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STUDY ON THE RELATIONSHIP BETWEEN THE FLAVONOIDS AND PIGMENTS IN GINKGO BILOBA LEAF

花匠小妙招
2025-04-12 14:29

摘要：对银杏极短枝叶片叶绿素、花青苷和黄酮含量进行全周期测定, 结果表明:黄酮含量分别于1999- 07-04和1999-11-01达到高峰, 其中后1次峰值较大、持续时间较长; 叶绿素含量于1999-06-13达到最高峰后一直呈下降趋势; 花青苷含量变化趋势与黄酮类似, 但波动幅度较黄酮大。用Microsoft Excel软件对数据统计分析, 黄酮与花青苷显著正相关, 与叶绿素显著负相关。回归方程为:Y(叶黄酮)=220.9558 -0.7722X1′ (叶绿素)+0.4343X2′(花青苷), 回归模型经F测验达1%显著水平。从生理生化角度对调控黄酮含量进行了讨论。

Abstract: The concentrations of chlorophyll, anthocyanin and flavonoid in Ginkgo biloba leaf were assayed in 1999.The results indicate that there are two peaks of flavonoid content, one on July 4 and the other that has greater value on Nov.1.Chlorophyll shows a declining trend after reaching its peak value on June 13.Anthocyanin shares a similar trend with flavonoid, but its curve fluctuates larger than that of flavonoid.With the help of Microsoft Excel to deal with data, there is a significantly positive relationship between flavonoid and anthocyanin, a significantly negative relationship between flavonoid and chlorophyll.The regression equation, Y (flavonoid)=220.9558-0.7722X1′ (chlorophyll)+0.4343X2′(anthocyanin), is statistically significant at the 1 % level.How to regulate the flavonoid concentration on the physiological and biochemical viewpoints is discussed.

银杏叶片中含有重要的生理活性物质———类黄酮, 它具有扩张血管、抑制血栓形成等疗效, 且药负作用小, 因此银杏叶制剂在国内外市场供不应求(程水源等, 1998)。随着以银杏叶加工为主的银杏产业在我国的迅速发展, 对提高原材料银杏叶数量和质量的研究成为研究的主导(程水源等, 1999)。从研究银杏叶黄酮含量的年周期变化入手, 系统地探讨与黄酮含量密切相关的叶绿素含量与花青苷含量的变化, 旨在确定银杏叶合理采收期, 并为调控银杏叶黄酮含量提供依据。本文中黄酮泛指两个芳香环通过三碳链相互连结而成的一系列化合物(鞠志国等, 1992), 叶色素指叶绿素和花青苷。

1 材料与方法1.1 材料及处理

试材选自于湖北农学院银杏科技园, 银杏品种为7 a生家佛手, 从1999-05-04开始, 每隔15 d左右采1次极短枝(叶丛枝)叶片, 取样到1999-11-29为止。随机摘取大小均匀、叶色较为一致、无伤病叶片, 采样后迅速将叶片洗净、晾干, 用于测定类黄酮的叶片经105 ℃杀酶20 min, 65 ℃烘干至恒重、粉碎, 干燥器贮存。

1.2 测定方法

叶绿素含量测定(白宝璋等, 1996):取一定量初处理鲜叶→打孔→取一定数量打孔圆片研磨、80 %丙酮浸提→定容后在663 nm和645 nm波长下比色, 然后根据C(mg.L-1)=20.31OD645 +8.04OD663(OD为分光值)计算叶绿素浓度, 最后用公式:Y(mg·dm-2)=〔浓度(mg·L-1)×提取液总量(mL)〕/叶面积(dm2)×100〕换算成叶绿素含量。

测量花青苷含量的流程与叶绿素相似, 但浸提液为95 %的C2H5OH与1.5M的HCl按85:15的体积比混合的混合液, 比色波长分别是在650 nm、620 nm、530 nm, 然后按赵宗方等(1992)提供的方法计算与换算结果。

类黄酮含量测定(胡敏等, 1997):称取0.5 g左右干样→70 %C2H5OH浸提→显色→定容后以芦丁作标样在510 nm波长下比色, 然后根据Y(ug·g-1)=0.0012 +0.0945A(分光值)(r =0.9998**, 极显著水平)计算, 再换算成百分含量。

称量用HM-200型万分之一电子天平, 比色用V-530紫外可见光分光光度仪。

试验处理及数据测定均为3次重复, 最后用平均值表示结果, 数据统计与制图采用Microsoft Excel。

2 试验结果2.1 银杏叶黄酮、叶绿素及花青苷含量的动态变化

从图 1、表 1可知:银杏叶黄酮含量有2次高峰, 第1次在1999-07-04, 第2次在1999-11-01, 其含量绝对值分别为0.8082 %、1.0625 %, 且第2次高峰持续时间较第1次长。花青苷含量变化与叶黄酮有类似趋势, 其峰值表现为在前期滞后, 中期超前, 后期滞后或不规则, 相对值百分率变化分别是前期小于叶黄酮, 中期大于叶黄酮, 后期小于叶黄酮。叶绿素含量在1999-06-13达到最高峰后, 一直处于下降趋势, 后期下降加速, 与类黄酮、花青苷变化相比, 前期峰值超前。

表 1 不同取样时期银杏叶片中叶绿素、黄酮及花青苷含量Tab.1 The content of chlorophyll, flavonoid and anthocyanin in Ginkgo biloba leaf with different dates

2.2 银杏叶黄酮、叶绿素及花青苷三者的关系

为便于比较和进行相关回归分析, 把数据转换成相对值即百分率, 结果见表 1。由银杏叶黄酮与叶绿素、花青苷以及叶黄酮+花青苷与叶绿素散点图(图 2、3)可以看出, 适合于用线性模型分析它们之间的关系。用Microsoft Excel软件处理得如下结果:Y(类黄酮)=220.9558 -0.7722X1′(叶绿素)+0.4343X2′ (花青苷), 相关系数r =0.7416, 调整后回归系数R2 =0.4749, 回归模型经F测验达1 %显著水平。其叶黄酮与叶绿素、叶黄酮与花青苷、叶黄酮+花青苷与叶绿素的回归模型经检测也分别达到5 %或5 %以上水平, 回归方程分别如下:Y(叶黄酮)=354.1595 -1.1141X1′(叶绿素); Y (叶黄酮)=106.6861 + 0.6028X2′(花青苷); Y(叶黄酮+花青苷)=330.4266 -0.9506X1′(叶绿素)。但花青苷含量与叶绿素含量负相关之间没有达到显著水平。

图 3 叶黄酮+花青苷与叶绿素散点图 Fig. 3 Slot plots between chlorophyll and flavonoids+anthocyanin

3 讨论

相关回归分析表明:银杏叶黄酮含量与叶绿素含量显著负相关, 回归模型达到显著水平。总体来讲, 伴随叶绿素降解, 叶黄酮含量增加, 这与姜玲等报道的结果一致(姜玲等, 1998)。但从图 1可知, 在前期叶绿素含量上升, 叶黄酮含量也上升, 具体表现为叶绿素含量在1999-06-13达到高峰后, 黄酮含量在1999-07-04也达到第1次高峰, 并没有表现出相反的变化趋势。这是因为生物体内黄酮合成的起源为光合产物, 随叶绿素含量增加, 叶发育进程的推进, 光合作用加强, 光合产物及其转化产物水平提高, 这必然引起类黄酮含量的提高。但叶黄酮第1次高峰值比第2次低, 持续时间短, 可能由以下几个原因造成:(1)前期属于器官大量形成期, 光合产物迅速转化成其它产物带来光合产物总积累量不够、向类黄酮转化相对不够; (2)由于长江流域周期性的梅雨, 6月中旬过后正是梅雨旺季, 光照不足造成光合作用下降, 进而影响类黄酮的合成。同时, 由于苯丙氨酸氨解酶(PAL)是光诱导酶, 且活性与光照强度和光密度有关, 而PAL酶是黄酮合成的关键调速酶(程水源, 1999), PAL酶活性的降低导致类黄酮合成速率的下降; (3)由于叶黄酮是次生代谢的结果, 它的形成是以光合产物为基础, 以叶片的衰老为前提(程水源等, 1999; 余迪求等, 1997; 鞠志国等, 1992), 后期衰老进程的加快, 整体次生代谢强度加大, 从而表现为叶中类黄酮合成第2次高峰比第1次值大、持续时间久。

叶黄酮和花青苷的关系与叶黄酮与叶绿素的关系正好相反, 总体来讲, 叶黄酮上升, 花青苷也上升, 叶黄酮下降, 花青苷也下降, 这与花青苷在生物体内的合成有关, 即光合产物→简单酚类物质→黄酮类化合物→花青苷(杜金华等, 1997; 鞠志国等, 1992), 从合成路径可知, 黄酮类化合物为花青苷合成的前体物质或前体物质之一, 类黄酮合成的加快, 花青苷含量也增加, 反过来说, 花青苷合成的加速, 有拉动光合产物迅速向黄酮类化合物转化的作用, 所以在图 1中表现为:有时类黄酮相对含量增加快, 有时花青苷相对含量增加快, 但二者之间明显的伴随关系不变, 正相关达显著水平。由于花青苷也是次生代谢的产物, 以及与叶黄酮关系的特殊性, 因此, 银杏叶黄酮含量+花青苷含量与叶绿素含量负相关及回归模型均达到5 %显著水平, 但花青苷与叶绿素之间的相关没有达到显著水平, Peter F R(1998)在苹果上的研究结果与本试验结果相似。相对类黄酮来讲, 从合成代谢的途径来看, 花青苷合成经过的过程更多, 代谢层次更高(程水源, 2000), 因此花青苷与叶绿素之间的关系更复杂, 从而导致它们之间线性关系不显著。进一步的讲, 这与(1)类黄酮作为中间产物之一所起的缓冲以及(2)在简单酚类物质向黄酮类化合物转化过程中同时存在着多种成份的合成途径, 至少包括黄酮类、花青苷、木质素等(鞠志国等, 1992), 即生物体内次生代谢过程的复杂性有关。

通过本研究提供的回归模型, 可以较高可信度地预测叶黄酮含量, 花青苷含量, 从理论和实践上为确定最适叶片采收期提供了依据。前期提高叶绿素含量, 加强光合作用, 进而提高光合产物积累水平, 中后期通过改善光照条件, 协调次生代谢产物叶黄酮和花青苷的关系将是今后调控银杏叶黄酮含量研究的重点。