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分子标记及其在植物遗传育种中的应用.ppt

花匠小妙招
2024-10-29 21:31

1、分子标记及其在植物遗传育种中的应用,遗传标记（geneticmarker）具有多型性易于鉴别与目标基因紧密连锁,性状标记色泽，形态细胞学标记倒位，易位，G/N/C带生化标记同功酶分子标记RFLP、RAPD、SSR、AFLP、SNP,基础-基因表达结果表现型,DNA碱基序列变异,形态标记,遗传学上稳定、可见的外部特征-遗传与环境、结构基因与调控基因综合作用的结果。如穗形、芒长、穗长、粒色、穗形、矮秆、卷叶等。特点：直观简单从基因型到表现型存在基因表达、调控、个体发育等环节，表型差异有时难以反映基因型差异。,细胞学标记,染色体数目变异及结构变异，表现在染色体核型（数目、大小、随体、着丝点位置等）和

2、带型（C带、N带、G带等）。随着分带、细胞原位杂交等研究技术的发展，可在染色体水平揭示更多遗传变异。特点：直观、快速而经济，但变异十分有限，当染色体数目形态相似时难以分辨。,生化标记贮藏蛋白和同工酶,贮藏蛋白同工酶特点：经济、方便、成本较低结构基因表达产物，对非结构基因无能为力；所检测位点只是基因组一部分；数量有限，有时受发育时期和环境影响。,分子标记,本质是以核苷酸序列作为标记，一般特点：（1）不受季节、环境、基因表达与否的限制；（2）多态性高，存在着丰富的等位变异；（3）数量丰富，多态性遍及整个基因组；（4）表现为“中性”，不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁；（5）许多分子标记表

3、现共显性，能鉴别纯合杂合基因型，提供完整的信息。,分子标记的分类（Staub等1996）,植物遗传研究中常用的分子标记,RFLPRestrictionFragmentLengthPolymorphismRAPDRandomAmplifiedPolymorphicDNAs(DAF,AP-PCR)SSRSimpleSequenceRepeatAFLPAmplifiedFragmentLengthPolymorphism,RFLP,原理：DNA限制性内切酶酶切电泳转移到硝酸纤维素滤膜同位素或非放射标记（如地高辛等）的探针杂交胶片放射自显影，显示酶切片段大小,酶切：3-5ugDNA，以10U内切酶酶切

4、5小时电泳：0.6-0.8%琼脂糖胶70V电泳16小时染色：EtBr染色20分钟变性：0.25MHCl20分钟，抽真空，水冼印迹：加入0.4NNaOH，进行Southern印迹冲洗：以2SSC冼胶，风干,酶切电泳印迹,杂交洗脱,预杂交：将杂交膜放人预杂交液（水、5HSB、Denhardt）中，封好后置65温箱中振荡56小时。杂交：预杂交液中加入标记好的marker和探针，放入杂交膜浸匀。封好杂交盒后，置65温箱中振荡过夜。洗脱：将膜转入洗脱盒，加入洗脱液65振荡洗脱两次（15min/次），吸干包好。,放射自显影,将洗脱好的杂交膜置于增感屏上,于暗室中将X-光片放于杂交膜上，再放上另一张增感屏，

5、装人暗袋，并用夹板夹好。置-70超低温冰箱中曝光10天左右。使用磷屏仪，操作更方便。,RFLP探针,来源：cDNA探针与基因组DNA（gDNA）探针cDNA探针:保守性较强，探针检测的多态性频率较低。gDNA探针:检测的多态性频率较高，但不同种属特异性较强。玉米RFLP探针：/probes.Html,探针标记随机引物法,25ng变性DNA5ul寡聚核苷酸2ulBSA3ul-32PdCTP2ulKlenow酶加水至50ul，37温箱中标记2小时,RFLP标记特点,共显性，可以区别纯合和杂合基因型稳定、重复性强某些植物中开发探针已遍及整个基因组缺点：DN

6、A需要量较大，技术复杂；用于做图较费时，难以分析大量样品；在基因组较大、严格自花授粉作物上多态性很低，使遗传图饱和度低。,RAPD,原理：用一个随机引物（8-10bp）、碱基随机排列的寡核苷酸序列，非定点地扩增基因组DNA，然后电泳分开扩增片段。,PolymeraseChainReaction-PCR,3,5,TCATGA,CGAGCG,DNAisdoubledwitheachcycle,RAPD的操作,PCR反应：DNA（20ng/l）1lPrimer15ng10Buffer2.0lMg2+（25mM）1.2lTaq酶（5U/l）0.15ldNTP（25mM）0.2l加水至20l，再加入石腊

7、油，进行PCR扩增,Step1952分钟Step29515秒Step33630秒Step47245秒Step5GOTOStep246循环Step6725分钟,PCR扩增：,主要特点,无需杂交，设计引物也无须知道序列信息；DNA需要量少，引物便宜，成本较低；技术简便，操作方便、快速，不涉及分子杂交和放射性自显影等技术。不同物种间引物通用；缺点：大多显性遗传，不能鉴别杂合和纯合子；实验重复性较差，结果可靠性较低。,DAF(DNAamplificationfingerprinting)：,与RAPD不同的是:引物浓度更高，引物长度更短（一般58个碱基），且往往用聚丙烯酰胺凝胶电泳，通常会产生非常复杂

8、的带型，谱带信息比RAPDs大得多。（Caetano-Anolles等，1990）,AP-PCR(arbitrarilyprimedpolymerasechainreaction),引物较长（1050bp）；引物浓度较高；引物长度不定，并且常常来自为其它目的而设计的引物（如M13通用测序引物）。,ISSR,共同优点：在不需要知道所扩增DNA序列情况下，产生DNA片段的指纹；需DNA量少，产生多态性丰富。缺点：对反应条件非常敏感，重复性差。,SCARs（SequencedCharacterizedAmplifiedRegions）,为提高RAPD标记稳定性，把目标RAPD片段克隆测序，根据片段两

9、末端的序列设计特定引物（通常24个碱基），再进行PCR扩增，可把相应的单一位点鉴定出来。具有更高的可重复性共显性,微卫星标记(SSR),真核生物基因组普遍存在，呈随机分布,大约每隔10-50kb就存在一个SSR.哺乳动物中约为植物的5-6倍;植物中平均23.3kb有一个SSR;双子叶植物SSR数量大于单子叶植物,核DNASSR数量多于细胞质DNA;根据核心序列碱基数的不同,可分为单碱基、2碱基、3碱基、4碱基等多种重复型。,不同物种其重复序列及重复单位频率不同。通过对54个植物种核DNA和28个植物种细胞器DNASSR(1-4bp)的搜索,发现：(AT)最丰富,然后依次是:(A)n、(T)n、

10、(AG)n、(CT)n、(AAT)n、(ATT)n、(AAC)n、(GTT)n、(AGC)n、(GCT)n、(AAG)n、(CTT)n、(AATT)n、(TTAA)n、(AAAT)n、(ATTT)n及(AC)n、(GT)n。同一类内碱基种类不同的SSR,丰度差别很大。,SSR的分布特点,SSR的功能,长期以来一直认为SSR是转录哑区，没有明确的生理功能。但随着研究深入，证明并非如此。SSR的主要功能:编码氨基酸；染色体末端的SSR，有保护DNA完整性、避免降解、融合及丢失的功能；提高或降低临近基因转录速率；基因重组的热点，是基因变异的来源；部分SSR可产生转录启动复合物或活化染色体,两端序列多

11、是保守的单拷贝序列，可以根据两端序列设计一对特异引物，通过PCR将其间微卫星序列扩增出来，利用电泳技术获得长度多态性。不同材料重复次数的不同，导致了SSR长度的高度变异性。,SSR分析,SSR分子标记的创制,基因组文库的构建探针制备-预杂交-带有SSR克隆的选择测序引物设计检测其它方法:EST-SSR、相关种间SSR.,Cross-speciesSSR,TaxonomicTransferabilityPolymorphismDivergence%(N)%(N)Samesubgenus89.8(521)78.3(299)Samegenus76.4(1800)86.0(773)Sameallian

12、ce45.4(403)50.4(141)Samefamily35.2(1683)58.4(363),SSR的操作,PCR反应：DNA（20ng/l）4lPrimer（1mM）0.25l10Buffer2.0lMg2+（25mM）1.2lTaq酶（5U/l）0.1ldNTP（25mM）0.2l加水至20l,混合后，进行PCR扩增：Step1952分钟Step29530秒Step35630秒Step47260秒Step5GOTOStep231循环注：SSR引物退火温度在52-65不等。,SSR的特点：,两侧顺序保守，在同种间多相同；数量丰富，在整个基因组均匀随机分布；实验重复性好，结果可靠；多数S

13、SR增减重复序列频率高，在品种间具广泛位点变异；共显性标记，可鉴别杂合子和纯合子；仅需微量组织，适合PCR分析半自动化,相对的物种专一性；由于开发时需针对每个座位的微卫星序列，发现其两端的单拷贝序列设计引物，需建立基因文库、克隆识别与筛选、测序等过程，开发困难，费用较高，耗时长；实际分析时一般每次只分析单个位点；不同引物退火温度不同，需要探索。,不足：,SSR的检测,琼脂糖凝胶检测（同前）聚丙烯酰胺凝胶检测一般采用银染、荧光检测。,银染检测程序,脱色：加1升10%HAC液，脱色20分钟冲洗：用重蒸水冲洗胶板2次，每次5分钟染色：加染色液(1%AgNO3，0.075%甲醛)30分钟冲洗：用重蒸水

14、冲洗胶板不超过5秒钟；显影：预冷显影液（30g/LNaCO3，0.075%甲醛，0.4mg/mlNa2SO3），轻摇到带纹出现；定影：在固定/停止液并轻摇3-5分钟；冲洗：用重蒸水冲洗2次，每次2分钟；干胶：室温下自然干燥过夜。,AFLP（AmplifiedFragmentLengthPolymorphism),原理：基于RFLP技术和PCR技术的结合,DNAMseI-MseIMseI-EcoRIEcoRI-EcoRIMseI-MseI片段环化，不利小片段扩增；EcoRI-EcoRI引物的退火温度高；MseI-EcoRI片段优先扩增,酶切连接,接头序列,Mse接头、Pst分别为：Mse：5-G

15、ACGATGAGTCCTGAG-33-TACTCAGGACTCAT-5Pst：5-CTCGTAGACTGCGTACC-33-CTGACGCATGGTTAA-5EcoR：5-CTCGTAGACTGCGTACC-33-CTGACGCATGGTTAA-5,M00:5-GATGAGTCCTGAGTAA-3；P00:5-GACTGCGTACCAATTC-3;E00:5-GACTGCGTACCAATTC-3;MseI-primers+3:5-GATGAGTCCTGAGTAANNN-3EcoRI-primers+3:5-GACTGCGTACCAATTCNNN-3PstI-primers+3:5-GACTGC

16、GTACATCGAGNNN-3,AFLP技术的特点,（1）由于内切酶及选择性碱基组合数和种类很多，产生标记数无限，可覆盖整个基因组。（2）多态性远远超过其它分子标记，一般可检测到50-100个AFLP扩增产物，能够在遗传关系十分相近的材料产生多态性，被认为是指纹图谱技术中多态性最丰富的一项技术。（3）AFLP分析由于扩增片段较短（30-700bp)，分辨率高。,（4）AFLP分析用样量少（0.05-0.5gDNA），而且对模板浓度的变化不敏感。（5）由于特定引物扩增，退火温度高，因而假阳性低，可靠性高。（6）引物在不同物种间是通用的，可用于没有任何分子生物学研究基础的物种。（7）银染技术具有快

17、速、方便的特点，在1-2天内可以得到指纹。,AFLP操作具体包括三个步骤：1.酶切-连接；2.PCR扩增，使目的序列扩增到0.51g；3.电泳分离（利用聚丙烯酰胺凝胶）。对于基因组较大的物种，需要进行两步扩增预扩增和选择性扩增。,AFLP操作步骤：,模板DNA的酶切与连接,DNA（200ng/l）2.5lMse3单位Pst3单位Mse接头（50pmol/l）1.0lPst接头（5pmol/l）1.0l10NEBBuffer2.5l100BSA0.25lATP（10mM）2.0lT4-连接酶（3U/l）0.4l加水至25l，37酶切-连接4-6小时，或过夜。,AFLP实验程序,DNA片段的预扩增

18、,取2.0l完成的样品，加入18l如下混合液：Mse引物（M00，50ng/l）0.6lPst引物（P00，50ng/l）0.6l10PCRBuffer2.0lMg2+（25mM）1.2lTaq酶（5U/l）0.1ldNTP（25mM）0.16l加ddH2O至20l,混合后，在如下PCR条件下扩增：Step1952分钟Step29530秒Step35630秒Step47260秒Step5GOTOStep231cyclesStep6725分钟,AFLP的选择性扩增,取4l稀释预扩增液，加入16l如下反应液：Pst引物（50ng/l）0.8lMse引物（50ng/l）0.8l10PCRBuffer

19、2.0lMg2+（30mM）1.1ldNTP（25mM）0.18lTaq酶（5U/l）0.12lddH2O11.0l,混合后按如下PCR程序扩增：Step1952分钟Step29530秒Step36530秒（-0.7/cycle）Step47260秒Step5GOTOStep212循环Step69530秒Step75630秒Step87260秒Step9GOTOStep630cyclesStep10725分钟,AFLP的检测,银染荧光同位素检测,注意事项：,1AFLP酶切反应对模板DNA质量要求较高，要求260/280在1.8左右，且不能有降解。2AFLP反应对模板DNA浓度不是很敏感，在50

20、pg-50ng时，均可以观察到多态性带，但为了实验的准确性，DNA浓度不能太低。3酶切-连接反应可以分开作，也可以合在一起作，但合在一起更方便些。,4AFLP反应对PCR要求较高，要首先摸索优化Mg2+、dNTP条件，达到最佳扩增。5EcoR受甲基化胞嘧啶的影响较小，而Pst对富含的甲基化胞嘧啶十分敏感，因而Pst-Mse检测的多为表达区域，而EcoR-Mse检测位点聚集在甲基化较高的重复序列区域。,6引物中用作选择性核苷酸的和含量对扩增出的产物数目有影响。一般而言，和含量越高，扩增出的产物数目越少。7同位素、荧光标记分辨率较高，但价格昂贵，操作不方便；银染方法方便快捷，掌握好各个环节，同样可

21、以达到很好的效果。,为什么用双酶解?,适合PCR扩增效率与变性胶的分辨率减少PCR扩增的片段,从而减少使用选择性碱基的数目使标记单链成为可能增加PCR扩增的灵活性增加使用引物的灵活性,为什么要预扩增?,减少选择性碱基的错配减轻背景提供足量模板DNA降低模板浓度的影响,目的：分子标记辅助选择(MAS)筛选BAC文库，进行图位克隆（map-basedgenecloning）,AFLPSCAR,遗传相似系数Gower(1985):,遗传距离的计算：,Rogers（1972）,Rogers-W（RogersdistanceasmodifiedbyWright（1978）,两个随机群体j、k间的遗传距离

22、（Nei1972）:,Xij为X群体第i个位点第j个等位基因频率Yij为Y群体第i个位点第j个位点基因频率,在种质资源研究中，大多数采用罗杰斯距离（RD）和改良的罗杰斯距离（MRD）（Rogers，1972；Goodman2.利用共显性标记可直接对隐性目标基因进行选择，无需测交或自交检验;3.如果目标性状不能在当代进行选择，采用MAS可直接在当代确定。,快速选出以轮回亲本为遗传背景的单株,在回交育种中不仅要考虑优良性状的导入，还必须考虑保持其整个基因组的遗传背景基本不变。通过MAS技术，借助于饱和的分子标记连锁图，对各选择单株进行整个基因组的组成分析，进而可以选出带有多个目标性状而且遗传背景良好的理想个体。,当回交转移性状由隐性基因控制时，需在选择前先自交一代使其纯合化；而且当选择的是如抗病这样的性状时，还要借助于繁琐的接种鉴定等。贾继增等（2001）根据AFLP标记进行小麦白粉病抗性的回交选择，对小麦的外源染色质及基因可以进行准确的跟踪鉴定，从而加速种质创新的进程。,计算机模拟表明：如果从每个回交世代含有目标基因的30个的单株中，通过MAS选出1株带有轮回亲本基因组比率最高的个体作为下一次回交的亲本，则完全