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胶原蛋白产生促进剂及包含其的皮肤外用剂的制作方法

花匠小妙招
2024-08-14 15:21

胶原蛋白产生促进剂及包含其的皮肤外用剂的制作方法
胶原蛋白产生促进剂及包含其的皮肤外用剂
相互参照
1.本技术主张基于在日本于2021年4月23日提出申请的日本特愿2021-073458和于2021年9月24日提出申请的日本特愿2021-155274号的优先权，该申请中记载的内容全部通过参照而直接援用到本说明书中。另外，本技术中引用的全部专利、专利申请和文献中记载的内容全部通过参照而直接援用到本说明书中。
技术领域
2.本发明涉及一种用于促进胶原蛋白产生的制剂和含有该制剂的皮肤外用剂等，所述用于促进胶原蛋白产生的制剂含有山奈酚糖苷、其衍生物或它们的盐作为有效成分。

背景技术：

3.肌肤因年龄增长等内在因素、紫外线、活性氧等外在因素，本来维持的收缩性、柔软性、保湿性等功能减弱，产生各种问题。例如，对于眼下的皱纹、眼角的皱纹来说，认为其主要原因是年龄增加导致的胶原蛋白
·
弹性蛋白的降低(弹力的降低)、产生真皮的细胞外基质的细胞数减少、胶原蛋白纤维的减少和变性、皮下脂肪组织的减少等，从而引起弹性损失。以往，作为这样的皱纹的改善方法，例如，作为化妆品
·
准医药品，可使用嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制成分(三氟化钠异丙基氧丙基氨甲酰基吡咯烷碳酰甲基丙基氨基羰基苯甲酰氨基乙酸酯(nei-l1))、保湿成分配合物(透明质酸、胶原蛋白、弹性蛋白)、高保湿成分(凡士林、神经酰胺、透明质酸)、弹力改善成分(维生素c衍生物、视黄醇、胶原蛋白)、胶原蛋白促进成分(视黄醇)等。
4.山奈酚(
ケンフェロール
)是茶、西兰花、葡萄柚、卷心菜、羽衣甘蓝、豆类、菊苣、西洋韭葱、番茄、草莓、葡萄、抱子甘蓝、苹果、藜麦、西洋辣根等多种食用植物中所含的天然类黄酮的一种。对于含有山奈酚的天然类黄酮，进行了着眼于其多种生理作用的研究，例如，包括以下报告：山奈酚糖苷是用于使康乃馨的花色变蓝的显色辅助因子(copigment)(参照非专利文献1)、山奈酚类似物或其糖苷具有提高运动效率、减轻疲劳和改善动态视力等作用(参照专利文献1)。现有技术文献
5.非专利文献非专利文献1：y.fukui,y.tanaka,t.kusumi,t.iwashita,k.nomoto,phytochemistry.2003may；63(1)：15-23.专利文献
6.专利文献1：wo2019/044964

技术实现要素：

发明要解决的课题
7.本发明要解决的课题是发现一种含有保持皮肤的柔软性、赋予肌肤复原力(弹力)
的有效成分的原材料(制剂)等。用于解决问题的技术方案
8.为了解决上述课题，本发明人等进行深入研究，结果发现期望的天然物质(康乃馨的花等)中所含的山奈酚糖苷具有促进胶原蛋白产生、保持皮肤的柔软性、对皮肤赋予复原力(弹力)的作用等，从而完成本发明。即，本发明包括以下实施方式。
9.[1]一种用于促进胶原蛋白产生的制剂，其含有由下述式(i)表示的化合物、其有机酸酯或它们的盐，式(i)中，r1表示氢原子或鼠李糖基，r2表示葡萄糖基或鼠李糖基。[2]一种用于促进女性激素作用的制剂，其含有由式(i)表示的化合物、其有机酸酯或它们的盐。[3]根据[1]记载的用于促进胶原蛋白产生的制剂、或、[2]记载的用于促进女性激素作用的制剂，其中，由式(i)表示的化合物为由下述式(ii)表示的化合物，
[0010]
[4]根据[1]记载的用于促进胶原蛋白产生的制剂、或者、[2]记载的用于促进女性激素作用的制剂，其中，由式(i)表示的化合物为由下述式(iii)或(iv)表示的化合物，
[0011][0012]
[5]根据[1]～[4]中任一项记载的制剂，其中，有机酸酯是式(i)～式(iv)中的任意一种化合物的苹果酸酯。[6]一种皮肤外用剂，其含有[1]～[5]中任一项记载的制剂。[7]根据[6]记载的皮肤外用剂，其用于改善皱纹。[8]根据[6]或[7]记载的皮肤外用剂，其用于增加皮肤的胶原蛋白密度。发明效果
[0013]
本发明的制剂，例如，在作为化妆品、准医药品的成分使用时，具有保持皮肤的柔软性、赋予肌肤复原力(弹力)的效果等。
附图说明
[0014]
图1表示从康乃馨花提取物中分离本发明的有效成分的方法的概略。图2表示测定正常人成人皮肤成纤维细胞中的促进胶原蛋白产生的作用而得到的结果。图3表示测定人成纤维细胞增殖能力得到的结果。图4表示人的皮肤监测试验的测定部位。图5表示确认试验例3的皱纹改善效果得到的结果。图6表示确认试验例4的真皮胶原蛋白纤维密度改善效果的结果。图中的白为
图7表示试验例5中使用的皮肤的力学参数的测定方法。图8表示试验例5的结果。图9表示确认试验例6的痕迹预防效果得到的结果。
具体实施方式
[0015]
接着，参照附图说明本发明的各实施方式。应予说明，以下说明的各实施方式并不限定权利要求书涉及的发明，另外，在各实施方式中说明的各要素及其组合的全部并不一定是本发明的解决方法所必需的。
[0016]
(用于促进胶原蛋白产生的制剂)在一个实施方式中，本发明提供含有以下有效成分的用于促进胶原蛋白产生的制剂。本实施方式的制剂含有由下述式(i)表示的化合物、其有机酸酯或它们的盐作为有效成分，
[0017]
其中，在上述式中，r1表示氢原子或鼠李糖基，r2表示葡萄糖基或鼠李糖基。在上述式(i)中，在r1为鼠李糖基且r2为葡萄糖基时的化合物能够由上述式(ii)表示，也称为山奈酚-3-(6
”’‑
鼠李糖基-2
”’‑
葡萄糖基-葡萄糖苷)或山奈酚-3-o-[2-o-β-d-葡萄糖基-6-o-α-鼠李糖基]-β-d-葡萄糖苷(cas no.55696-58-7)。为一个鼠李糖和两个葡萄糖以支链状结合而成的山奈酚糖苷。在后述的实施例中，称为kmp-2。式(i)的化合物羟基可以结合苹果酸、琥珀酸和/或丙二酸等有机酸，通过添加这些糖、有机酸，使作为糖苷配基的山奈酚容易溶解于水而稳定化。
[0018]
另外，在式(i)中，在r1为氢原子且r2为葡萄糖基时的化合物能够由上述式(iii)表示，在后述的实施例中称为kmp-3。此外，在式(i)中，在r1为氢原子且r2为鼠李糖基时的化合物能够由上述式(iv)表示，在后述的实施例中称为kmp-5。
[0019]
应予说明，由上述式(i)～(iv)表示的化合物可以是游离体的状态，在羟基具有适度的酸性的情况下也可以是盐的形态。作为羟基的盐，例如可举出：锂盐、钠盐、钾盐等碱金属盐类；镁盐、钙盐等碱土类金属盐类；三甲胺盐、三乙胺盐、二环己胺盐、乙醇胺盐、二乙醇胺盐、三乙醇胺盐、普鲁卡因胺盐等脂肪族胺盐；n,n-二苄基乙二胺等芳烷基胺盐；吡啶盐、甲基吡啶盐、喹啉盐、异喹啉盐等杂环芳香族胺盐；精氨酸盐、赖氨酸盐等碱性氨基酸盐；四甲基铵盐、四乙基铵盐、苄基三甲基铵盐、苄基三乙基铵盐、苄基三丁基铵盐、甲基三辛基铵盐、四丁基铵盐等季铵盐；铵盐等。另外，本实施方式的化合物(i)的游离体或羟基的盐有时也以水合物的形式存在。
[0020]
从康乃馨提取上述有效成分时，作为可用作提取原料的部位，例如为花瓣等。作为提取方法，除使用溶剂直接提取而得到的方法以外，还能够在实施压榨处理后得到的压榨液和/或残渣中添加溶剂进行提取。优选使用50％乙醇水溶液作为提取溶剂。在本实施方式中，优选使用利用康乃馨的花瓣的乙醇提取物。提取液中的有效成分的含量能够以山奈酚糖苷换算值的形式进行测定。在本说明书中，“山奈酚糖苷换算值”是指：将本发明的有效成分的量换算成特定的标准品的质量而得到的值。作为标准品，例如可举出：山奈酚-3-葡萄糖苷等容易获得的山奈酚糖苷。具体而言，例如，利用反相hplc(色谱柱：imtakt uk-c18)分析提取液，能够将利用甲醇：磷酸＝37：63的洗脱液分离时的以340nm的吸光度检测得到的峰面积代入使用各种浓度的山奈酚-3-葡萄糖苷制作的标准曲线进行换算。
[0021]
本实施方式的用于促进胶原蛋白产生的制剂可以是上述有效成分本身，或者也可以是以规定浓度以上含有该有效成分的组合物。优选为康乃馨的花等植物提取物的形态。本实施方式的制剂中含有的上述有效成分的量，只要是将该制剂添加到皮肤外用剂等时发挥促进胶原蛋白产生的作用的量即可，没有特别限制。例如，在将以质量换算计0.1％的用于促进胶原蛋白产生的制剂添加到皮肤外用剂中时，以即使稀释1000倍也能发挥促进胶原蛋白产生的作用的浓度含有该有效成分即可。因此，在本实施方式的用于促进胶原蛋白产生的制剂中含有的上述有效成分的量的下限和上限，以山奈酚糖苷换算计，该换算值的下限优选为1μg/ml，更优选为5μg/ml，进一步优选为10μg/ml，该换算值的上限优选为1000μg/ml，更优选为750μg/ml，更优选为500μg/ml，进一步优选为250μg/ml。
[0022]
在本实施方式的用于促进胶原蛋白产生的制剂中含有的上述各有效成分的量，以山奈酚糖苷换算值计，该换算值的下限优选为0.05μg/ml，更优选为0.5μg/ml，进一步优选为5μg/ml，该换算值的上限优选为500μg/ml，更优选为250μg/ml，进一步优选为100μg/ml。
[0023]
本实施方式的用于促进胶原蛋白产生的制剂，例如能够包含于皮肤外用剂、饮食品或医药组合物。作为饮食品或医药组合物，例如，能够用作功能性标识食品、特定保健用食品、健康食品、营养辅助食品(补充品)、医疗用食品等饮食品或口服用组合物。此时，除上述有效成分以外，还能够添加药学上可接受的基剂、载体、食品中能够使用的添加物等，制成口服给药制剂。以下详细说明含有本实施方式的用于促进胶原蛋白产生的制剂的皮肤外用剂。
[0024]
(女性激素)女性激素是支配生殖功能的甾体激素，是雌激素(卵泡激素)和黄体酮(黄体激素)的总称，例如是17β-雌二醇、雌酮、雌三醇、17α-雌二醇、乙炔雌二醇、它们的缀合物，或类似于这些的女性激素样物质。其中，雌激素起到女性生殖器的发育、功能维持等作用，且被用作显示发情作用的激素和具有类似作用的物质的总称。在自然界中存在雌酮、雌二醇、雌三醇、雌四醇，其中，雌二醇为主要成分。另外，还已知具有与这些相同的生物活性的合成雌激素，除已烯雌酚(stilbesterol)等合成型的一部分以外，雌激素具有茋结构。
[0025]
雌激素的分泌源主要是卵巢的颗粒膜细胞，但也从妊娠时的胎儿胎盘系统、肾上腺、卵巢等分泌。来自卵巢的雌激素的分泌由从下垂体前叶分泌的性腺刺激激素支配，相反地，可以确认到雌激素对间脑垂体型的反馈作用，通过两者的相互作用，性周期成立。
[0026]
雌激素通过其受体发挥作用，主要的生理作用是子宫内膜的增殖、子宫肌的发育、第二性征的显现、月经周期成立的媒介、妊娠时引起母体变化、促进乳腺管的增殖分泌等。
另外，雌激素不仅在靶组织即间脑-垂体前叶-生殖器和乳腺中，而且在各种组织中具有受体，因此不仅具有对生殖功能的上述作用，而且作用于脑、心血管、骨骼、皮肤、其他全身的组织，与成人女性的健康密切相关，成为创造女性的激素。因此，在本说明书中，将促进一个或多个上述例示的女性激素具有的作用的制剂称为“用于促进女性激素作用的制剂”或“女性激素样作用的促进剂”，两者能够同义使用。
[0027]
(皮肤外用剂的形态)本发明的一个实施方式中的皮肤外用剂的特征在于，含有上述用于促进胶原蛋白产生的制剂。本实施方式的皮肤外用剂可以仅含有上述有效成分的一种，也可以组合含有两种以上。本实施方式的皮肤外用剂通过含有上述用于促进胶原蛋白产生的制剂，发挥优异的针对皱纹形成的预防或改善作用。另外，本实施方式的皮肤外用剂也可以发挥针对皱纹形成的预防或改善作用以外的作用。作为这样的作用，可举出保湿作用、光线性角化症或非光线性角化症改善作用、皮肤的剥离、表皮更新的刺激和老化改善作用等。
[0028]
本实施方式的皮肤外用剂，除必需成分即用于促进胶原蛋白产生的制剂以外，还能够含有通常在皮肤外用剂中使用的任意成分。作为这样的任意成分，能够含有角鲨烷、凡士林、微晶蜡等烃类、霍霍巴油、巴西棕榈蜡、油酸辛基十二烷基酯等酯类，橄榄油、牛油、椰子油等甘油三酯类、硬脂酸、油酸、视黄酸等脂肪酸、油醇、硬脂醇、辛基十二烷醇等高级醇、磺基琥珀酸酯、聚氧乙烯烷基硫酸钠等阴离子表面活性剂类、烷基甜菜碱盐等两性表面活性剂类、二烷基铵盐等阳离子表面活性剂类、山梨糖醇酐脂肪酸酯，脂肪酸单甘油酯、它们的聚氧乙烯加成物、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯脂肪酸酯等非离子表面活性剂类、聚乙二醇、甘油、1,3-丁二醇等多元醇类，增粘-凝胶化剂、抗氧化剂、紫外线吸收剂、染色剂、防腐剂、粉体等。
[0029]
按照常规方法处理本实施方式的用于促进胶原蛋白产生的制剂和任意成分，可举出安瓿、胶囊、粉末、颗粒、液体、凝胶、气泡、乳液、片、雾(mist)、喷雾剂等利用上的适当形态的1)医药品类、2)准医药品类、3)局所用或全身用皮肤外用剂类(例如，化妆水、乳液、乳霜、软膏、洗剂、油、面膜等基础化妆品、固体肥皂、液体肥皂、洗手液等洁面剂或皮肤清洗剂、按摩用剂、清洁用剂、除毛剂、脱毛剂、剃须处理剂、须后水、须前水、剃须膏、粉底、口红、腮红、眼影、眼线膏(eyeliner)、睫毛膏(mascara)等彩妆化妆品、香水类，美甲剂、指甲油、指甲油去除剂、巴布剂、膏药剂、贴剂、片材剂、粘贴剂、气溶胶剂等)、4)应用于头皮
·
头发的药用或/和化妆用制剂类(例如，洗发剂、护发素剂、头发处理剂、头发预处理剂、烫发持久液、染发料、整发料、焗油剂、育发
·
养发料、巴布剂、膏药剂、胶带剂、片材剂、气溶胶剂等)、5)放置在洗浴水中使用的沐浴用剂、6)其他的防腋臭剂或除臭剂、止汗剂、卫生用品、卫生棉类、湿巾等。本实施方式的皮肤外用剂只要是能够适应皮肤的剂型，则能够是任意的剂型，但由于有效成分浸透到皮肤而发挥效果，因此优选对皮肤的适应性良好的洗剂、乳液、乳霜、精华等剂型。
[0030]
本实施方式的皮肤外用剂中含有的上述用于促进胶原蛋白产生的制剂的量的下限和上限，相对于皮肤外用剂整体量，以总量计，该下限优选为0.001质量％，更优选为0.01质量％，进一步优选为0.1质量％，该上限优选为10质量％，更优选为5质量％，进一步优选为2质量％。
[0031]
本实施方式的皮肤外用剂中含有的上述有效成分的含量的下限和上限，相对于皮
肤外用剂整体量，以山奈酚糖苷换算值计，该换算值的下限优选为10ng/ml，更优选为50ng/ml，进一步优选为100ng/ml，该换算值的上限优选为10μg/ml，更优选为7.5μg/ml，更优选为5μg/ml，进一步优选为2.5μg/ml。
[0032]
本实施方式的皮肤外用剂中含有的上述有效成分的量，以山奈酚糖苷换算值计，该换算值的下限优选为0.05μg/ml，更优选为0.5μg/ml，进一步优选为5μg/ml，该换算值的上限优选为5μg/ml，更优选为2.5μg/ml，进一步优选为1μg/ml。
[0033]
以下列举实施例，更详细说明本发明，但本发明不受这些实施例的任何限制。应予说明，在以下实施例中，表示各种成分的添加量的数值的单位％是指质量％。实施例
[0034]
[实施例1]康乃馨花提取物的制备将康乃馨的新鲜的花部(花萼以上)的干燥物100g在常温下浸渍于1kg的50％乙醇水溶液一周后过滤，得到粗提取液约0.95kg。接着，将粗提取液浓缩并除去乙醇后，加入50％丁二醇水溶液，得到0.95kg液体的康乃馨花提取物。该提取液中的有效成分的浓度，通过使用山奈酚-3-葡萄糖苷(merck)作为标准品的标准曲线，换算在以下分析条件下进行hplc分析时的峰面积。得到的提取液中的有效成分的浓度，以山奈酚糖苷换算值计，为102.1μg/ml(90μg/ml～110μg/ml)。
[0035]
lc1装置：shimadzulc-20a柱：mightysil rp-18gp 250
×
4.6mm(5μm)流动相：ch3cn：0.1％h3po4＝(10：90)
→
100：0)/30分钟流速：1ml/分钟温度：40℃检测器：spd m10avp 340nm
[0036]
[实施例2]山奈酚糖苷的纯化使用疏水吸附树脂从实施例1中制备的康乃馨花提取物的50％乙醇水溶液进行纯化。将分离康乃馨花提取物的有效成分的方法的概略示于图1。康乃馨花提取物的50％乙醇水溶液利用最初填充有diaion hp20(三菱化学株式会社)的柱进行粗分级。利用水稀释利用40％乙醇洗脱得到的馏分03，进而使其吸附在相同的柱上后，在利用30％乙醇水溶液洗脱得到的馏分13中，回收后述的促进胶原蛋白产生的活性。对于该馏分13，进行基于以下条件的分选液相色谱分选lc1，回收主峰。
[0037]
分选lc1装置：agilent technologies(agilent 1260infinity ii)柱：develosil ods，7μm，20
×
250mm流速：10ml/分钟检测器：diode array detector wr 340nm流动相：meoh：0.1％甲酸＝37：63
[0038]
由于该主峰中含有多个成分，因此对该级分进一步在以下条件下进行液相色谱分选lc2时，得到单一分开的两个峰(馏分21和22)。
[0039]
分选lc2
装置：shimadzu 10a柱：mightysil rp-18gp 4.6
×
250mm流速：1ml/分钟检测器：spd m10avp 340nm流动相：meoh：0.1甲酸＝35：65
[0040]
对馏分21和22中含有的化合物的浓度执行以下条件(lc2)，其结果是，以山奈酚糖苷换算值计，分别为43.4μg/ml和58.7μg/ml。
[0041]
lc2装置：shimadzu10a流动相：甲醇：磷酸＝37：63流速：0.7ml/分钟柱：imtakt unison uk-c18温度：40℃检测器：spd m10avp 340nm
[0042]
利用nmr分析馏分21和22中回收得到的化合物，结果可知，分别为山奈酚-3-(6”'-鼠李糖基-2”'-(6-苹果酰葡萄糖基)-葡萄糖苷)(kmp-1)和山奈酚-3-(6”'-鼠李糖基-2”'-葡萄糖基-葡萄糖苷)(kmp-2)。kmp-1是在kmp-2的末端葡萄糖基的6位加成有苹果酸而得到的化合物。此外，利用核磁共振装置jeol(日本电子株式会社)jnm-eca500测定得到的kmp2的测定数据示于以下表1。应予说明，表1所示的“a”表示重叠信号(overlapping signals)。
[0043]
[表1]1h和
13
c nmr谱数据a：重叠信号
[0044]
[试验例1]胶原蛋白产生量的测定
在给药康乃馨花提取物中含有的上述有效成分的情况下，确认胶原蛋白产生量(合成能力)是否变化。细胞使用正常人成人皮肤成纤维细胞。前培养使用含有5％fbs的dmem，在本实验中使用含有1％fbs的dmem。在5％co2、37℃的条件下培养。
[0045]
将5
×
104个正常人成人皮肤成纤维细胞(cell applicaions)接种于24孔板，培养至75％汇合状态。然后，替换成含有1％fbs的dmem，培养24小时后，替换成新的含有1％fbs的dmem，添加试样(实施例1中制备得到的康乃馨花提取物和实施例2中纯化得到的kmp-1和kmp-2)，培养72小时。然后，利用human piiinp(n-terminal procollagen iii propeptide)elisa试剂盒(elabscience公司制造)评价培养基中的3型胶原蛋白的浓度。将结果示于图2。应予说明，试样中的有效成分的浓度利用hplc测定，利用50％丁二醇水溶液制备成与康乃馨花提取物中含有的各化合物的浓度相同。
[0046]
图2表示以未添加组(表示为cnt)的3型胶原蛋白合成能力为1时的各试样的3型胶原蛋白合成能力。在图2中，表示为粗提取物(crude)的实施例1的提取物添加组为1.30，表示为kmp1的kmp1添加组为1.21，以及表示为kmp-2的kmp-2添加组为1.52。由图2可知，通过添加康乃馨花提取物、kmp-1和kmp-2，促进了3型胶原蛋白的产生。
[0047]
[试验例2]人成纤维细胞增殖能力的测定对实施例1中得到的康乃馨花提取物和实施例2中纯化得到的两个级分(kmp-1和kmp-2)的人成纤维细胞增殖能力的有无进行评价。使用含有5％fbs的dmem培养基，在96孔板中以成为2.5
×
103个/孔的细胞数的方式接种正常人皮肤成纤维细胞(cell applicaions)。播种后，在37℃、5％co2的环境下，培养该正常人皮肤成纤维细胞24小时。然后，由含有5％fbs的dmem培养基替换成含有1％fbs的dmem培养基后，将以下试样给药至各孔，在37℃、5％co2的环境下，培养该正常人皮肤成纤维细胞5天。培养5天后，使用cell counting kit-8(dojindo)，测定各组(试样1～试样7的组)的正常人皮肤成纤维细胞数。该测定在各组(试样1～试样7的组)中各进行6个试样。
[0048]
·
试样1的组：作为对照组，给药规定量的50％丁二醇水溶液。
·
试样2的组：给药实施例1中得到的康乃馨花提取物，使其成为0.5％。
·
试样3的组：给药在实施例1中得到的康乃馨花提取物，使其成为1％。
·
试样4的组：给药kmp-1，使其成为0.5％。
·
试样5的组：给药kmp-1，使其成为1％。
·
试样6的组：给药kmp-2，使其成为0.5％。
·
试样7的组：给药kmp-2，使其成为1％。应予说明，试样4～7中含有的有效成分的浓度，对应于含有康乃馨花提取物的组(试样2或3)，作为被检体使用：试样4和6利用50％丁二醇水溶液制备成与试样2中含有的各化合物相同浓度的试样，试样5和7利用50％丁二醇水溶液制备成与试样3中含有的各化合物相同浓度的试样。
[0049]
将测定结果示于图3。在将试样1的组(表示为cnt)的成纤维细胞增殖能力设为1时，试样2和3的组(表示为粗提取物(crude))分别显示1.33和1.75，试样4和5的组(表示为kmp-1)分别显示1.03和1.34，试样6和7的组(表示为kmp2)分别显示1.16和1.10的成纤维细胞增殖能力。根据图3可知，在kmp-1为1％时，康乃馨花提取物浓度依赖地促进成纤维细胞的增殖。另一方面，kmp-2对细胞增殖没有影响。
[0050]
[实施例3]洗剂的制作按照以下方式制作以下监测试验中使用的洗剂。按照表2所示的组成，制作含有1％的实施例1中制备得到的康乃馨花提取物的洗剂(表2洗剂)。按照表3所示的组成制作安慰剂(不含有该康乃馨花提取物的洗剂)。
[0051]
[表2]
[0052]
[表3]
[0053]
[试验例3]人的皮肤监测试验(皱纹改善效果的确认)在健康的30多岁至40多岁的女性12名(平均年龄41.2岁)的脸的嘴角旁边(法令纹，参照图4)涂布表2洗剂(在表2记载的洗剂中，包含康乃馨花提取物的洗剂)和安慰剂(在表3记载的洗剂中，不包含康乃馨花提取物的洗剂)，由此在2020年12月至1月之间进行试验。该受试者，作为自觉症状，感到皮肤的松弛、细纹和/或皮肤的脆弱性。将表2洗剂以规定间隔涂布于受试者的面部的左半部分，将安慰剂以规定间隔涂布于受试者的面部的右半部分。该规定间隔为每天两次(早晚)涂布1个月。然后，在这些洗剂涂布前的第0天(基线)至涂布洗剂后的第4周，对规定部位表面以3d照射特定波长的光进行拍摄并进行图像处理，由此测定皱纹整体的大小，皱纹的平均宽度和平均深度(测定装置；皮肤分析仪“antera3d
tm”，
gadelius medical制造)。将其结果示于图5。
[0054]
图5表示：对于皱纹整体的大小、皱纹的平均宽度和平均深度，将第0天的值设为100，涂布安慰剂(图5中记为“安慰剂”)和表2洗剂(图5中记为“表2洗剂”)时的相对值。如图5(a)所示，安慰剂涂布组的皱纹整体的大小为101.4，表2洗剂涂布组的皱纹整体的大小为94.7。如图5(b)所示，安慰剂涂布组的皱纹平均宽度为100.0，表2洗剂涂布组的皱纹平均宽度为97.5。另外，如图5(c)所示，安慰剂涂布组的皱纹平均深度为101.6，表2洗剂涂布组的皱纹平均深度为93.6。根据这些结果，通过表2洗剂的涂布，皱纹整体的大小、皱纹的平均宽度和平均深度都变小。应予说明，柱状图的各个值以12人的测定值的平均值和标准误差表示。图中，*和**表示在与第0天的测定值进行比较时的wilcoxon检验中，分别存在p《0.05和p《0.01的显著差异，和表示在student’s t-检验中p《0.05和p《0.01的显著差异。
[0055]
[试验例4]人的皮肤监测试验(真皮胶原蛋白纤维密度改善试验)将测定部位从脸的嘴角旁边(法令纹)变更为脸颊(鼻翼侧部，参照图4)，除此以外，在与试验例3相同的条件下涂布各洗剂，使用dermalab(注册商标)combo测定该部位的真皮胶原蛋白纤维密度。将其结果示于图6。这是能够作为根据从皮肤表面入射的超声波的反射强度(回波)的不同而将皮肤的深度方向上的胶原蛋白纤维的密度可视化和定量化的装置进行利用的装置。
[0056]
通过dermalab观测涂布有表2洗剂的受试者的第0天和第4周的鼻翼侧部内的状态，将得到的真皮内图像示于图6(a)。该测定装置的参数即强度评分(回波强度)作为胶原蛋白纤维密度的指标被图像化，该值越大胶原蛋白越丰富且真皮胶原蛋白的状态越好。图像中的亮部(图6的箭头的部位)表示高密度，暗部表示低密度。表皮的超声波的反射性高，成为高反射回波，进行白色图像处理。由该图像可知，与第0天相比，亮部增加，真皮内的胶原蛋白纤维密度提高。将该强度评分数值化，作为胶原蛋白密度。图6(b)表示：对于胶原蛋白密度将第0天的值设为100，涂布安慰剂(图6(b)中记为“安慰剂”)和表2洗剂(图6(b)中记为“表2洗剂”)时的相对值。如图6(b)所示，安慰剂涂布组为96.8，与此相对，表2洗剂涂布组为105.2。根据这些结果，通过表2洗剂的涂布，真皮胶原蛋白纤维密度显著增加。应予说明，柱状图的各个值是12人的测定值的平均值和标准误差。图中，表示在student’s t-检验中存在p《0.01的显著差异。
[0057]
[试验例5]人的皮肤监测试验将测定部位从脸的嘴角旁边(法令纹)变更为下眼睑部(参照图4)除此以外，在与试验例3相同的条件下涂布各洗剂，使用cutometer mpa580测量该部位的皮肤的柔软性和复原力。利用cutometer的弹性测定是使用吸引口2毫米的探针以500mb抽吸压抽吸5秒钟，然后分析开放时变形的皮肤的位移。图7表示相对于横轴的测定时间，纵轴的位移。图中(a)表示柔软性，(b)表示复原力，b/a表示弹性(变形后的物体欲恢复到原来形状的性质)。由于弹性随着年龄增加而降低，因此弹性越高越好。
[0058]
将其结果示于图8。图8(a)表示柔软性的结果，图8(b)表示复原力的结果，以及图8(b/a)表示弹性的结果。分别表示：以将第0天的值设为100，涂布安慰剂(图8中记为“安慰剂”)和表2洗剂(图8中记为“表2洗剂”)时的相对值。如图8(a)所示，安慰剂涂布组的柔软性为99.5，与此相对，表2洗剂涂布组的柔软性为104.6。如图8(b)所示，安慰剂涂布组的复原力为99.6，表2洗剂涂布组的复原力为109.4。另外，如图8(b/a)所示，安慰剂涂布组的弹性
el022654hu。
[0063]
(1)培养成人人毛乳头细胞的工序将成人人毛乳头细胞以2
×
104个/孔的细胞数接种于24孔板。该播种后，将该细胞在5％co2、37℃的条件下培养24小时。该培养后，替换为含有1％fbs的dmem培养基。在该替换后的培养基中，将该细胞在5％co2、37℃的条件下培养24小时。
[0064]
(2)(1)的工序后的、添加t等的工序在(1)的工序后，将培养基替换为1％fbs/dmem培养基。此时，在1％fbs/dmem培养基中，在各组中按照以下方式进行t等的添加(或未添加)。应予说明，为了测定下述dht的量，各组分别制作6个试样(n＝6)，对于进行5α-还原酶ii型的量的测定的组，各组分别制作4个试样(n＝4)。
·
未添加组：未添加t的组。
·
对照组：添加t(最终浓度10nm)的组。
·
e2组：添加t(最终浓度10nm)和e2(最终浓度10nm)的组。在该试验例7中，定位为阳性对照组的实验组(参考文献：eur.j.dermatol.2001,11,195-198，influence of estrogens on the androgen metabolism in different subunits of human hair follicle.)。
·
提取物0.5组：添加t(最终浓度10nm)和提取物0.5％的组。
·
提取物1.0组：添加t(最终浓度10nm)和提取物1.0％的组。
·
kmps0.025组：添加t(最终浓度10nm)和kmps0.025％的组。设想与提取物0.5组中含有的kmps相同的量而进行该添加(添加0.025％的kmps)。
·
kmps0.050组：添加t(最终浓度10nm)和kmps0.050％的组。设想与提取物1.0组中含有的kmps相同的量而进行该添加(添加0.050％的kmps)。
[0065]
制成这些组后，在5％co2、37℃的条件下培养72小时。然后，回收上清，使用二氢睾酮elisa试剂盒测定上清中的dht量。将该测定的结果示于表4。
[0066]
按照以下方式进行计算，计算出表4记载的数值(相对值)。首先，计算各组(n＝6)的测定结果的平均值。接着，对于该平均值，将各组的对照组的数值设为1，各组的数值计算出相对于对照组的相对值。**表示在student’s t-检验中相对于对照组确认到显著差异(p《0.01)的数据。表示在dunnett's检验中相对于对照组确认到显著差异(p《0.01)的数据。
[0067]
此外，使用在该培养后利用添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂得到的passive lysis buffer(promega公司制造)进行均质化处理的细胞悬浮液，使用人3
‑‑
氧代-5α-类固醇-4-脱氢酶2(srd5a2)elisa试剂盒测定5α-还原酶ii型的量。得到的值通过bradford法求出细胞悬浮液的蛋白质量，进行校正。将该测定的结果示于以下表5。应予说明，该测定参考论文(j.cosmet.dermatol.2019，18，414-421)进行。
[0068]
按照以下方式进行计算，计算出表5记载的数值(相对值)。首先，计算各组(n＝4)的测定结果的平均值。接着，对于该平均值，将各组的对照组的数值设为1，各组的数值计算出相对于对照组的相对值。**表示在student’s t-检验中相对于对照组确认到显著差异(p＜0.01)的数据。表示在dunnett
′
s检验中相对于对照组确认到显著差异(p＜0.01)的数据。
[0069]
[表4]
[0070]
[表5]
[0071]
根据表4和表5所示的结果能够确认到：即使添加提取物和kmps，也会具有与e2的添加组相同的效果，即女性激素样作用。雌激素(雌二醇)增加性激素结合球蛋白(shbg)，抑制活化型睾酮(游离睾酮)和雄激素受体的活性化(参考文献：j am acad dematol.2016，74，945-973，参考文献：endocr rev.2000，21，363-392)。雌激素抑制5α-还原酶活性，减少从睾酮向dht的转化(参考文献：j am acad dermatol,2019,80,1509-1521，参考文献：eur j obstet gynecol reprod biol.2004,vol112,136-141)。dht与女性型脱发症(fphl)有关，毛囊内的5α-还原酶量与健康人相比显示高的值(参考文献：arch dermatol res.2018,310,77-83)。因此，根据这些参考文献的记载，表4和表5所示的结果被认为是与男性激素作用拮抗的女性激素样作用。
[0072]
[实施例4]康乃馨花提取物的制备将康乃馨(cuine(日文原文为
キュイン
))的新鲜的花部(花萼以上)的干燥物100g在常温下浸渍于1kg的50％乙醇水溶液一周后过滤，得到粗提取液约0.95kg。接着，将粗提取液浓缩除去乙醇后，加入50％丁二醇水溶液，得到0.95kg的液体的康乃馨(cuine)的花提取物。
[0073]
[实施例5]山奈酚糖苷(kmp-3)的纯化使用疏水吸附树脂从实施例4中得到的康乃馨(cuine)的花提取物的50％乙醇水溶液，通过与实施例2相同的方法进行纯化。即，如图1所示，康乃馨花提取物的50％乙醇水溶液利用最初填充有diaion hp20(三菱化学株式会社)进行粗分级。利用水稀释利用40％乙醇洗脱得到的馏分03(fr03)，进而使其吸附于相同的柱后，对于利用40％乙醇水溶液洗脱得到的馏分14(fr14)，进行基于以下条件的分选液相色谱分选lc3，回收主峰(馏分31)。
[0074]
分选lc3装置：agilent technologies(agilent 1260infinity ii)柱：develosil ods，7μm，20
×
250mm
流速：10ml/分钟检测器：diode array detector wr 340nm流动相：meoh：0.1％甲酸＝37：63
[0075]
对于馏分31中含有的化合物的浓度进行以下条件(lc3)，其结果，以山奈酚糖苷换算值计为48.66μg/ml。
[0076]
lc3装置：shimadzu 10a流动相：甲醇：磷酸＝35：65流速：0.8ml/分钟柱：imtakt unison uk-c18温度：40℃检测器：spd m10avp 340nm
[0077]
利用nmr分析回收到馏分31中的化合物，结果可知：山奈酚3-(2”'-葡萄糖基-葡萄糖苷)(kmp-3)。应予说明，将利用核磁共振装置jeol(日本电子株式会社)jnm-eca500测定得到的kmp3的测定数据示于以下表6。
[0078]
[表6]kmp-3的1h nmr(500mhz)谱数据
a，e
：重叠信号
b-d
：可交换的
[0079]
[实施例6]山奈酚糖苷(kmp-5)的纯化对实施例4中制备得到的康乃馨(cuine)花提取物的50％乙醇水溶液进行基于以下条件的分选液相色谱分选lc4，回收主峰。
[0080]
分取lc4装置：agilent technologies(agilent 1260infinity ii)柱：develosil ods，7μm，20
×
250mm流速：10ml/分钟检测器：diode array detector wr 340nm
流动相：meoh：0.1％甲酸＝37：63
[0081]
对该水溶液中含有的化合物的浓度进行以下条件(lc4)，其结果，以山奈酚糖苷换算值计为53.53μg/ml。
[0082]
lc4装置：shimadzu 10a流动相：甲醇：磷酸＝35：65流速：0.8ml/分钟柱：imtakt unison uk-c18温度：40℃检测器：spd m10avp 340nm
[0083]
利用nmr分析回收到馏分41中的化合物，结果可知：是山奈酚-3-新橙皮苷(kmp-5)。应予说明，将利用核磁共振装置jeol(日本电子株式会社)jnm-eca500测定得到的kmp5的测定数据示于以下表7。
[0084]
[表7]kmp-5的1h nmr(500mhz)谱数据
[0085]
[试验例8]胶原蛋白产生量的测定将实施例4和5中纯化得到的两个级分(kmp-3和kmp-5)添加到细胞时，以及给药康乃馨花提取物中含有的上述有效成分时，确认胶原蛋白产生量(合成能力)是否发生变化。细胞使用正常人成人皮肤成纤维细胞。前培养使用含有5％fbs的dmem，本实验中使用含有1％fbs的dmem。在5％co2、37℃的条件下培养。
[0086]
将5
×
104个正常人成人皮肤成纤维细胞(cell applicaions)接种于24孔板，培养至75％汇合状态。然后，替换成含有1％fbs的dmem，培养24小时后，替换成新的含有1％fbs的dmem，添加以下试样，培养72小时。
[0087]
·
试样1的组：作为对照组给药规定量的50％丁二醇水溶液。
·
试样2的组：给药kmp-3，使其成为0.5％。
·
试样3的组：给药kmp-5，使其成为0.5％。应予说明，试样2和试样3中含有的有效成分的浓度，利用50％丁二醇水溶液制备成与康乃馨(cuine)花提取物中含有的各化合物的浓度相同。
[0088]
然后，使用human piiinp(n-terminal procollagen iii propeptide)elisa试剂盒(elabscience公司制造)测定培养基中的3型胶原蛋白的浓度。该测定在各组(试样1～试样3的组)中各进行5个试样。
[0089]
测定结果记载于以下。该测定结果表示在各组中测定得到的值的平均值。将试样1的组的平均值设为1时，试样2的组的平均值为1.283，试样3的组的平均值为1.379。该试样2和3的组的平均值是：对于试样1的组的平均值，在dunnett's检验中确认到相对于对照组的显著差异(p《0.01)。可知通过添加试样2和试样3的组，促进了3型胶原蛋白产生。
[0090]
以上，参照附图对本发明的实施方式(也包含实施例)进行了说明，但本发明的具体结构不限于此，在不脱离本发明的主旨的范围内，即使有设计变更等，也包含在本发明中。产业上的可利用性
[0091]
能够确认到：含有本发明的制剂的皮肤外用剂通过促进胶原蛋白产生，改善皮肤的柔软度和复原力，从而对皱纹改善是有效的等。因此，本发明的皮肤外用剂具有用作皱纹的改善用化妆品等的可能性。

技术特征：
1.一种用于促进胶原蛋白产生的制剂，其特征在于，含有由下述式(i)表示的化合物、其有机酸酯或它们的盐，在式(i)中，r1表示氢原子或鼠李糖基，r2表示葡萄糖基或鼠李糖基。2.一种用于促进女性激素作用的制剂，其特征在于，含有所述由式(i)表示的化合物、其有机酸酯或它们的盐。3.根据权利要求1或2所述的制剂，其中，所述由式(i)表示的化合物为由下述式(ii)表示的化合物，4.根据权利要求1或2所述的制剂，其中，所述由式(i)表示的化合物为由下述式(iii)或(iv)表示的化合物，
5.根据权利要求1～4中任一项所述的制剂，其中，所述有机酸酯是式(i)～式(iv)中的任一化合物的苹果酸酯。6.一种皮肤外用剂，其特征在于，含有权利要求1～5中任一项所述的制剂。7.根据权利要求6所述的皮肤外用剂，其用于改善皱纹。8.根据权利要求6或7所述的皮肤外用剂，其用于增加皮肤的胶原蛋白密度。

技术总结
本发明发现了一种含有保持皮肤柔软、对肌肤赋予复原力(弹力)的来自天然物质的有效成分的制剂等。一种用于促进胶原蛋白产生或用于促进女性激素作用的制剂，其含有由下述式(I)表示的化合物、其有机酸酯或它们的盐，式(I)中，R1表示氢原子或鼠李糖基，R2表示葡萄糖基或鼠李糖基。基。基。

技术研发人员：桥本雅和河合有香小岛弘之
受保护的技术使用者：一丸自然美健有限公司
技术研发日：2022.03.11
技术公布日：2023/3/28