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菊花花枯病菌实时荧光PCR检测方法.pdf

花匠小妙招
2024-11-23 13:09

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1、(10)申请公布号 CN 103952492 A (43)申请公布日 2014.07.30 CN 103952492 A (21)申请号 201410210430.6 (22)申请日 2014.05.19 C12Q 1/68(2006.01) C12Q 1/04(2006.01) (71)申请人浙江省检验检疫科学技术研究院地址 310016 浙江省杭州市上城区富春路 126 号 (72)发明人陈吴健张明哲林晓佳吴志毅陈曦 (74)专利代理机构杭州中成专利事务所有限公司 33212 代理人金祺 (54) 发明名称菊花花枯病菌实时荧光 PCR 检测方法 (57) 摘要本发明。

2、公开了菊花花枯病菌实时荧光 PCR 检测方法，以待测样品 DNA 为模板，利用上游引物 DL1、下游引物 DL2 和荧光探针 Probe-DL 进行 PCR 扩增，若发生特异性扩增，则表明待测样品中带有菊花花枯病菌 D.ligulicola ；所述上游引物 DL1 为： 5， -CAACACTTAAACCCTTTGTAATTGA-3，所述下游引物 DL2 为： 5， -GGACGTCGTCGTTTTGTTGT-3 ；所述荧光探针 Probe-DL 为： 5， -FAM-ACAACTTTCAACA ACGGATC-TAMRA-3。采用该方法检测菊花花枯病菌，。

3、具有快速、灵敏、特异性高等特点。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页说明书 6 页序列表 2 页附图 6 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书1页说明书6页序列表2页附图6页 (10)申请公布号 CN 103952492 A CN 103952492 A 1/1 页 2 1. 菊花花枯病菌实时荧光 PCR 检测方法，其特征是：以待测样品 DNA 为模板，利用上游引物 DL1、下游引物 DL2 和荧光探针 Probe-DL 进行 PCR 扩增，若发生特异性扩增，则表明待测样品中带有菊花花枯病菌 D.ligulicola 。

4、；所述上游引物 DL1 为： 5， -CAACACTTAAACCCTTTGTAATTGA-3，所述下游引物 DL2 为： 5， -GGACGTCGTCGTTTTGTTGT-3，；所述荧光探针 Probe-DL 为： 5， -FAM-ACAACTTTCAACAACGGATC-TAMRA-3，。 2. 根据权利要求 1 所述的菊花花枯病菌实时荧光 PCR 检测方法，其特征是：所述 PCR 扩增的反应体系 (20L) 为：所述 PCR 扩增的反应条件为： 50预热 2min， 95变性 10min ；然后进入 40 个循环， 95 15s， 60 1min。 3.根据权。

5、利要求2所述的菊花花枯病菌实时荧光PCR检测方法，其特征是： PCR扩增扩增后读取 Ct 值，当 Ct 值为小于或等于 36 时，判定为发生特异性扩增，即表明待测样品中带有菊花花枯病菌 D.ligulicola。 4. 根据权利要求 1、 2 或 3 所述的菊花花枯病菌实时荧光 PCR 检测方法，其特征是：所述待测样品为菊花及菊花产品。 5. 根据权利要求 4 所述的菊花花枯病菌实时荧光 PCR 检测方法，其特征是：所述菊花产品为菊花切花、菊花切条、干制菊花茶。权利要求书 CN 103952492 A 2 1/6 页 3 菊花花枯病菌实时荧光 PCR。

6、检测方法技术领域 0001 本发明涉及分子生物学和核酸检测技术领域，具体为：本发明涉及一种检测鉴定菊花及其产品中是否携带菊花花枯病菌 (Didymella ligulicola) 的实时荧光 PCR 方法。背景技术 0002 菊花花枯病Didymella ligulicola是菊花上的重要病害。 1982年被列入EPPO检疫性有害生物 A2 名单中，属于我国的检疫性病害。该病于 1904 年，美国的北卡罗那州首先发现并报道；随着菊花切花和盆栽菊花的大量生产，危害日益严重，英、德、荷兰、丹麦、加拿大、肯尼亚、坦桑尼亚、日本、澳大利亚、新西兰等国均。

7、有发生，我国目前尚无报道发生。 0003 该病主要侵染菊花花冠，流行快，几天之内可使花冠完全腐烂；也可以使切花在运销过程中大量落花，给商品菊花造成很大的损失。而且该病对环境适应能力很强，可以在各种恶劣自然条件下发生，尤其在温室中，常年都可以发病，因此该病一旦定殖，将会对我国的菊花产业带来毁灭性的打击，即使花费大量的人力和财力，也很难得到根治。 0004 目前我国菊花出口的势头较好，菊花是日本人祭祀祖先的专用花。由于日本国内生产鲜切菊花成本高，菊花种植面积逐年减少，日本每年从我国大量进口鲜切菊花。北京、上海、江苏、浙江、广东直至海南生产的鲜切菊花。

8、都开始出口， 1996 年至 2006 年，我国出口到日本的鲜切菊花总量有 3000 多万枝，为我国花卉企业带来了很好的收益。 0005 鉴于该病危害性严重、适应性强，且我国尚无分布，加强检疫是防止该病害传入我国的首要手段，但鉴于切花产品的特殊性，检疫周期的长短直接影响着切花产品的品质，传统的检疫手段耗时长、难度大，并且无法从无症状植株上检出该病，因此筛选一种适宜、准确、快速的检疫鉴定方法，已成为我国菊花生产，及其他菊科作物的进出口上亟待解决的问题。发明内容 0006 本发明要解决的技术问题是提供一种实现对菊花花枯病菌进行快速检测的菊花花枯病菌实时荧。

9、光 PCR 检测方法。 0007 为了解决上述技术问题，本发明提供一种菊花花枯病菌实时荧光 PCR 检测方法，以待测样品DNA为模板，利用上游引物DL1、下游引物DL2和荧光探针Probe-DL进行PCR扩增，若发生特异性扩增，则表明待测样品中带有菊花花枯病菌 D.ligulicola ； 0008 所述上游引物 DL1 为： 5， -CAACACTTAAACCCTTTGTAATTGA-3， 0009 所述下游引物 DL2 为： 5， -GGACGTCGTCGTTTTGTTGT-3，； 0010 所述荧光探针 Probe-DL 为： 5， -FAM-ACAACTTTCAA。

10、CAACGGATC-TAMRA-3，。 0011 作为本发明的菊花花枯病菌实时荧光 PCR 检测方法的改进： 0012 所述 PCR 扩增的反应体系 (20L) 为： 0013 说明书 CN 103952492 A 3 2/6 页 4 0014 所述 PCR 扩增的反应条件为： 0015 50预热 2min， 95变性 10min ；然后进入 40 个循环， 95 15s， 60 1min。 0016 作为本发明的菊花花枯病菌实时荧光 PCR 检测方法的进一步改进： PCR 扩增扩增后读取 Ct 值，当 Ct 值为小于或等于 36 时，判定为发生特异性扩增，即表明待测样。

11、品中带有菊花花枯病菌 D.ligulicola。 0017 作为本发明的菊花花枯病菌实时荧光 PCR 检测方法的进一步改进：所述待测样品为菊花及菊花产品。菊花产品包括菊花切花、菊花切条、干制菊花茶等。 0018 本发明的技术方案具体如下： 0019 1、引物和探针的设计 0020 在 NCBI 的网站上 (http:/www.ncbi.hlm.nih.gov/BLAST/) 选取了 18 个分别来自 Didymella 及 Phoma 属真菌的 rDNA 的内转录间隔区 (internal transcribed spacer， ITS) 序列，用 MegAlign 软件。

12、(version5.0 ； DNASTAR,Madison,WI) 的 ClustalV 算法进行排序。在排序后的在变异区域特设了菊花花枯病菌的特异性引物和探针。引物探针序列见表 1。 0021 2、引物探针特异性的理论验证 0022 为了验证探针的特异性，用 BLAST(http:/blast.ncbi.nlm.nih.gov/) 对引物探针进行了验证。BLAST 搜索发现，所设计的引物和探针具有较高的特异性。发现该对引物只能扩增菊花花枯病菌。( 其中 Stagonosporopsis ligulicola 为 Didymella ligulicola 的异名。) 0023 经过。

13、 BLAST 验证，所设计的引物探针理论上具有很高特异性。 0024 表 1 0025 0026 引物、探针合成和标记均可委托宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司完成。 0027 3、实时荧光 PCR 扩增说明书 CN 103952492 A 4 3/6 页 5 0028 向样品提取液中，加入特异性引物和荧光探针进行扩增，扩增后读取 Ct 值。反应体系为 20L，包括 10L2Premix Ex Taq、上下游引物 (5mol/L) 各 0.4L 和探针 (5mol/L)0.8L、 2L 模板 DNA、 0.4L50ROX Reference Dye ，加无菌水 6L 补。

14、至 20L。设置扩增反应条件为： 50预热 2min ； 95变性 10min ；然后进入 40 个循环， 95 15s， 60 1min。读取 Ct 值。 0029 备注说明：从待测样品中获取模板 DNA 为常规技术，例如可按照 CTAB 法进行。 0030 例如，可按照如下步骤进行： 0031 (1) 称取液氮研磨处理过的样品粉末 0.1g，移到 2mL 的离心管中； 0032 (2) 加入 65预热的 CTAB 提取液 700L，置于水浴锅中 65水浴 30min，期间不断混匀； 0033 (3) 加入 5L10mg/mL RNA 酶，充分混匀，在 37放。

15、置 30min ； 0034 (4) 加入等体积的 Tris 饱和酚，充分摇匀，在 13,000g 下离心 15min ； 0035 (5) 取上清液，加入等体积氯仿 / 异戊醇 (24:1)，在 13,000g 下离心 15min ； 0036 (6) 再取上清液，加入等体积氯仿 / 异戊醇 (24:1)，在 13,000g 下离心 15min ； 0037 (7) 加入等体积预冷异丙醇，轻轻摇晃，置于 -20冰箱静置 30min，在 13,000g 下离心 15min ； 0038 (8) 弃上清，加入 70乙醇 500L， 13,000g 下离心 3min，去上清。

16、，重复 2 次； 0039 (9)得到DNA沉淀，用冷冻干燥仪进行干燥，加入30L50L TE或无菌去离子水，充分溶解后，置于 -20冰箱中保存。 0040 在本发明中，探针的 5，端连 FAM 荧光报告基团， 3，端连荧光淬灭基团 TAMRA。 0041 本发明的方法具有快速、灵敏、特异性高等特点，整个检测过程只需要大约 2 小时，可以满足进出境菊花产品中是否携带的菊花花枯病菌的检测需求。本发明方法的灵敏度为 100fg/L。附图说明 0042 下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。 0043 图 1 菊花花枯病实时荧光 PCR 法 - 灵敏度。

17、验证结果； 0044 1-6 ：分别含有为 1ng， 100Pg， 10Pg， 1Pg， 100fg， 10fg 菊花花枯病菌 DNA ； 7 为对照。 0045 图 2 菊花花枯病实时荧光 PCR 法 - 特异性验证结果； 0046 1、 D.ligulicola2、 A.tenuissima3、 A.alternata4、 Botrytis cinerea5、 Puccinia horiana6、 D.bryoniae7、 D.lycopersici.8、 Phoma sp.9、 Phoma sp.10、 P.glomerata。 0047 图 3 为菊花花枯病实时荧光 PCR 法。

18、- 对菊花样品的检测结果； 0048 1、 D.ligulicola 标准菌株 (IMI147194)2-6 ：分别接种 D.ligulicola， A.tenuissima， A.alternata， Botrytis cinerea， Puccinia horiana 的菊花叶片样品 .7 对照。 0049 图 4 为菊花花枯病实时荧光 PCR 法 - 对菊花样品不同部位的检测结果； 0050 1、 D.ligulicola标准菌株(IMI147194)2-4 ：感染D.ligulicola的菊花叶片、菊花花瓣、菊花茎杆， 5-7 ：未感染 D.ligulico。

19、la 的菊花叶片、菊花花瓣、菊花茎杆； 8 对照。 0051 图 5 为菊花花枯病实时荧光 PCR 法 - 对菊花样品不同部位的检测结果 ( 对比例说明书 CN 103952492 A 5 4/6 页 6 1) ； 0052 1、 D.ligulicola标准菌株(IMI147194)2-4 ：感染D.ligulicola的菊花叶片、菊花花瓣、菊花茎杆， 5-7 ：未感染 D.ligulicola 的菊花叶片、菊花花瓣、菊花茎杆； 8 对照； 0053 图 6 为菊花花枯病实时荧光 PCR 法 - 对菊花样品不同部位的检测结果 ( 对比例 2) ； 0054 1、。

20、 D.ligulicola标准菌株(IMI147194)2-4 ：感染D.ligulicola的菊花叶片、菊花花瓣、菊花茎杆， 5-7 ：未感染 D.ligulicola 的菊花叶片、菊花花瓣、菊花茎杆； 8 对照。具体实施方式 0055 实施例 1、灵敏度验证 0056 将标准菌株菊花花枯病菌(Didymella ligulicola)测定DNA浓度后系列稀释(用超纯水作为稀释剂 ) 为不同浓度，分别取 1ng、 100Pg、 10Pg、 1Pg、 100fg 和 10fg 的菌丝 DNA 用于实时荧光 PCR 检测， PCR 扩增后 1ng、 100Pg、 10pg。

21、、 1pg、 100fg 的菌丝 DNA 都检测到荧光信号的增加，表现为阳性扩增， 10fg 的菌丝 DNA 无扩增 ( 图 1)，试验结果表明引物 DL1/DL2 和探针 ProbeDL 的检测灵敏度为 100fg 的菌丝 DNA。 0057 所述 PCR 扩增的反应体系 (20L) 为： 0058 0059 0060 PCR 扩增的反应条件为： 0061 50预热 2min ； 95变性 10min ；然后进入 40 个循环， 95 15s， 60 1min。 0062 实施例 2、特异性验证 0063 选用菊花上常见病害及菊花花枯病近似菌株 ( 详见表 2) 对设计的引物和。

22、探针进行特异性检测，模板 DNA 的浓度设定为 10ng/L ；其余 PCR 扩增的反应体系和反应条件同实施例 1。 0064 结果如图 2 所示，只有菊花花枯病菌表现为阳性扩增，荧光信号以指数形式增长，其他菌株均未检测到荧光信号，结果说明，设计的引物和探针对菊花花枯病具有很好的特异性。 0065 表 2、供试菌株列表 0066 说明书 CN 103952492 A 6 5/6 页 7 0067 实施例 3、对样品的检测 0068 取健康菊花叶片表面洗净后，分别接种菊花黑斑病病原细极链格孢 (Alternaria tenuissima) 和链格孢 (A.alter。

23、nata)，灰霉病病原灰葡萄孢 (Botrytis cinerea)、白锈病病原堀柄锈菌(Puccinia horiana)、菊花花枯病菌(D.ligulicola)， 25保湿培养24h后，取叶片提取 DNA。 0069 其余 PCR 扩增的反应体系和反应条件同实施例 1。 0070 备注说明：该健康菊花叶片采自国内出口菊花企业基地，并无病害为害症状，可保证不带有菊花花枯病菌 (D.ligulicola)。 0071 进行实时荧光PCR检测，标准菌株(IMI147194)作为阳性对照，健康的菊花叶片作为阴性对照。结果表明，阳性对照和接种菊花花枯病菌的样品表现出阳。

24、性扩增信号，接种其他菌株的样品和阴性对照未检测到扩增信号，说明该方法不但可以用于菊花花枯病菌菌株的鉴定，同时可以用于进出境菊花产品中是否携带的菊花花枯病菌的检测 ( 图 3)。 0072 实施例 4、将事先经传统的检疫手段保湿培养方法检测，出现菊花花枯病典型症状，证明带有菊花花枯病菌 (D.ligulicola) 的菊花切花样品的叶片、花瓣、茎杆作为待测样品 2 4。 0073 将事先经传统的检疫手段保湿培养方法检测，结果为不含菊花花枯病菌 (D.ligulicola) 的菊花切花样品的叶片、花瓣、茎杆作为待测样品 5 7 ； 0074 将上述样品按照实施例 1 。

25、所述方法进行检测，结果为：阳性对照和带有菊花花枯病菌的叶片，花瓣，茎杆样品出现阳性扩增信号，空白对照和不含菊花花枯病菌的样品未出现扩增信号。( 图 4) 0075 对比例 1、将探针改成 CATGCCTGTTCGAGCGTCATTTGTACCT ；其余同实施例 4。最终所得结果为：可以扩增出阳性信号，但是灵敏度降低， Ct 值均增大 1-2 个循环，荧光信号强度减弱。( 图 5) 说明书 CN 103952492 A 7 6/6 页 8 0076 对比例 2、将引物改成： 5，-CAACACTTAAACCCTTTGTA-3，和 5， -GGACGTCG。

26、TCGTTTTGT-3，；其余同实施例 4。最终所得结果为：可以扩增出阳性信号，但是灵敏度降低， Ct 值均增大 1-2 个循环，荧光信号强度减弱。( 图 6)。 0077 最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。说明书 CN 103952492 A 8 1/2 页 9 浙江省检验检疫科学技术研究院菊花花枯病菌实时荧光 PCR 检测方法 3 1 25 DNA 人工序列上游引物 DL1 1 ca。

27、acacttaa accctttgta attga 25 2 20 DNA 人工序列下游引物 DL2 2 ggacgtcgtc gttttgttgt 20 3 20 DNA 人工序列荧光探针 Probe-DL 序列表 CN 103952492 A 9 2/2 页 10 3 acaactttca acaacggatc 20 序列表 CN 103952492 A 10 1/6 页 11 图 1 说明书附图 CN 103952492 A 11 2/6 页 12 图 2 说明书附图 CN 103952492 A 12 3/6 页 13 图 3 说明书附图 CN 103952492 A 13 4/6 页 14 图 4 说明书附图 CN 103952492 A 14 5/6 页 15 图 5 说明书附图 CN 103952492 A 15 6/6 页 16 图 6 说明书附图 CN 103952492 A 16 。