、不同引物条件下，mi
‑
f2/r2的扩增ct值较其他引物ct值小且荧光信号值较高，mi
‑
f6/r6和mi
‑
f7/r7的荧光信号均在20以下，荧光信号值较低，说明mi
‑
f2/r2的扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值时所对应的扩增循环数少，表明本发明的引物对的扩增效率高于其他引物。
[0035]
软件提供的引物和探针的解链温度(tm)对于实时荧光定量pcr反应来说不是最佳的，且引物探针形成了稳定的二级结构降低了引物探针利用效率，从而使荧光信号偏低，影响检测灵敏度。因此，软件设计的引物不适合taqman方法，本发明采用sybr
‑
greenⅰ的方法进行了测试。
[0036]
将本发明的引物与已报道的引物进行比较，结果见表2：
[0037]
表2同一模板、不同引物和探针的qpcr检测结果
[0038]
[0039]
结果如表2所示，在同一模板、不同引物条件下，mi
‑
f2/r2的扩增ct值较其他引物ct值小，说明mi
‑
f2/r2的扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值时所对应的扩增循环数少，表明该引物对的扩增效率高于其他引物。
[0040]
实施例2考察本发明引物的特异性
[0041]
本发明以燕麦禾谷胞囊线虫、大豆胞囊线虫、菲利普胞囊线虫、甜菜胞囊线虫、茎线虫、南方根结线虫、斯氏短纹线虫、大丽轮枝菌、立枯丝核菌ag
‑
3、立枯丝核菌ag
‑
4hgⅲ、尖孢镰刀菌萎蔫专化型fov7、尖孢镰刀菌西瓜专化型fon、尖孢镰刀菌黄瓜专化型foc1
‑2‑
11、胶孢炭疽菌为对照，以ddh2o阴性对照。提取上述线虫或土传病害病原菌的dna，以引物mif2/mir2进行pcr扩增，pcr条件为：rtaq 0.5μl，mgcl
2 3μl，10xpcr(mg
2+
free)buffer 2.5μl，dntps(25mm)2μl，mif2(10μμ)1μl，mir2(10μμ)，1μl，0.1％bsa5μl，mip2 1μl，h2o 4μl，模板5μl。pcr扩增程序：95℃30s；94℃5s，60℃30s，45cycles。
[0042]
表3以不同dna为模板的qpcr检测
[0043][0044][0045]
备注：
“‑”
表明以该dna为模板的qpcr扩增没有检测值。
[0046]
结果如表3、图2所示，本发明的引物以南方根结线虫的dna为模板的qpcr扩增，产生检测值，而以其他虫类的dna为模板进行，不产生检测值，说明本发明引物的特异性良好。
[0047]
实施例3考察引物的灵敏度
[0048]
以南方根结线虫特异性引物mi
‑
f2/r2为引物，南方根结线虫基因组为模板进行pcr扩增，将扩增产物克隆到pmd18
‑
t，构建质粒重组载体pmd18
‑
mit。将提取的质粒pmd18
‑
mit用内切酶ecorⅰ进行酶切，酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳后切胶回收相应片段，利用gel extraction kit进行片段回收，利用nanodrop 2000分光光度计测定重组质粒的dna浓度，并根据公式计算重组质粒dna的拷贝数(whelan et al.,2003)。
[0049]
用ddh2o将上述质粒载体梯度稀释成1
×
108、1
×
107、1
×
106、1
×
105、1
×
104、1
×
103、1
×
102、1
×
101、1
×
100拷贝/μl稀释液。
[0050]
采用taqman荧光探针的方法进行实时荧光定量pcr反应，总体系20μl，其中2
×
perfectstart tmⅱpro2e qpcr supermix 10μl，mi
‑
f2(10μm)0.4μl，mi
‑
r2(10μm)0.4μl，mi
‑
p2(10μm)0.4μl，上述拷贝数稀释的dna模板5μl。每个浓度梯度设置3次重复。
[0051]
qpcr反应程序：采用两步法，反应包括94℃预变性1min，1个循环，之后进行45个循环，每个循环包括94℃5s、60℃30s。采用roche lightcyclerl480ⅱ定量检测系统，建立taqman探针检测技术。
[0052]
拷贝数浓度(copies/μl)＝(6.02
×
10
23
×
浓度(ng/μl)
×
10
‑9)/(660
×
碱基对数)。
[0053]
优化后的反应体系检测南方根结线虫dna的qpcr标准曲线如图1所示，标准曲线为y＝
‑
3.3336x+41.057，r2＝0.998，当南方根结线虫dna浓度在1
×
101～1
×
108拷贝/μl范围内，线性关系良好，可用于qpcr定量检测。
[0054]
每个反应体系能检测到的最低值为10的1次方，即为10copies/μl，而反应体系中模板为5μl，所以，灵敏度为50拷贝/反应体系。本发明检测南方根结线虫dna的灵敏度为50拷贝/反应体系，适用于南方根结线虫dna的定量检测。
[0055]
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。