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不同miRNA作为牡丹发芽、开花研究中内参基因的应用及其筛选方法

花匠小妙招
2025-07-08 10:04

本发明涉及分子生物学，尤其涉及不同mirna作为牡丹发芽、开花研究中内参基因的应用及其筛选方法。

背景技术：

1、牡丹(paeonia suffruticosa)是我国的传统名花，栽培历史悠久，有着很高的观赏价值和药用价值。同时，牡丹种子富含油脂，籽油不饱和脂肪酸含量高，尤其富含亚麻酸，具有非常高的营养保健价值。近年来，qrt-pcr技术越来越成为牡丹基因研究与分子育种的重要技术手段。而稳定的内参基因作为qrt-pcr的重要前提，在牡丹的相关研究中也越来越重要。前人对牡丹在切花开放时期、低温处理的花芽等实验条件下的内参基因进行了筛选(王彦杰等.牡丹实时定量pcr分析中内参基因的选择.2012)，然而这些研究仅关注了几个看家基因，其候选内参基因数目设定较少，并且局限于花芽以及切花花瓣等的实验处理，对于许多牡丹研究方向尤其是油用牡丹研究的参考价值非常有限。同时，除了常见传统看家基因以外，对于牡丹新内参基因的挖掘很长时间以来仍属空白。并且，同一种内参基因常因物种、发育条件、环境胁迫等因素的差异，其表达稳定性存在显著差异，并不存在绝对稳定的万能内参基因。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提供不同mirna作为牡丹‘凤丹’和‘连鹤’发芽、开花研究中内参基因的应用及其筛选方法。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了mtr-mir160b-p3 mirna和/或gma-mir394a-5p mirna作为‘凤丹’牡丹芽发育过程中稳定表达的内参基因的应用，所述mtr-mir160b-p3的序列为seq id no.7，所述gma-mir394a-5p的序列为seq id no.3。

4、本发明还提供了pc-5p-19095mirna、gma-mir394a-5pmirna和/或mtr-mir160b-p3mirna作为‘连鹤’牡丹芽发育过程中稳定表达的内参基因的应用，所述pc-5p-19095的序列为seq id no.17，所述gma-mir394a-5p的序列为seq id no.3，所述mtr-mir160b-p3的序列为seq id no.7。

5、本发明还提供了mtr-mir159a mirna作为‘凤丹’牡丹或‘连鹤’牡丹花发育阶段花瓣中稳定表达的内参基因的应用，所述mtr-mir159a的序列为seq id no.11。

6、本发明还提供了‘凤丹’牡丹盛开期不同组织器官中稳定表达的mirna，包括pc-3p-871mirna和pc-5p-4mirna，所述pc-3p-871mirna的序列为seq id no.8，所述pc-5p-4mirna的序列为seq id no.4。

7、本发明还提供了pc-3p-871mirna和/或pc-5p-4mirna作为‘凤丹’牡丹盛开期不同组织器官中稳定表达的内参基因的应用。

8、本发明还提供了pc-5p-4mirna和/或mtr-mir168b mirna作为在‘连鹤’牡丹盛开期不同组织器官中稳定表达的内参基因的应用，所述pc-5p-4内参基因的序列为seq idno.4，所述mtr-mir168b内参基因的序列为seq id no.9。

9、本发明还提供了筛选牡丹mirna内参基因的方法，包括以下步骤：

10、(1)称取牡丹的组织样品，研磨，提取总mirna；

11、(2)利用步骤(1)中提取的mirna反转录合成第一链cdna；

12、(3)选择u6和mirnas作为mirna表达标准化的候选参考基因；

13、(4)设计mirnas内参基因的正向引物；

14、(5)以步骤(2)获得的第一链cdna为模板，分别以步骤(3)中的候选参考基因的引物进行qrt-pcr扩增获得扩增曲线；

15、所述qrt-pcr扩增的体系，以20μl计，包括2ng/μl的一链模板2μl、10μm正向引物0.4μl，10μtm反向引物0.4μl，2×sybr green 10μl，所述qrt-pcr扩增的程序包括：95℃变性30s，95℃5s，60℃30s，40个循环；

16、(6)根据扩增曲线，使用δct、genorm、normfinder和bestkeeper分析候选参考mirna的稳定性，筛选稳定性最好的mirna作为内参基因。

17、优选的，所述mirnas内参基因为mtr-mir160b-p3、gma-mir394a-5p、pc-3p-70893、mtr-mir171e-3p、pc-5p-19095、pc-3p-871、mtr-mir166a、mtr-mir168b、pc-5p-74547、pc-3p-1770、pc-3p-25825、u6、pc-5p-4、pc-5p-55716、mtr-mir159a_1ss9gt、mtr-mir159a、rco-mir167a、mtr-mir159a_l-1。

18、优选的，所述牡丹品种包括‘凤丹’和‘连鹤’；所述组织样品包括芽的不同发育阶段、花的不同发育阶段和盛开期不同的组织器官。

19、优选的，所述芽的不同发育阶段为越冬鳞芽、萌动期、显蕾期、翘蕾期、立蕾期、小风铃期、大风铃期、圆桃期和平桃期；所述花的不同发育阶段为：露色期、破绽期、初开期、半开期、盛开期、始衰期和衰败期；所述盛开期不同的组织器官为：茎、叶、苞片、萼片、雄蕊、雌蕊、柱头。

20、通过采用上述技术方案，本发明具有如下有益效果：

21、本发明提供了8个未知的mirna，结合9个已知的mirna及u6 snrna共18个候选内参基因，系统研究它们的表达稳定性。根据本申请提供的筛选牡丹mirna内参基因的方法，分别筛选出了‘凤丹’牡丹芽发育过程中稳定表达的内参基因、‘连鹤’牡丹芽发育过程中稳定表达的内参基因、‘凤丹’牡丹或‘连鹤’牡丹花发育阶段的花瓣中稳定表达的内参基因、‘凤丹’牡丹盛开期不同组织器官中稳定表达的内参基因、‘连鹤’牡丹盛开期不同组织器官中稳定表达的内参基因。为不同品种的牡丹在不同芽发育阶段、不同花发育阶段和不同组织器官中获得mirna表达的精确定量数据提供有力支持，为牡丹mirna功能研究提供理论基础。

技术特征：

1.mtr-mir160b-p3 mirna和/或gma-mir394a-5p mirna作为‘凤丹’牡丹芽发育过程中稳定表达的内参基因的应用，所述mtr-mir160b-p3的序列为seq id no.7，所述grna-mir394a-5p的序列为seq id no.3。

2.pc-5p-19095 mirna、gma-mir394a-5p mirna和/或mtr-mir160b-p3 mirna作为‘连鹤’牡丹芽发育过程中稳定表达的内参基因的应用，所述pc-5p-19095的序列为seq idno.17，所述gma-mir394a-5p的序列为seq id no.3，所述mtr-mir160b-p3的序列为seq idno.7。

3.mtr-mir159a mirna作为‘凤丹’牡丹或‘连鹤’牡丹花发育过程的花瓣中稳定表达的内参基因的应用，所述mtr-mir159a的序列为seq id no.11。

4.‘凤丹’牡丹盛开期不同组织器官中稳定表达的mirna，其特征在于，包括pc-3p-871mirna和pc-5p-4 mirna，所述pc-3p-871 mirna的序列为seq id no.8，所述pc-5p-4 mirna的序列为seq id no.4。

5.pc-3p-871 mirna和/或pc-5p-4 mirna作为‘凤丹’牡丹盛开期不同组织器官中稳定表达的内参基因的应用。

6.pc-5p-4mirna和/或mtr-mir168bmirna作为在‘连鹤’牡丹盛开期不同组织器官中稳定表达的内参基因的应用，所述pc-5p-4内参基因的序列为seq id no.4，所述mtr-mir168b内参基因的序列为seq id no.9。

7.一种筛选牡丹mirna内参基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述mirnas包括mtr-mir160b-p3、gma-mir394a-5p、pc-3p-70893、mtr-mir1 71 e-3p、pc-5p-19095、pc-3p-871、mtr-mir1 66a、mtr-mir1 68b、pc-5p-74547、pc-3p-1770、pc-3p-25825、pc-5p-4、pc-5p-55716、mtr-mir159a_1ss9gt、mtr-mir159a、rco-mir167a、mtr-mir159a l-1。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述牡丹品种包括‘凤丹’和‘连鹤’；所述组织样品包括芽的不同发育阶段、花的不同发育阶段和盛开期不同的组织器官。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述芽的不同发育阶段为越冬鳞芽、萌动期、显蕾期、翘蕾期、立蕾期、小风铃期、大风铃期、圆桃期和平桃期；所述花的不同发育阶段为：露色期、破绽期、初开期、半开期、盛开期、始衰期和衰败期；所述盛开期不同的组织器官为：茎、叶、苞片、萼片、雄蕊、雌蕊、柱头。

技术总结
本发明提供了不同miRNA作为牡丹发芽、开花研究中内参基因的应用及其筛选方法，属于分子生物学技术领域。本发明通过qRT‑PCR的方法，根据扩增曲线和Ct值分析17个miRNA和U6的表达变化，对所获得的数据进行统计学上的评估，筛选出相对稳定的miRNA作为牡丹发芽、开花研究的内参miRNA，用于研究牡丹miRNA表达量的变化，为进一步探索牡丹miRNA的作用机制奠定基础。

技术研发人员：侯小改,郭丽丽,张晨洁,宋程威,郭琪,李昱莹,沈佳佳,雷炀,高靖姗
受保护的技术使用者：河南科技大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13