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一种以胚珠为外植体的仙客来组培繁殖方法与流程

花匠小妙招
2025-01-09 20:01

本发明涉及植物组织培养，具体涉及一种以胚珠为外植体的仙客来组培繁殖方法。

背景技术：

1、仙客来（cyclamen persicum）为报春花科仙客来属球根花卉，原产地在欧洲南部希腊等地中海地区。因其花形奇特、品种繁多、花期长且冬季盛开等优点，已发展成为国内外商品盆花中最重要的种类之一。商品仙客来大多是杂种f1一代，用种子继续繁殖会出现性状分离，难以保存 f1代的原有性状和杂种优势。目前，我国仙客来的栽培技术水平已接近国外水平，但是还没有成熟和完善的育种技术体系，仍然需要花费巨额资金购买国外的f1代种子，成为我国仙客来产业发展的制约瓶颈。

2、随着国内仙客来育种研究的不断深入，出现了一些非常优良的新种质单株，然而，新的优良种质经过种子繁殖后性状容易出现分离，优良性状无法保存下来，加之多数具有特异花形的新种质雄蕊或雌蕊败育，只能无性繁殖。而仙客来无法用扦插、嫁接、分根等常规方法无性繁殖，因此，组织培养成为仙客来无性繁殖的唯一途径。

3、国外在仙客来组培方面最成功的是日本，日本自上世纪80年代就开始进行仙客来组培繁殖技术研究，目前仙客来组培快繁技术已进行商业化生产应用，但其繁殖技术属商业机密从未公开。德国、美国、比利时等国也先后有关于仙客来野生种与杂交种组织培养的研究报道，但组培技术均是作为科研手段，未进行生产应用。

4、近年来，国内学者在仙客来组培接种材料、培养基筛选、愈伤组织诱导、器官再生诱导、体胚诱导等方面均进行了大量研究。然而，已有的仙客来组培技术多采用叶片、块茎做外植体，如中国专利cn101112179a公开了一种仙客来组织培养快速繁殖方法，其是以叶片为外植体进行仙客来器官再生组培繁殖的途径；中国专利cn103238526a公开了一种利用组织培养技术快速繁殖仙客来的方法，该技术是以仙客来球茎为外植体进行组培繁殖的整套技术；中国专利cn104982331a公开了一种仙客来组培快繁方法，该技术是以花茎为外植体进行仙客来组培繁殖的方法。

5、对于新优单株来说，叶片、块茎等外植体不但取材数量有限，而且存在由于材料消毒困难，导致接种成活率较低，器官再生过程中存在芽分化率低、成苗率低等问题，成为制约仙客来新优单株组培无性系成功的重要因素。

技术实现思路

1、针对现有技术中，仙客来组培存在的接种材料少、污染率高、分化增殖困难，出苗成活率低等问题，本发明提供了一种以胚珠为外植体的仙客来组培繁殖方法。该方法以未受精的胚珠为外植体，具有对植株无伤害、易于消毒、数量多、取材方便的优点，依次经过愈伤组织诱导和优选、芽诱导及分化增殖、壮苗培养、生根诱导、炼苗移栽等环节，最终建立一种易于接种成功、成苗率高且株型好、叶片数较多的组培技术新体系，有利于加速仙客来无性繁殖进程，促进国内仙客来育种及产业的进一步发展。

2、为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、一种以胚珠为外植体的仙客来组培繁殖方法，包括如下步骤：

4、步骤1：胚珠接种

5、步骤1-1：取欲繁殖的仙客来优良单株未开放或半开放（未受精）的花蕾，摘除花瓣留下子房；用流动的自来水将子房冲洗2小时以上，在超净工作台上对其进行清洗消毒后置于解剖镜下，用解剖刀将胚珠剥离胎座；

6、步骤1-2：用解剖刀或镊子沾取胚珠，接入愈伤组织诱导培养基，密封；

7、所述愈伤组织诱导培养基的配方为：1/2ms培养基+2,4d 2.0mg/l+2-异戊烯腺嘌呤（2ip）0.8mg/l+水解酪蛋白500mg/l+糖30g/l+琼脂6g/l，ph值为5.8-6.0；

8、步骤2：愈伤组织诱导及筛选

9、将接有胚珠的愈伤组织诱导培养基置于22-25℃完全黑暗的环境中连续培养3-5个月诱导其产生愈伤组织；其中，在愈伤组织诱导培养过程中，每4周筛选致密、乳黄色或乳白色愈伤组织转接种一次；

10、步骤3：芽诱导及增殖

11、步骤3-1：待连续黑暗培养愈伤组织3-5个月后，筛选致密、乳黄色或乳白色的愈伤组织转接至分化培养基上进行芽诱导培养，得到不定芽；

12、步骤3-2：在不定芽增殖初期，筛选致密、出不定芽球多的愈伤组织作为增殖器官转接至增殖培养基进行增殖培养；

13、步骤3-3：在不定芽增殖过程中，筛选至少含有3个芽点的芽丛进行继代培养；所述芽丛基部根据增殖培养基空间留有愈伤组织；

14、步骤3-4：根据芽丛以及芽丛基部留有的愈伤组织的发育情况，不断重复步骤3-2和3-3，获得更多基部带有愈伤组织的芽丛；

15、所述分化培养基和增殖培养基的配方相同，为：1/2ms培养基+6-苄基嘌呤 (6-ba)0.5～2.0mg/l+萘乙酸(naa) 0.05～0.2mg/l+水解酪蛋白100mg/l+糖30g/l+琼脂6g/l；

16、步骤4：壮苗培养

17、对步骤3分化增殖得到的芽丛进行修剪，使芽丛保留6个以上均匀分布的叶柄，并且基部留有愈伤组织，之后将芽丛转入壮苗培养基进行1~2代的壮苗培养，得到无根试管苗；

18、所述壮苗培养基配方：1/2ms培养基+6-苄基嘌呤 (6-ba) 0.05~0.2mg/l+萘乙酸(naa) 0.01mg/l+水解酪蛋白100mg/l+糖30g/l+琼脂6g/l；

19、步骤5：生根诱导

20、壮苗培养结束后，对健壮的无根试管苗进行修剪，使芽丛上的芽点分布均匀，芽丛基部留有愈伤组织，然后转接至生根培养基中培养30-45天，得到生根瓶苗；

21、步骤6：炼苗移栽

22、步骤6-1：将已生根的瓶苗，置于强自然光下炼苗5-7天之后进行移栽；同时，于移栽前2-3天，将装有已生根瓶苗的瓶盖旋松并露出缝隙，使瓶苗透气进行炼苗；

23、步骤6-2：瓶内炼苗完成后，取出已生根的瓶苗，将其基部培养基洗净，并移栽至铺有移栽基质的穴盘或泡沫培养箱中；移栽初期15天内，用塑料薄膜覆盖保持湿度85%以上，并控制光照强度小于6000lux，之后逐渐撤去塑料薄膜直至置于自然条件下；

24、步骤6-3：待苗木铺满穴盘或长满泡沫箱后，将其移栽至营养钵中，进行常规管理。

25、进一步的，步骤1所述优良单株指的是符合育种目标且生长健壮、无病、无虫害的植株。

26、进一步的，步骤1-1所述在超净工作台上对子房进行的清洗消毒是指：先将子房置于70%的酒精中浸泡消毒30秒，浸泡完成后取出子房，用无菌水冲洗一遍；再置于2%次氯酸钠溶液中浸泡消毒15-20分钟，浸泡完成后取出子房，用无菌水冲洗三遍，每次5分钟；上述每次浸泡消毒时，不断振荡装有酒精或氯酸钠溶液的容器。

27、进一步的，步骤3所述增殖培养基中6-ba的浓度根据芽丛增殖情况及叶柄、叶片生长情况在其原有基础上进行动态调节，当芽丛幼嫩芽过多，愈伤组织出现透明现象时，降低6-ba浓度；当芽丛基部留有的愈伤组织分化芽点过少、愈伤组织出现褐化时，升高6-ba浓度。

28、进一步的，步骤5所述生根培养基配方：1/2ms培养基+naa 0.5～1.0mg/l+iba 0.5～1.0mg/l。

29、进一步的，步骤6-2所述穴盘为50穴穴盘。

30、进一步的，步骤6-2所述移栽基质优选椰糠和蛭石以1：1质量比复配的混合基质，并且移栽基质内加入有0.1~0.5%敌磺钠。

31、进一步的，上述步骤3芽诱导及增殖、步骤4壮苗培养以及步骤5生根诱导培养的培养条件相同，为温度18-25℃，光照周期12h/d，光强度1500-4000lux。

32、本发明公开了一种以未受精胚珠为外植体进行仙客来组培繁殖的整套技术方案，提供了仙客来组培繁殖“胚珠外植体启动、水解酪蛋白营养支撑、动态激素调控、芽丛状增殖、壮苗态生根及瓶内、瓶外炼苗移栽”的整体思路和具体方法，为提高仙客来组培接种成活率和出苗成活率及株型塑造提供了有效的新途径。具体的：

33、（1）本发明以未受精的胚珠为外植体材料，具有对植株无伤害、数量多、取材方便的优点，可同时获得较多的外植体接种材料；因仙客来胚珠在子房内处于一种无菌状态，故以胚珠为外植体，易于获得无菌的外植体材料，污染率极低，克服了采用叶片、球茎等其他外植体易污染的缺陷；并且探索在诱导培养基中加入水解酪蛋白，不仅降低了愈伤组织的褐化率，而且使得胚珠接种成功率达95%以上；

34、（2）在不定芽继代培养及生根过程中，采用了根据愈伤组织生长情况，进行激素动态调节的方案，有效抑制了愈伤组织的玻璃化或褐变，愈伤组织诱导芽分化率达96%~100%；

35、（3）本发明在不定芽增殖、壮苗以及生根培养中，均以芽丛状或丛生苗的形态进行，并保证芽丛基部留有适量的愈伤组织，使仙客来出苗率和生根率最高可达到100%；同时，本发明在不定芽增殖过程中，就有选择性的对芽点数较多的芽丛进行筛选，并且在后期壮苗培养和炼苗培养时，均对芽丛的形态进行了适当修剪，加快了组培苗成型速度，使得组培苗株型紧凑、丰满、匀称，叶片数较多；

36、（4）本发明采用瓶内炼苗与瓶外炼苗相结合的方式进行炼苗，并采用特有的移栽基质，使得仙客来瓶苗更加健壮，更易于适应后期的移栽环境，成活率达95%~100%。

37、本发明技术方案的应用，将会显著提高仙客来组培苗生产效益，为仙客来组培苗商业化生产提供科学依据。