首页 > 分享 > 一种大花蕙兰的组织培养方法与流程

一种大花蕙兰的组织培养方法与流程

花匠小妙招
2025-07-30 19:36

本发明涉及一种大花蕙兰的组织培养方法，属于植物的人工繁殖和栽培技术领域。

背景技术：

大花蕙兰(cymbidiumhybridium)为兰科兰属多年生草本植物，原产于中国西南部，是兰科中的一些附生性较强的大花品种和主要以这些原种为亲本获得的人工杂交种。其花期较长(2-3月)且在冬春节日期间开放，花色艳美，因此具有极高的观赏价值，现已成为五大盆栽兰花(大花蕙兰、蝴蝶兰、石斛兰、卡特兰和中国兰)之一，也是重要的切花兰花品种。大花蕙兰多为杂交品种，种子繁殖无法保持其品种特性、结实率低，所以传统栽培靠分株繁殖，但此类方法周期长、繁殖系数低、繁殖速度慢，远远不能满足商品化的生产要求，因此目前国内外对大花蕙兰的繁殖和栽培多集中在对其进行组织培养方面。

然而，现有技术对于大花蕙兰的组织培养技术还存在以下不足：①以茎尖、茎段或者根部作为外植体，获取过程相对较为复杂且技术难度高，并且会对母株造成或大或小的损失；②原球茎途径使诱导的起始材料经历从脱分化到再分化的过程，变异率较高，并且在生根壮苗之前需要对原球茎和丛生芽进行分离，操作繁琐；③不经过原球茎途径采用丛生芽途径直接成苗的方法，诱导率和增殖率均较低，后续生根壮苗的效果也不佳，并且诱导、增殖和生根所采用的的培养基成分一般复杂多样、制备工艺要求高、所需成本也相应较高。

此外，在兰花的组织培养中，外植体的褐变是导致培养失败的主要原因。褐变是外植体在诱导脱分化或再分化的过程中，自身的创口面发生的变褐现象，同时向培养基中释放褐色物质，使培养基颜色变褐，并导致外植体变褐死亡。这是由于兰花组织中酚类物质含量高、多酚氧化酶活性强，当植物组织中的酚类物质被多酚氧化酶氧化形成褐色醌类物质，而醌类物质在培养中扩散后便抑制其他酶的活性，进而影响外植体的脱分化、再分化以及组培苗的生长。因此，在组织培养过程中存在的褐变现象也一直是本领域难以攻克的技术难题。

综上可知，如何在大花蕙兰的培养过程中更有效的抑制褐变现象的发生，进一步提高诱导率、增殖率和生根率，从而简化生产工艺、提高生产效率已经成为本领域有待研究与开发的技术问题。

技术实现要素：

本发明的目的就是针对上述现有技术中的不足，提供一种大花蕙兰的组织培养方法。

具体的技术方案如下：

(1)外植体的制备与预处理：

选取开过花、生长良好的大花蕙兰花梗，将其从基部切下分割成小段；将花梗段先在30-38℃下处理1-10min，然后在42-50℃下处理1-10min，自然冷却后置于柠檬酸单甘油酯与虾青素的混合溶液中浸泡；再将花梗段在流水下充分冲洗、消毒，得到外植体，备用。

(2)丛生芽的诱导与增殖：

将外植体接种到专用培养基中诱导丛生芽，所述专用培养基的配方为：ms培养基，1mg/l复硝酚钠，大花蕙兰叶片提取液100ml/l，琼脂8g/l；培养30-60天后将得到的丛生芽再次转接到上述专用培养基中进行增殖培养。

(3)生根壮苗：

将上述增殖培养的2-3cm高的丛生芽接种到以下液体培养基中：ms培养基，大花蕙兰叶片提取液50ml/l，芸苔素0.5mg/l，获得幼苗。

(4)炼苗移栽，获得种苗。

优选地，上述步骤(1)中将花梗分割成2-5cm的小段；

优选地，上述步骤(1)中柠檬酸单甘油酯的浓度为5-15g/l，虾青素的浓度为2-10g/l，浸泡时间为10-60min；

优选地，上述步骤(1)中的消毒步骤具体是将花梗段在流水下充分冲洗，放入0.1％的氯化汞溶液中浸泡30min，再用无菌水冲洗5遍，最后用无菌滤纸吸干水分；

优选地，上述步骤(2)中的培养条件如下：培养温度为25-30℃，光照强度为1000-2000lux，每天光照12h；

优选地，上述步骤(2)中大花蕙兰叶片提取液的制备方法是：取大花蕙兰生长良好、健康无病虫害的叶片，切块、粉碎、过筛后干燥，加入叶片粉末重量3-10倍的水，加热至微沸并在微沸的条件下提取30-90min，得到大花蕙兰叶片的提取液；

优选地，上述步骤(3)中的培养条件如下：培养温度为20-28℃，光照强度为1500-2500lux，每天光照10h；

优选地，上述步骤(4)中炼苗移栽的具体步骤为：当幼苗长至5cm以上时放在自然光下炼苗10天左右，然后进行移栽；移栽时先洗净根部的培养基，再用0.05％的高锰酸钾溶液浸泡10min，晾干后移入到栽培基质中，保持适当通风和适宜的温湿度，即得种苗。

本发明包括以下有益效果：

(1)选取开过花的花梗为外植体，能够减少因取茎尖、茎段、根等作为外植体对母株的伤害，并且花梗的获得更容易，而选择开过花的花梗则进一步降低了对母株的损伤。

(2)采用分阶段升温处理，以及在柠檬酸单甘油酯与虾青素的混合溶液中浸泡对外植体进行处理，能够有效的抑制褐变现象的发生，褐变率能够减少到5％及以下，大大降低了褐变率。

(3)发明制备的专用培养基能够同时用于丛生芽的诱导和增殖，不需分别制备不同的培养基；而用于诱导和增殖的专用培养基，以及用于生根壮苗的液体培养基，通过提取大花蕙兰的叶片活性成分，将其提取液加入到常用的ms中，并且添加特定浓度的植物生长调节剂，在上述两种培养基中进行组织培养，能够大大提高诱导率、增殖率和生根率(其中诱导率和生根率均可高达100％，增殖系数也高达10.69)，并且这两种培养基成分相似、制备简单，简化生产程序，提高培养效率；此外，活性提取液来源于大花蕙兰的叶片，取材简单、更好地实现了资源的充分利用。

(4)外植体为花梗、采用添加了大花蕙兰叶片提取液以及特殊生长调节剂的培养基，直接由外植体诱导获得丛生芽，解决了原球茎途径使诱导的起始材料经历从脱分化到再分化的过程、变异率高的问题，同时避免了分离原球茎和丛生芽的步骤，不经过愈伤组织与原球茎阶段，直接诱导丛生芽一次性成苗，大大提高繁殖速度，并且能够保持母体的优良性状，不会产生变异苗。

综上，本发明所提供的组织培养方法选取花梗作为外植体，经过分阶段升温和混合溶液的浸泡处理，在专用培养基中进行丛生芽的诱导和增殖，在液体培养基中进行生根壮苗，两种培养基中分别添加了大花蕙兰的叶片提取液和特定的植物生长调节剂，变异率和褐变率低，诱导率、增殖率和生根率高。整体步骤简便可行、降低了生产难度和生产成本，具有极大的市场前景和推广价值。

具体实施方式

下面通过几个实施例详细说明本发明的具体实施方式从而对本发明进行进一步的阐述，但不对本发明的权利要求做任何限定。如无具体说明，本发明的各种原料均可市售购得，或根据本领域的常规方法制备得到。

实施例1

(1)外植体的制备与预处理：

选取开过花、生长良好的大花蕙兰花梗，将其从基部切下，分割成3cm的小段；将花梗段先在35℃下处理5min，然后在45℃下处理5min，自然冷却后置于柠檬酸单甘油酯(10g/l)与虾青素(5g/l)的混合溶液中浸泡30min，取出后用滤纸吸干水分；将花梗段在流水下充分冲洗，放入0.1％的氯化汞溶液中浸泡30min，再用无菌水冲洗5遍，最后用无菌滤纸吸干水分，得到外植体，备用。

(2)丛生芽的诱导与增殖：

将外植体接种到专用培养基中诱导丛生芽，所述培养基的配方为：ms培养基，复硝酚钠1mg/l，大花蕙兰叶片提取液100ml/l，琼脂8g/l；培养温度为28℃，光照强度为1200lux，每天光照12h，45天后将得到的丛生芽再次转接到上述专用培养基中进行增殖培养。其中，大花蕙兰叶片提取液的制备方法是：取大花蕙兰生长良好、健康无病虫害的叶片，切块、粉碎、过筛后干燥，加入叶片粉末重量5倍的水，加热至微沸并在微沸的条件下提取60min，得到大花蕙兰叶片的提取液。

(3)生根壮苗：

将上述增殖培养的2-3cm高的丛生芽接种到以下液体培养基中：ms培养基，大花蕙兰叶片提取液50ml/l，芸苔素0.5mg/l；培养温度为25℃，光照强度为2000lux，每天光照10h，获得幼苗。

(4)炼苗移栽：

当上述幼苗长至5cm以上时放在自然光下炼苗10天左右，然后进行移栽；移栽时先洗净根部的培养基，再用0.05％的高锰酸钾溶液浸泡10min，晾干后移入到栽培基质中，保持适当通风和适宜的温湿度，即得种苗。

实施例2

(1)外植体的制备与预处理：

选取开过花、生长良好的大花蕙兰花梗，将其从基部切下，分割成2cm的小段；将花梗段先在30℃下处理10min，然后在42℃下处理10min，自然冷却后置于柠檬酸单甘油酯(5g/l)与虾青素(10g/l)的混合溶液中浸泡60min，取出后用滤纸吸干水分；将花梗段在流水下充分冲洗，放入0.1％的氯化汞溶液中浸泡30min，再用无菌水冲洗5遍，最后用无菌滤纸吸干水分，得到外植体，备用。

(2)丛生芽的诱导与增殖：

将外植体接种到专用培养基中诱导丛生芽，所述培养基的配方为：ms培养基，复硝酚钠1mg/l，大花蕙兰叶片提取液100ml/l，琼脂8g/l；培养温度为25℃，光照强度为1000lux，每天光照12h，60天后将得到的丛生芽再次转接到上述专用培养基中进行增殖培养。其中，大花蕙兰叶片提取液的制备方法是：取大花蕙兰生长良好、健康无病虫害的叶片，切块、粉碎、过筛后干燥，加入叶片粉末重量3倍的水，加热至微沸并在微沸的条件下提取90min，得到大花蕙兰叶片的提取液。

(3)生根壮苗：

将上述增殖培养的2-3cm高的丛生芽接种到以下液体培养基中：ms培养基，大花蕙兰叶片提取液50ml/l，芸苔素0.5mg/l；培养温度为20℃，光照强度为1500lux，每天光照10h，获得幼苗。

(4)炼苗移栽：

实施例3

(1)外植体的制备与预处理：

选取开过花、生长良好的大花蕙兰花梗，将其从基部切下，分割成5cm的小段；将花梗段先在38℃下处理2min，然后在50℃下处理1min，自然冷却后置于柠檬酸单甘油酯(15g/l)与虾青素(2g/l)的混合溶液中浸泡10min，取出后用滤纸吸干水分；将花梗段在流水下充分冲洗，放入0.1％的氯化汞溶液中浸泡30min，再用无菌水冲洗5遍，最后用无菌滤纸吸干水分，得到外植体，备用。

(2)丛生芽的诱导与增殖：

将外植体接种到专用培养基中诱导丛生芽，所述培养基的配方为：ms培养基，复硝酚钠1mg/l，大花蕙兰叶片提取液100ml/l，琼脂8g/l；培养温度为30℃，光照强度为2000lux，每天光照12h，30天后将得到的丛生芽再次转接到上述专用培养基中进行增殖培养。其中，大花蕙兰叶片提取液的制备方法是：取大花蕙兰生长良好、健康无病虫害的叶片，切块、粉碎、过筛后干燥，加入叶片粉末重量10倍的水，加热至微沸并在微沸的条件下提取30min，得到大花蕙兰叶片的提取液。

(3)生根壮苗：

将上述增殖培养的2-3cm高的丛生芽接种到以下液体培养基中：ms培养基，大花蕙兰叶片提取液50ml/l，芸苔素0.5mg/l；培养温度为28℃，光照强度为2500lux，每天光照10h，获得幼苗。

(4)炼苗移栽：

对照例与数据分析

每组取100个外植体样本，采用实施例1的方法进行组织培养，实验过程中统计各组的褐变情况、诱导情况、增殖情况和生根情况，具体计算公式如下：

褐变率(％)＝褐变数/接种数

诱导率(％)＝诱导数/接种数

生根率(％)＝生根苗数/接种苗数

平均根数＝生根条数/生根苗数

平均根长＝总根长/生根条数

(一)设置对照例1-5，分别采用实施例1的方法进行组织培养，与实施例1不同之处在于对外植体的预处理有所差异，具体如下所述：

对照例1：外植体不经过升温和浸泡，直接消毒

对照例2：外植体先在35℃下处理5min，然后在45℃下处理5min

对照例3：外植体直接置于柠檬酸单甘油酯(10g/l)与虾青素(5g/l)的混合溶液中浸泡30min

对照例4：外植体先在45℃下处理10min，然后置于柠檬酸单甘油酯(10g/l)与虾青素(5g/l)的混合溶液中浸泡30min

对照例5：外植体先在35℃下处理5min，然后在45℃下处理5min，然后置于柠檬酸单甘油酯(15g/l)溶液中浸泡30min

统计褐变情况，所得结果填入下表1中。

表1不同预处理对外植体褐变的影响

由上表1可知，只有按照本发明的方法先分步升温处理、再在混合溶液中浸泡处理，方能有效抑制外植体的褐变。实施例1在接种45天后只有5％的外植体发生了轻微褐变，而在对照例中，接种45天后不经过任何处理的褐变率高达86％，其余处理方式下的外植体褐变率均高于20％。因此，本发明对于外植体的预处理能够大大降低褐变率。

(二)设置对照例6-8，分别采用实施例1的方法进行组织培养，与实施例1不同之处在于诱导与增殖所用的培养基成分有所差异，具体如下所述：

对照例6：ms培养基，复硝酚钠1mg/l，琼脂8g/l

对照例7：ms培养基，大花蕙兰叶片提取液100ml/l，琼脂8g/l

对照例8：ms培养基，6-苄氨基嘌呤1mg/l，大花蕙兰叶片提取液100ml/l，琼脂8g/l

统计诱导出芽及增殖情况，所得结果填入下表2中。

表2不同培养基对丛生芽诱导与增殖的影响

由上表2可以看出，实施例1采用专用培养基进行诱导和增殖，所得丛生芽的诱导率高达100％，增殖系数高达10.69，而对照例中不添加大花蕙兰叶片提取液或者复硝酚钠，或者用其他植物生长调节剂替代同浓度的复硝酚钠，与本发明的效果相差均较大。因此，只有利用本发明的方法才能有效提高诱导率和增殖率。

(三)设置对照例9-12，分别采用实施例1的方法进行组织培养，与实施例1不同之处在于生根壮苗所用的培养基成分有所差异，具体如下所述：

对照例9：ms培养基，芸苔素0.5mg/l

对照例10：ms培养基，大花蕙兰叶片提取液50ml/l

对照例11：ms培养基，大花蕙兰叶片提取液50ml/l，萘乙酸0.5mg/l

对照例12：ms培养基，大花蕙兰叶片提取液50ml/l，萘乙酸1.5mg/l

统计生根情况，所得结果填入下表3中。

表3不同培养基对生根的影响

由上表3可知，本发明实施例1中的方法培养获得的大花蕙兰幼苗生根率为100％，平均根数和平均根长均高于对照例。生根壮苗培养基中不添加大花蕙兰叶片提取液，明显降低生根质量，即生根率、根数和根长均较小；而添加大花蕙兰叶片提取液后，不搭配使用特定浓度的芸苔素，或者用本技术领域常用的萘乙酸替代，生根率、根数和根长依然不理想，即使将萘乙酸的浓度由0.5mg/l增加到1.5mg/l，也仅能稍稍有所提升。

本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。