一种蝉花孢子粉的培养方法
技术领域
本发明涉及一种蝉花孢子粉的培养方法，具体涉及一种蝉花孢子粉的球面薄层培养法，属于虫草孢子粉培养领域。
背景技术
蝉花(Isaria cicadae Miquel)别称蝉蛹草、冠蝉、胡蝉、蝉茸等，是麦角菌科真菌蝉棒束孢寄生在蝉科竹蝉、蝼蛄、山蝉及黑蚱等若虫，气候环境适宜时，吸收虫体的营养转化成菌丝体，顶端分枝“发芽”形似花冠，故而称为蝉花。蝉花入药已经有一千多年的历史，南北朝(公元五世纪)《雷公炮炙论》，宋朝苏颂《图经本草》、宋朝唐慎微《经史证类备急本草》和明朝李时珍《本草纲目》等古代经典医学论著均有记载，具有丰富的营养价值。
蝉花孢子粉作为蝉花的繁殖器官，其在孕育期，集中了蝉花培养物的大部分营养，蝉花孢子粉富含丰富的氨基酸、脂肪酸、膳食纤维和维生素，其中蛋白质高达41.6％，膳食纤维高达34.35％。经研究发现蝉花孢子粉对防治便秘、预防直肠和结肠癌、预防冠心病等具有重要的作用。
关于孢子粉的培养，现有技术是在蝉花孢梗束培养的过程中，调整培养条件，延长培养时间等方法来提高蝉花孢梗束上孢子粉的产量。培养周期长，能耗高，产量低，处理繁琐，导致蝉花孢子粉的综合成本高，市场竞争性大大降低。
发明内容
为解决现有技术存在的问题，本发明提供一种蝉花孢子粉的培养方法，利用该方法培养的蝉花孢子粉不仅产量高，且有效成分高，适用于工厂化栽培，具有明显的应用优势。
作为本发明的一个方面，本发明提供一种蝉花孢子粉的培养方法，该方法包括如下步骤：
步骤1，将蝉花菌种进行扩大培养；
步骤2，将步骤1扩大培养获得的菌种接种到固体培养基中进行固体培养；
步骤3，对长满蝉花孢子粉的培养基进行采收；
其中，步骤2所述固体培养过程采用全程光照培养，光照强度为200Lux-500Lux。
优选的，所述光照强度为200Lux-400Lux；最优选的，所述光照强度为300Lux。
优选的，所述光照时间为大于18小时/天；进一步优选的，所述光照时间为大于20小时/天；更进一步优选的，所述光照时间为大于22小时/天；最优选的，所述光照时间为24小时/天。
优选的，步骤2所述固体培养过程中，固体培养基的厚度为0.2～1.2cm；进一步优选的，固体培养基的厚度为0.3～1.0cm；更进一步优选的，固体培养基的厚度为0.4～0.9cm；最优选的，固体培养基的厚度为0.5～0.7cm。
优选的，步骤2所述固体培养过程中，培养温度为24℃～26℃，培养湿度为50％-80％，CO
优选的，步骤2所述接种量为5％-25％；进一步优选的，所述接种量为10％-20％；更进一步优选的，所述接种量为15％。
优选的，步骤2所述固体培养基为谷物培养基，所述谷物选自大麦、小麦、燕麦、荞麦、麦仁、黑麦、麸皮、玉米、豆粕、大米中的任意一种或几种，所述固体培养基为上述谷物经过简单破碎后的任意一种或几种；进一步优选的，所述固体培养基的料水比为1：(0.8-1.2)；更进一步优选的，所述固体培养基的料水比为1：1。
优选的，步骤1所述蝉花菌种扩大培养以扩大菌种数量为目的，包括斜面培养、摇瓶培养、种子罐培养、发酵罐培养的任意一种或者几种培养方式。扩大培养所用培养基为本领域常规培养基。作为优选的，所用斜面试管固体培养基为PDA培养基，所用液体培养基为白砂糖3.5％，酵母浸粉1％，大豆浓缩蛋白0.02％。所述液体培养的培养温度为23℃～27℃，优选为25℃。
本发明所述“料水比”为固体培养基配制过程中谷物与水的重量/体积比(kg/L)。
本发明所述“接种量为XX％”是指接种的种子液体积(L)占固体培养基重量(kg)的百分比；所述固体培养基重量为谷物的重量。
在本发明中，未作相反说明的情况下，如本领域公知的，为了避免杂菌污染，所进行的操作均优选在基本上无菌的条件下进行，所用的各种工具和材料均为已经消毒过的。
本发明的有益效果：本发明采用特定的培养方法，培养物以孢子粉为主，仅产生少量或完全不生长蝉花子实体，大大提高了孢子粉的产量。
附图说明
图1是采用培养袋培养的外观图。
图2是采用培养袋培养的内部图。
图3是采用培养盒培养的外观图。
图4是采用培养盒培养的内部图。
图5是采用培养箱培养的外观图。
图6是采用培养箱培养的内部图。
具体实施方式
实施例1培养袋培养
1液体培养：
1.1原种/栽培种制备
1.1.1培养基配制
1.1.1.1培养基配方：
注：2L三角瓶中种子液装量为500-800ml。
1.1.1.2孢子悬液制作方法
准备接种用具，将过滤水分装于试管，每支试管装水12ml。121±1℃灭菌40min，冷却至常温备用。
将超净工作台用75％乙醇擦干净，将灭菌水、三角瓶，培养基移进操作台，紫外灭菌30min，然后进行无菌操作，将10ml无菌水倒入1支斜面菌种试管中，用接种环或接种铲刮取分生孢子，摇匀，得到孢子悬液，备用。
1.1.2一级原种种子液制作
按1.1.1.1所述比例称取配制培养基的原料，按照2L三角瓶装500-800ml培养基量进行分装，塞上硅胶塞，121±1℃灭菌40min，自然冷却，于超净工作台中，在无菌操作下，将孢子悬液直接加入培养基中，1支斜面菌种接入一个三角瓶内，加盖硅胶塞，于25±1℃，150rpm条件下恒温振荡培养48-55h，获得一级原种种子液。
1.1.3发酵罐栽培种种子液制作
1.1.3.1培养基制作
按1.1.1.1所述比例称取配制培养基的原料，定容。发酵罐装液量不超过总容积的70％。
1.1.3.2灭菌
灭菌前需检查所有阀门是否出现松动，是否有漏水或漏气现象，确定无松动方可进行灭菌。灭菌方法按照发酵系统操作规程进行，灭菌完毕降至25±1℃备用，并调节罐体压力为0.05MPa左右，保持正压。
1.1.3.3发酵罐栽培种培养
采用火焰法接种，种子液接种量1.5-3％(实际接种量根据种子液浓度可略微调整)。接种前，保持罐体微正压，用75％乙醇对接种口进行消毒，点燃棉圈放到接种口慢慢打开接种盖，一级原种瓶火焰消毒约半分钟后接入发酵罐中。接种完毕，盖上接种盖。
培养温度为25±1℃，通气比0.71-1.2vvm(15-25m/h)，罐压维持在0.05-0.1MPa之间。
1.1.4放罐
培养时间19-28h时放罐，菌种需达到蝉花栽培种放行要求方可放罐。放罐前，放料口需蒸汽灭菌至少20min。接种硅胶管与放料管对接前，放料管口需用75％乙醇消毒，对接以后需将硅胶卡住，并再次通蒸汽灭菌20min以上。
2固体培养：
以培养袋为培养容器，培养袋尺寸为950mm*550mm，培养袋底托尺寸为540mm*270mm*60mm。
2.1培养基配方
固体培养基由小麦和纯化水组成，每袋的装料量在0.3kg，清洗后小麦与纯化水比例为1:1。
2.1.1谷物的清洗与分装
开启清洗机，将谷物倒入清洗机进料口，并按规定操作设备，清洗谷物备用。依据既定规格，使用分装机进行分装，分装于培养袋中，将袋口扎好，放于灭菌盘中，将灭菌盘放入灭菌车上待灭菌；
2.1.2固体培养基灭菌
将灭菌车推入灭菌柜，关闭柜门，按照灭菌柜的规定操作设备，进行灭菌。灭菌压力0.146±0.002MPa，灭菌温度127±2℃，维持45-50min。
灭菌完毕，将培养基移入强冷室冷却至室温方可进行接种。
2.2固体接种
2.2.1接种用具灭菌
接种用的硅胶管和接种枪应串联在一起，两头用8层以上纱布包裹缠紧，放入PP材质的袋子，扎紧袋口，127±2℃灭菌45-50min。
2.2.2接种控制
接种人员手持接种枪，另一人提供固体培养基进行接种操作；接种时，侧面需放置一只点燃的酒精灯，接种枪不用时，需将枪头置在火焰上，防止染菌。发酵罐的种子液接入固体培养基中的比例为15％，发酵罐放罐进行接种。
2.2.3菌种混匀处理
接种完毕，将培养袋揉搓或来回颠倒，使菌液和培养基混合均匀，然后转移至培养架，并铺平，均匀铺满整个培养袋底托，使培养物料高度为0.5cm(铺麦完成后，培养物料的高度与一层小麦的厚度相当)，并保留袋子边沿与麦子间至少有5cm间隙以利于光照培养时袋子拉伸。
2.3孢子粉培养
2.3.1培养条件
光照培养强度为300Lux，温度为25℃，控制二氧化碳浓度不超过2000ppm，培养湿度在培养开始至谷物上表面刚好长满孢子时，湿度控制为70％；谷物上表面长满孢子至谷物全表面长满孢子也即采收时，湿度控制为50％；光照时间为24h/d，培养时间20-28天。
2.3.2扎袋与撑袋
培养2-5天后进行“扎袋和撑袋”：扎袋使用消毒后的不锈钢扎针对培养袋进行扎孔处理，扎孔数量50-60个，孔径≤3mm，并均匀分布。将已经扎孔完成的培养袋放入培养袋底托内进行撑袋，使用双手将袋角向内折叠撑起，并将袋口向上折起，使培养袋呈长方体形，类似于小温室，让培养物在既定条件下生长，见图1。
2.4培养室管理
培养开始至谷物上表面刚好生长孢子时，培养物底部和培养袋仍粘连在一起，通过人工干预的方式将培养物底部与袋子分开，分开后将培养物放回原位置，培养物就不再会和袋子粘连在一起，此时培养物底部也可以得到更多的空间和氧气，有利于孢子粉快速生长，继续培养。
3采收：
3.1采收处理
采收台接通电源，打开除尘开关，通风，打开采收罩活动窗，将培养物从培养袋中取出，放置于采收台，将培养物掰碎，放入烘盘中。培养结果见图2。
3.2除湿、干燥、过筛
待收集到满足每批干燥所需的足够数量后，直接进行除湿，除湿时间为18h-42h；除湿条件为除湿间温度控制在30℃以下，湿度控制在60％以下；干燥时间为12-18h；干燥条件为80±1℃。
3.3过筛
将干燥后的带有孢子粉的培养物放入振荡筛中进行过筛(筛孔径大小为100目)，并对孢子粉进行外观及水分的检测，检查合格后待用。
培养结果见图1、2。
实施例2培养盒培养
1液体培养：
1.1原种/栽培种制备
1.1.1培养基配制
1.1.1.1培养基配方：
注：2L三角瓶中种子液装量为500-800ml。
1.1.1.2孢子悬液制作方法
准备接种用具，将过滤水分装于试管，每支试管装水12ml。121±1℃灭菌40min，冷却至常温备用。
将超净工作台用75％乙醇擦干净，将灭菌水、三角瓶，培养基移进操作台，紫外灭菌30min，然后进行无菌操作，将10ml无菌水倒入1支斜面菌种试管中，用接种环或接种铲刮取分生孢子，摇匀，得到孢子悬液，备用。
1.1.2一级原种种子液制作
按1.1.1.1所述比例称取配制培养基的原料，种子罐中装入10-20L纯化水。将一定量的培养基原料放入种子罐中，121±1℃灭菌30分钟，冷却后使用火焰接种法，将提前制备好的一定量的孢子悬液，无菌操作接入发酵罐中。培养温度为25±1℃，通气比0.71-1.2vvm。罐压维持在0.05-0.1MPa之间，培养44-48h，获得一级原种种子液。
1.1.3发酵罐栽培种种子液制作
1.1.3.1培养基制作
按1.1.1.1所述比例称取配制培养基的原料，定容。发酵罐装液量不超过总容积的70％。
1.1.3.2灭菌
灭菌前需检查所有阀门是否出现松动，是否有漏水或漏气现象，确定无松动方可进行灭菌。灭菌方法按照发酵系统操作规程进行，灭菌完毕降至25±1℃备用，并调节罐体压力为0.05MPa左右，保持正压。
1.1.3.3发酵罐栽培种培养
将种子罐与发酵罐之间的移液管道蒸汽灭菌30-40min，种子罐压力升至0.15-0.18MPa.。发酵罐压力调至0.02-0.05MPa。打开移液所需的阀门，待种子罐中种液全部转移至发酵罐中，移液完成，关闭阀门。
培养温度为25±1℃，通气比0.71-1.2vvm(15-25m/h)，罐压维持在0.05-0.1MPa之间。
1.1.4放罐
培养时间19-28h时放罐，菌种需达到蝉花栽培种放行要求方可放罐。放罐前，放料口需蒸汽灭菌至少20min。接种硅胶管与放料管对接前，放料管口需用75％乙醇消毒，对接以后需将硅胶卡住，并再次通蒸汽灭菌20min以上。
2固体培养：
方法基本同实施例1，将培养袋换成培养盒，省去扎孔和“撑袋”。
采收：方法同实施例1。
培养结果见图3、4。
实施例3培养箱培养
液体培养：方法同实施例1。
固体培养：方法基本同实施例1，将培养袋换成培养箱，省去扎孔和“撑袋”。
采收：方法同实施例1。
培养结果见图5、6。
实施例4光照对孢子粉产量的影响
以小麦为培养基，培养袋为培养容器，装料量300g/袋(培养基厚度0.5cm)，料水比1：1，培养基厚度约0.5cm，接种量15％，培养温度25℃，培养时间20天。设置6个实验组，每组3个重复，考察不同光照强度对孢子粉产量的影响(其他操作步骤和参数参照实施例1)。
结果见表1。
经孢子粉收率统计发现300Lux光装强度孢子粉收率最优。
表1光照对孢子粉产量的影响
注：孢子粉收率＝孢子粉干重/每袋装料量×100％，下同。
实施例5培养湿度对孢子粉产量的影响
以小麦为培养基，培养袋为培养容器，装料量300g/袋(培养基厚度0.5cm)，光照强度300Lux，接种量15％，培养温度25℃，培养时间20天。设置2个实验组，每组3个重复，考察培养环境湿度对孢子粉产量的影响(其他操作步骤和参数参照实施例1)。
结果见表2。
经孢子粉收率统计发现料水比1：1时孢子粉收率最优。
表2培养湿度对孢子粉产量的影响
实施例6培养基厚度对孢子粉产量的影响
以小麦为培养基，培养袋为培养容器，料水比1：1，光照强度300Lux，接种量15％，培养温度25℃，培养时间20天。设置5个实验组，每组3个重复，考察不同培养基装料量对孢子粉产量的影响(其他操作步骤和参数参照实施例1)。
结果见表3。
经孢子粉收率统计发现装料量300g，培养基厚度0.5cm孢子粉收率最优。
表3培养基装料量对孢子粉产量的影响
实施例7固体培养基料水比对孢子粉产量的影响
以小麦为培养基，培养袋为培养容器，装料量300g/袋(培养基厚度0.5cm)，光照强度300Lux，接种量15％，培养温度25℃，培养时间20天。设置5个实验组，每组3个重复，考察不同料水比对孢子粉产量的影响(其他操作步骤和参数参照实施例1)。
结果见表4。
经孢子粉收率统计发现料水比1：1时孢子粉收率最优。
表4培养基料水比对孢子粉产量的影响
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