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植物组织培养

花匠小妙招
2024-08-15 16:05

花药和花粉的培养

华中农业大学园艺林学学院Ｄｒ.康春颖

2016.3.22

概念花粉或花药培养是指用植物组织培养技术，把发育到一定阶段的花粉或花药，通过无菌操作技术，接种在人工培养基上，改变花粉的发育进程，诱导其细胞分裂、分化，最终由单个花粉粒发育成完整植株。花药培养属于器官培养，花粉培养属于细胞培养花药暗培养三个月后，愈伤组织从花药分化出来Microsporecultureofcabbage花药和花粉发育过程花药和花粉培养的发展史花药和花粉培养的意义花药培养花粉培养单倍体植株加倍花药和花粉发育过程花药和花粉培养的发展史花药和花粉培养的意义花药培养花粉培养单倍体植株加倍花的结构模型花药横切照片药室绒毡层

花药的发育过程Sanders,PaulMet.alSexPlantReprod1999,11(6):297-322.

花粉的发育过程PatriciaBedinger，ThePlantCell,Vol.4,879-887,1992B:单核C:双核D:三核E:成熟拟南芥花粉（DAPI染色）1个营养核2个生殖核成熟花粉的形态(a)玉米(b)石蒜(c)鹿舌草(d)紫荆(e)烟草(f)凤仙花花药和花粉发育过程花药和花粉培养的发展史花药和花粉培养的意义花药培养花粉培养单倍体植株加倍1921年，Bergner等发现曼陀罗能够产生自然单倍体（Science）1964年，Guha和Maheshwari通过曼陀罗花药培养得到胚状体。（Nature）1969年，Nitsch用烟草花药培养出单倍体植株（Science）1972年，Sharp等用看护培养从番茄花粉诱导单倍体植株（Planta）八十年代统计：23科、52属、153种，花药培养成功花药和花粉培养简史曼陀罗InvitroProductionofEmbryosfromAnthersofDatura,1964年，NATURE烟草花药再生出单倍体植株（不结实）HaploidPlantsfromPollenGrains,1969年，SCIENCE我国花药和花粉培养的简史1970年，中科院遗传所得到了水稻花药培养产生的单倍体植株；1971年，中科院遗传所得到了小麦花药培养产生的单倍体植株；1974年，中科院北京植物所等单位世界上第一个用单倍体方法培育出烟草新品种、推广。作物：有30多种开展了培养试验，有20多种获得了花粉植株，小麦、黑麦、玉米。园艺植物：大白菜、青菜、甘蓝、茄子、番茄、葡萄、苹果、柑桔等等得到了单倍体植株。花药和花粉发育过程花药和花粉培养的发展史花药和花粉培养的意义花药培养花粉培养单倍体植株加倍（一）基础理论上研究的利用1．人工花粉培养是研究减数分裂和花药生长机制的重要方法；2．花药和花粉培养可进行生理、生化、遗传等基础理论的研究；优点：花粉数量多、体积小、形态比较一致、便于人工控制。3．高等植物的自然突变率低，在10－6～10－9之间，培养皿中诱变处理，提高突变率。（二）单倍体育种1．可以获得纯合的双单倍体；2．与杂交育种比较可缩短世代，提高选择率；3．有利于远缘杂种新类型的培养和稳定；4．与诱变育种相结合，可以加速育种过程。

300多个双单倍体品种中，大麦和水稻各有100个品种，油菜有50个品种花药和花粉发育过程花药和花粉培养的发展史花药和花粉培养的意义花药培养花粉培养单倍体植株加倍（一）操作流程选幼年树花蕾取下花蕾3-5度低温冷处理3-10天取花药镜检消毒接种培养再生1．消毒健状花蕾自来水洗75%酒精10秒无菌水洗1次10%NaClO溶液无菌水洗3次2．接种花蕾滤纸吸水镊子剥开取花药去掉花丝接种培养基（20－30个花药/10ml试管）3．培养恒温23－28℃光照11－16小时/天光照强度2000－4000Lux花药暗培养三个月后，愈伤组织从花药分化出来花药暗培养三个月后，胚状体从花药分化出来花药诱导出的愈伤组织

继代扩繁花药诱导出的胚状体继代扩繁胚状体诱导生芽诱导生根1.基因型：植物材料的异质性植物材料的遗传类型，影响花药的培养。茄科花药培养成功率最高。同一种内不同品种，不同来源的材料、花药培养效果不同。影响花药培养效果的因素2.花粉发育时期大多数品种离体花药最佳反应时期是小孢子有丝分裂前后或期间，多数园艺植物以采用单核中后期或双核早期的药粉培养，诱导产生愈伤组织或胚状体的频率较高；细胞学观察推测，双核期花粉中开始逐渐积累淀粉，就不能使花粉发育成植株Thisoccursbecausemicrosporeswouldonlyrespondtoembryoformationatadevelopmentalstagewhentheyarenotcommittedtodevelopintopollengrains

确定取样时期的方法染色方法：醋酸洋红、碘/碘化钾、孚尔根染色、焙花青-铬矾法实际操作中可根据一定大小的花蕾来确定药粉发育期。小孢子单核靠边期（醋酸洋红）柑橘处于小孢子单核靠边期

的花蕾形态

3.生理状态所用材料取自大田要比从温室的好；一般取生长健壮，发育好者；4.预处理为提高愈伤组织的胚状体形成的比例，可对花药进行各种预处理；应用最广泛的是低温处理。0～8度，3～14天；温度越低，处理时间越短除此之外，光周期、高温、甘露醇等处理。30～35度，12～16h（短期）5.培养基常用的基本培养基MS、Nitsch、Miller、B5、N6等培养基中最关键成分细胞分裂素：BA、KT、Zip生长素：2,4-D，NAA、IAA碳源：比通常培养基中的蔗糖浓度高

玉米12～15%，番茄13.6%；渗透压稳定剂培养方式：固体培养，液体培养活性炭：吸附有毒物质花粉分化成植株的途径1.从愈伤组织分化产生植株培养基要降低生长素含量若愈伤组织不易分化，要进行继代培养；较高细胞分裂素浓度和较低的生长素浓度，有利于芽的分化，反之有利于根的分化。愈伤组织出现早，易分化绿苗。从胚状体直接产生植株DirectmicrosporeembryogenesisinCitrusanthersafter3monthsofculture花药和花粉发育过程花药和花粉培养的发展史花药和花粉培养的意义花药培养花粉培养单倍体植株加倍花粉培养过程选幼年树花蕾取下花蕾（镜检）稍早于花药培养时期，四分体或单核早期预培养数天取花药接种分离花粉药壁向花粉提供营养物质；通过药壁吸收、贮存和转化培养基中的外源物质低温预处理消毒过滤离心再生一、花粉培养的优点1．可完全排除花粉培养中花药组织干扰；2．培养中不存在花粉的竞争问题，可以培育得到较多的单倍体材料；

花药培养中靠近外层的花粉易形成胚状体3．从基础理论的研究来讲，单独花粉培养也更有价值。二、花粉的分离机械分离法

平头玻璃棒或注射器内管轻轻挤压，通过不锈钢筛或尼龙网过滤，反复低速离心，用血球计数器计数调整液体培养密度。2.花药漂浮培养自然释放法接种于液体培养基中，培养一定天数后，花药开裂，释放出花粉粒3.磁力搅拌法

三、花粉的预处理1．低温处理：常用，效果最好，时期：花粉第一次有丝分裂，处理花蕾效果好。2．重力作用：在从花蕾中取出前1小时，在5℃低速离心，可提高烟草花粉单倍体的诱导率。四、花粉培养方法1、直接培养：不经预培养或预处理的花药中直接分离培养。2、预培养：花药在液体培养基中先培养2-4d,然后挤出花粉，经离心洗涤后悬浮于液体培养基中培养。3、哺育培养：将花粉接种到裂开的花药中。4、看护培养：利用花药或花药愈伤组织释放出的活性物质促进花粉小孢子发育。5、微室培养：利用小的盖玻片和凹穴载玻片形成微室进行花粉培养，有利于连续的活体观察。6、双层培养：马铃薯花粉培养中，先铺2mm厚的固体培养基，再接种1mm厚的液层。花粉培养：加进花药组织提取物，促进生长。分析：有原胚发育所需的物质存在。看护培养A：新分离的花粉，B：培养3天，C：培养4天，D：培养7天，E：培养9天，F:培养4周辣椒花粉培养形成胚状体PlantCellRep(2008)27:425–434

油菜花粉培养形成的胚柄和胚状体禾谷类花药和花粉培养中的白化苗现象白化苗的控制花粉发育时期：花药培养中，白化苗的比例随接种时花粉发育时期的延迟而提高。培养基成分：高浓度的2,4-D会使花粉愈伤组织分化出更多的白化苗培养温度：当培养温度提高时，白化苗的数目也随之增加。花药和花粉发育过程花药和花粉培养的发展史花药和花粉培养的意义花药培养花粉培养单倍体植株加倍花药和花粉培养得到的一定是单倍体植株吗？秋水仙素处理诱导双单倍体最初从百合科植物秋水仙中提取出来1937年美国学者布莱克斯利（A.F.Blakeslee）等，用秋水仙碱加倍曼陀罗等植物的染色体数获得成功原理：由于影响纺锤体的形成而干扰细胞分裂，但不影响DNA复制DH：doublehaploid柑