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带有GFP基因的重楼花叶坏死病毒侵染性克隆载体及其构建方法

花匠小妙招
2025-06-27 13:44

本发明涉及植物病毒学和基因工程领域，具体的说，涉及一种带有gfp基因的重楼花叶坏死病毒侵染性克隆载体及其构建方法。

背景技术：

1、重楼又称七叶一枝花，是黑药花科（melanthiaceae）重楼属（paris）多年生草本植物，以干燥的根茎入药，具有清热解毒、消肿止痛、止血、凉肝定惊、调解免疫力等多种功效，用于治疗咽喉肿痛、毒蛇咬伤、跌打伤痛、凉风抽搐等症，是名贵的中药材。近年来随着中医药产业的发展，滇重楼需求量的增加，种植面积逐年扩大。云南是滇重楼的道地产区和主产区，2018种植面积突破11万亩。而随着人工大面积单一种植，病毒病成为限制重楼生产的主要因子之一。目前已报道的侵染重楼的病毒有11种，引起的主要症状有花叶、黄化、斑驳、坏死等，严重时致整株枯死。危害重楼的这些病毒中，重楼花叶坏死病毒（pmnv）是2017年在重楼上报道的一种马铃薯y病毒科马铃薯y病毒属成员，该病毒在重楼上主要引起叶片花叶、坏死等症状。

2、近年来pmnv在云南滇重楼上的发生较为普遍，平均检出率高达24.4%，是危害重楼的主要病毒，且寄主范围较广，还能侵染滇黄精、鬼针草和繁缕等重要药材和杂草。目前对pmnv的研究还处于起步阶段，其致病机制、传播方式均不明确，自然条件下重楼病毒病多为多种病毒复合侵染，很难获得单一的pmnv侵染的毒源，急需构建pmnv的侵染性克隆以研究该病毒的生物学特性、致病机制和相关基因的功能。

技术实现思路

1、本发明提供了一种带有gfp基因的重楼花叶坏死病毒侵染性克隆载体及其构建方法，从而为进一步研究该病毒基因组的生物学特性、致病机制、病毒与植物互作、病毒与昆虫传播介体互作等的研究提供研究材料和技术支撑。

2、为实现上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的：

3、本发明中的带有gfp基因的重楼花叶坏死病毒侵染性克隆载体，所述侵染性克隆载体是利用酵母重组将pmnv全基因组rna对应的cdna全长序列克隆至pcb301-hdv-2µ载体的双35s启动子和终止子nos之间，并把绿色荧光蛋白报告基因插入到pmnv的nib蛋白和cp蛋白之间，即获得pcb301 pmnv gfp重组载体。

4、本发明中的上述带有gfp基因的重楼花叶坏死病毒侵染性克隆载体的构建方法，包括以下步骤：

5、（1）通过pcr扩增获取重楼花叶坏死病毒基因组rna的cdna全长序列；

6、（2）以质粒pcb301-hdv-2µ为模板，利用反向pcr扩增质粒pcb301-hdv-2µ，使质粒线性化，得到线性化的pcb301-hdv-2µ载体；

7、（3）以带gfp的tmv侵染性克隆载体为模板扩增得到mgfp序列；

8、（4）将重楼花叶坏死病毒cdna全长、线性化pcb301-hdv-2µ载体以及mgfp序列，利用酵母同源重组技术进行连接，将其共转化进酵母菌株y2hgold中；

9、（5）筛选并提取步骤（4）中含pmnv+gfp全长cdna序列的质粒，即获得其侵染性克隆载体pcb301-pmnv-gfp。

10、进一步的，所述步骤（1）中重楼花叶坏死病毒基因组cdna全长序列的获取是以感染pmnv的重楼叶片为模板，使用引物pmnv(a)r反转录得到pmnv的cdna，再用pmnv特异引物扩增得到pmnv的全基因组的cdna序列，同时在病毒基因组3’端加入56个a碱基；所述引物如下所示：

11、pmnvf1：caactatacaagacaatcaaatacaaacgcag

12、pmnvr1：atttactacacctgatacaacaaacaaccac

13、pmnvf2：gtggttgtttgttgtatcaggtgtag

14、pmnvr2：actacataaccgtcgctcactgatacc

15、pmnvf3：tatcagtgagcgacggttatgtagtcgg

16、pmnv-nia-r：atttgcttgatggtgtacttcataagtttgtagagacactgtttcatgacatcc

17、pmnv-nia-f：acttatgaagtacaccatcaagcaaattctgaaaccagcccgcaactc

18、pmnv(a)r：aatgtttgaacgatcggggaaattcttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttgggacaacaaacaataccaaacctc

19、进一步的，所述步骤（2）中线性化pcb301-hdv-2µ载体的获取是以质粒pcb301-hdv-2µ为模板，根据pcb301-hdv-2µ序列设计引物，利用反向pcr扩增质粒pcb301-hdv-2µ，使质粒线性化；所述引物如下所示：

20、pcb301-nos-f：gaatttccccgatcgttcaaacatttggc

21、pcb301-35s-r：tgtatttgattgtcttgtatagttgcctctccaaatgaaatgaacttcct

22、进一步的，所述步骤（3）中以带gfp的tmv的侵染性克隆载体为模板，根据mgfp序列设计引物扩增得到mgfp序列；所述引物如下所示：

23、mgfp-nia-f：acttatgaagtacaccatcaagcaaatatggtagatctgactagtaaag

24、mgfp-nia-r：atttgcttgatggtgtacttcataagtagctttgtatagttcatccatg

25、本发明还提供了一种携带重楼花叶坏死病毒侵染性克隆载体的农杆菌菌株，由带有gfp基因的重楼花叶坏死病毒侵染性克隆载体转化到农杆菌中获得。

26、本发明的有益效果：

27、本发明利用酵母同源重组技术构建的pmnv侵染性克隆载体是重楼上植物病毒的第一个侵染性克隆，本发明中构建的pcb301-pmnv-gfp载体能稳定高效系统侵染模式植物本生烟，并在本生烟体内高效表达gfp。本发明中所用的方法实现了多片段和长片段的高效重组，因而为研究该病毒基因组的结构和功能及其致病机制奠定了基础，为生物学特性、致病机制和相关基因功能等的研究奠定基础。

技术特征：

1.一种带有gfp基因的重楼花叶坏死病毒侵染性克隆载体，其特征在于，所述侵染性克隆载体是利用酵母重组将pmnv全基因组rna对应的cdna全长序列克隆至pcb301-hdv-2µ载体的双35s启动子和终止子nos之间，并把绿色荧光蛋白报告基因插入到pmnv的nib蛋白和cp蛋白之间，即获得pcb301-pmnv-gfp重组载体。

2.根据权利要求1所述的带有gfp基因的重楼花叶坏死病毒侵染性克隆载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的带有gfp基因的重楼花叶坏死病毒侵染性克隆载体的构建方法，其特征在于，所述步骤（1）中重楼花叶坏死病毒cdna全长的获取是以感染了pmnv的重楼植株叶片为模板，使用引物pmnv(a)r反转录得到pmnv的cdna，再使用pmnv特异引物扩增得到pmnv全基因组的cdna序列，同时在病毒基因组的3’端加入56个a碱基；所述引物如下所示：

4.根据权利要求2所述的带有gfp基因的重楼花叶坏死病毒侵染性克隆载体的构建方法，其特征在于，所述步骤（2）中线性化pcb301-hdv-2µ载体的获取是以质粒pcb301-hdv-2µ为模板，根据pcb301-hdv-2µ序列设计引物，利用反向pcr扩增质粒pcb301-hdv-2µ，使质粒线性化；所述引物如下所示：

5.根据权利要求2所述的带有gfp基因的重楼花叶坏死病毒侵染性克隆载体的构建方法，其特征在于，所述步骤（3）中以带gfp的tmv侵染性克隆载体为模板，根据mgfp序列设计引物扩增获取mgfp序列；所述引物如下所示：

6.一种携带重楼花叶坏死病毒侵染性克隆载体的农杆菌菌株，其特征在于，由权利要求1所述的带有gfp基因的重楼花叶坏死病毒侵染性克隆载体转化到农杆菌中获得。

技术总结
本发明涉及一种带有GFP基因的重楼花叶坏死病毒侵染性克隆载体及其构建方法，属于植物病毒学和基因工程领域。本发明中带GFP基因的重楼花叶坏死病毒侵染性克隆载体，是利用酵母重组的方法，将PMNV全基因组RNA对应的cDNA全长序列克隆至pCB301‑HDV‑2µ载体的双35S启动子和终止子NOS之间，并把绿色荧光蛋白报告基因插入到PMNV的NIb蛋白和CP蛋白之间，即获得pCB301‑PMNV‑GFP重组载体。本发明利用酵母同源重组技术构建的PMNV侵染性克隆载体是重楼上植物病毒的第一个侵染性克隆，本发明中构建的pCB301‑PMNV‑GFP载体能稳定高效系统侵染模式植物本生烟，并在本生烟体内高效表达GFP。

技术研发人员：李凡,何鹏,兰平秀,谭冠林,陈小姣,罗恒明
受保护的技术使用者：云南农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15