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一种淋巴组织流式检测样本保存液及其制备方法和应用与流程

花匠小妙招
2025-09-26 10:30

本发明涉及生物样本保存，尤其涉及一种淋巴组织流式检测样本保存液及其制备方法和应用。

背景技术：

1、在免疫学研究和临床诊断中，淋巴组织样本的质量直接影响后续流式细胞术、单细胞转录组测序等高精度检测的准确性与可靠性。传统的淋巴组织样本保存液多依赖聚蔗糖密度梯度离心法进行细胞分离，该方法虽能有效减少细胞聚集，但在实际应用中仍存在显著缺陷。例如，其无法降解游离dna，导致所得单细胞悬液中常出现由核酸形成的网状结构，影响细胞得率（通常低于75%），限制了后续分析的灵敏度。

2、此外，现有保存液中广泛使用的螯合剂edta在维持细胞活性方面存在一定隐患。过量的edta会过度螯合溶液中的二价钙、镁离子，导致细胞膜通透性异常升高，特别是在进行钙离子依赖性检测（如annexin v凋亡检测）时，易引发假阴性结果。同时，为防止微生物污染，传统配方常添加庆大霉素等抗生素，但其抗菌谱有限，仅对革兰氏阴性菌有一定抑制作用，而对真菌污染几乎无效，进一步增加了样本保存过程中的风险。因此，本申请旨在提供一种新型的淋巴组织流式检测样本保存液及其制备方法和应用，以在完全摒弃edta和叠氮钠的前提下，提升样本保存质量与后续检测的准确性。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提出了一种提升样本保存质量与后续检测准确性的淋巴组织流式检测样本保存液及其制备方法和应用。

2、本发明的技术方案是这样实现的：第一方面，本发明提供了一种淋巴组织流式检测样本保存液，所述保存液包括dna酶i、海藻糖、鞣花酸和rpmi 1640培养基。

3、dna酶i特异性切割dna磷酸二酯键，消除核酸网状结构，防止游离dna形成的网状结构阻碍单细胞悬液的制备，提高单细胞得率和细胞活性。dna酶i与鞣花酸共同作用减少氧化应激对细胞膜的影响，确保在细胞分离过程中维持较高的细胞活性。同时，dna酶i与海藻糖结合使用，可以进一步保护细胞免受物理损伤。

4、海藻糖通过玻璃化转变温度调控，抑制冰晶形成，维持细胞膜液晶态结构完整性，从而提高细胞存活率并减少细胞破裂的风险。海藻糖与dna酶i配合使用，既能保证细胞外无碍于单细胞悬液形成的物质存在，又能从物理层面保护细胞膜不被破坏。此外，其高渗透压特性有助于维持细胞内外环境的平衡，增强整体保存效果。

5、鞣花酸通过fe2+螯合及nrf2通路激活，降低线粒体ros生成速率，有效抑制脂质过氧化水平，保护细胞免受氧化损伤。鞣花酸对细菌和真菌表现出一定的抑制作用，可以抑制某些病原体酶的活性，从而阻碍其生长繁殖。鞣花酸与dna酶i一起作用，不仅解决了细胞外部的问题（如dna粘连），还关注到了细胞内部的抗氧化需求，两者共同促进细胞健康状态的保持。鞣花酸的存在也减少了由于氧化应激导致的细胞功能丧失。

6、rpmi 1640培养基提供葡萄糖及谷氨酰胺等基础代谢支持，确保细胞在保存期间能够获得必要的营养成分以维持基本生命活动。rpmi 1640培养基作为整个配方的基础，为其他活性成分发挥作用提供了适宜的生理环境。它与上述三种成分相结合，形成了一个全面支持细胞健康的体系。

7、在以上技术方案的基础上，优选的，以1l保存液为例，所述dna酶i的浓度为10~20u/ml，鞣花酸的浓度为0.1~0.5 mm，海藻糖的浓度为2%~5%w/v，其余为rpmi 1640培养基。

8、在以上技术方案的基础上，优选的，还包括蜂胶提取物。

9、蜂胶提取物含有广谱抑菌成分（黄酮类和酚酸），具有显著的抗菌和抗氧化性能，可有效控制微生物污染，特别是对真菌如白色念珠菌有良好的抑制作用。虽然蜂胶提取物与dna酶i直接作用不同，但两者均致力于提升样本质量，前者解决的是生物化学层面的问题，后者则针对潜在的微生物威胁。蜂胶提取物与海藻糖除了各自的主要功能外，在保护细胞完整性和抵抗外界压力方面形成互补。蜂胶提取物与鞣花酸都具备抗氧化能力，蜂胶中的黄酮类化合物能增强抗氧化网络，进一步减轻氧化应激对细胞造成的损害。rpmi 1640培养基在提供必要营养的同时，加入蜂胶提取物增强了整体保存液对抗不利因素的能力，创造了一个更加稳定、有利于细胞生存的微环境。

10、在以上技术方案的基础上，优选的，所述保存液中蜂胶提取物的浓度为0.1%~0.5%w/v。

11、在以上技术方案的基础上，优选的，所述蜂胶提取物采用超临界co2萃取法制备。

12、在以上技术方案的基础上，优选的，萃取压力为25~35 mpa，温度为40~50℃，co2流量为15~25 l/h，萃取时间为2~4h。

13、第二方面，本发明提供了一种淋巴组织流式检测样本保存液的制备方法，包括以下步骤：将dna酶i溶解于4℃预冷的rpmi 1640培养基中，避免海藻糖包裹导致的酶活性损失。加入海藻糖，低速搅拌（200 rpm）避免泡沫；然后依次加入鞣花酸和蜂胶提取物，搅拌均匀后过滤得到保存液。

14、在以上技术方案的基础上，优选的，所述保存液的ph值为7.2~7.4。

15、第三方面，本发明提供了保存液在淋巴结单细胞悬液制备中的应用。

16、本发明的一种淋巴组织流式检测样本保存液及其制备方法和应用相对于现有技术具有以下有益效果：

17、（1）dna酶i解决细胞外部由游离dna造成的物理阻碍问题，海藻糖则从物理层面保护细胞膜完整性，两者共同作用以保证高细胞得率和活性。鞣花酸主要针对细胞内部的氧化应激进行防护，而dna酶i和海藻糖分别解决了外部dna粘连和细胞膜稳定性的问题。三者协同作用，既保障了细胞外环境的优化，也维护了细胞内稳态。rpmi 1640培养基作为基础营养供应源，为其他活性成分提供了适宜的作用环境，使得这些成分能在最佳条件下发挥其各自的功能，从而全面提升样本保存效果。这四种成分通过各自的独特机制以及彼此间的协同作用，共同解决了传统保存液中存在的三大技术难题：dna粘连、细胞膜损伤以及微生物污染，显著提升了淋巴组织样本保存的质量和后续分析的准确性。

18、（2）dna酶i防止dna网状结构形成，蜂胶则通过抗菌作用防止微生物增殖带来的次生dna释放，共同保障单细胞悬液质量。蜂胶提取物提供抗氧化支持，与海藻糖协同从物理保护和化学防御两个层面增强细胞抗损伤能力。蜂胶提取物与鞣花酸两者均为抗氧化成分，蜂胶中的黄酮类化合物可增强nrf2通路激活效果，进一步降低ros和mda水平，提升细胞活性。在rpmi 1640培养基营养支持的基础上，蜂胶提取物增强了抗菌和抗氧化功能，使保存液在长时间保存中仍能维持细胞生理状态。

技术特征：

1.一种淋巴组织流式检测样本保存液，其特征在于：所述保存液包括dna酶i、海藻糖、鞣花酸和rpmi 1640培养基。

2.如权利要求1所述的一种淋巴组织流式检测样本保存液，其特征在于：以1l保存液为例，所述dna酶i的浓度为10~20 u/ml，鞣花酸的浓度为0.1~0.5 mm，海藻糖的浓度为2%~5%w/v，其余为rpmi 1640培养基。

3.如权利要求2所述的一种淋巴组织流式检测样本保存液，其特征在于：还包括蜂胶提取物。

4.如权利要求3所述的一种淋巴组织流式检测样本保存液，其特征在于：所述保存液中蜂胶提取物的浓度为0.1%~0.5%w/v。

5.如权利要求3所述的一种淋巴组织流式检测样本保存液，其特征在于：所述蜂胶提取物采用超临界co2萃取法制备。

6.如权利要求5所述的一种淋巴组织流式检测样本保存液，其特征在于：萃取压力为25~35 mpa，温度为40~50℃，co2流量为15~25 l/h，萃取时间为2~4h。

7.如权利要求3~6任一项所述的一种淋巴组织流式检测样本保存液的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：将dna酶i溶解于rpmi 1640培养基中，然后依次加入海藻糖、鞣花酸和蜂胶提取物，搅拌均匀后过滤得到保存液。

8.如权利要求7所述的一种淋巴组织流式检测样本保存液的制备方法，其特征在于：所述保存液的ph值为7.2~7.4。

9.如权利要求1~6任一项所述的保存液在淋巴结单细胞悬液制备中的应用。

技术总结
本发明提出了一种淋巴组织流式检测样本保存液及其制备方法和应用，所述保存液包括DNA酶I、海藻糖、鞣花酸和RPMI 1640培养基。本发明在RPMI 1640培养基的基础上增加了DNA酶I、海藻糖和鞣花酸，解决了传统保存液中存在的DNA粘连、细胞膜损伤以及微生物污染问题，显著提升了淋巴组织样本保存的质量和后续分析的准确性。

技术研发人员：胡勤芹,夏红星,冯亮,舒翔
受保护的技术使用者：武汉优恩生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2025/9/22