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Screening of antagonistic bacteria against Erwinia amylovora and its control effect in greenhouse

花匠小妙招
2024-11-07 17:07

摘要: 【背景】梨火疫病是由梨火疫病菌(Erwinia amylovora)引起的细菌性病害，对苹果、梨、山楂等40余属220多种植物危害极大。近年来，与中国毗邻的中亚多国相继暴发梨火疫病。梨火疫病菌成为国内特别是对新疆地区的特高风险有害生物，梨火疫病已被中国农业农村部列入《一类农作物病虫害名录》。【目的】从新疆本土材料以及实验室现有菌株中进行梨火疫病菌拮抗菌株的筛选，为梨火疫病的防控奠定基础。【方法】采用平板对峙法从新疆香梨种植区土壤及实验室现有菌株中分离、筛选具有显著拮抗效果的菌株，通过生理生化特性分析和16S rRNA基因测序等方法对菌株进行初步鉴定，并采用牛津杯扩散法对抑菌效果进行复筛。利用两年生盆栽杜梨苗对拮抗菌进行温室内保护型和治疗型防效测定。【结果】筛选获得11株具有显著拮抗作用的菌株，均为革兰氏阳性菌。其中9株为芽胞杆菌属(Bacillus)、2株为乳杆菌属(Lactobacillus)。平板对峙实验结果表明贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis) JE7、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) LP1和植物乳杆菌LP2拮抗作用较强，其次为贝莱斯芽胞杆菌JE4。生理特性实验结果表明：JE4、JE7可在NaCl浓度为1%-7%时生长，JE4、JE7在pH 4.0-9.0时生长，LP1可在NaCl浓度为1%-9%时生长，在pH 5.0-9.0时生长良好。温室防效测定结果显示，贝莱斯芽胞杆菌JE4防效最佳，可达到73%以上。【结论】筛选获得一批梨火疫病拮抗菌，其中部分菌株在温室内防效显著并具有较强的盐碱耐受能力。

LU Yanhong1 , HAO Jinhui1 , LUO Ming2 , HUANG Wei3 , SHENG Qiang3 , WANG Ning1 , ZHAN Faqiang1 , LONG Xuanqi1 , BAO Huifang1

Abstract: [Background] Fire blight is a bacterial disease caused by Erwinia amylovora, which is harmful to more than 220 plants belonging to more than 40 genera, such as apple, pear, hawthorn and so on. In recent years, fire blight has occurred in many countries, including central Asian countries. E. amylovora has become an extremely high risk microorganism for China, especially for Xinjiang. Fire blight has been listed in the list of first class crop diseases and pests by the Ministry of Agriculture and Rural Areas of China. [Objective] To screen the antagonistic strains of Erwinia amylovora from Xinjiang and improve the ability of Korla fragrant pear to resist the risk of fire blight. [Methods] The antagonistic strains were isolated from the soil of pear orchard and the bacteria stored in laboratory by confrontation plate method. The strains were preliminarily identified by physiological characteristics analysis as well as 16S rRNA gene sequencing, and the antibacterial effect was rescreened by Oxford cup diffusion method. The control effects were tested on two-year-old potted Pyrus betulaefolia seedlings in greenhouse. [Results] Eleven antagonistic strains were obtained, all of which were Gram positive. Nine of them were Bacillus and two were Lactobacillus. The results of confrontation plate experiment showed that Bacillus velezensis JE7, Lactobacillus plantarum LP1 and Lactobacillus plantarum LP2 had strong antagonistic effect, followed by Bacillus velezensis JE4. The control effects showed that Bacillus velezensis JE4 had the best prevention effect in greenhouse, which reached 73%. The physiological characteristics was showed that JE4 and JE7 could tolerate 1%-7% NaCl and could grow at pH 4.0-9.0; LP1 could tolerate 1%-9% NaCl and could grow better at pH 5.0-9.0. [Conclusion] A batch of bacteria against Erwinia amylovora were screened and obtained. Some of the antagonistic strains had significant control effect in greenhouse and strong saline-alkali tolerance.

梨火疫病是由梨火疫病菌(Erwinia amylovora)引起的困扰多国农业的一种细菌性病害[1]。梨火疫病菌生长温度广泛，可在动植物体内越冬，难以杀灭，极易侵染蔷薇科植物且传播迅速[2-3]。植株感染梨火疫病菌后可出现花腐、果腐、枝条枯萎和菌脓等症状。目前，梨火疫病已对美国、加拿大和新西兰等多国的梨、苹果等造成了毁灭性的打击，对林果产业产生了严重影响[4]。相关文献显示，与我国新疆毗邻的吉尔吉斯斯坦和哈萨克斯坦等国已有梨火疫病害发生，其中最近的发病果园离我国边境不到200 km[5-8]，特别是对我国新疆地区香梨和苹果产业带来巨大风险，梨火疫病于2020年被中国农业农村部列入《一类农作物病虫害名录》[9]。目前，对梨火疫病的防治以化学农药为主，虽然有一定防效，但易造成农药残留，危害人体健康，造成环境污染。另外，长期使用化学农药防治梨火疫病极易使病原菌产生耐药性[10]，如美国使用链霉素防治梨火疫病50年后出现了抗链霉素的梨火疫病菌株[7-8]，使梨火疫病更难防治。生物防治可有效解决农药残留问题，利用微生物防治病害不易使病原菌产生耐药性且对人体无害，不会造成环境污染[11-12]。国外诸多学者对梨火疫病生物防治进行了大量研究，并获得了一些生防菌株。如Mohamad等从未感染梨火疫病的梨树不同部位分离获得了一批代表菌，其中4株菌接种于未成熟果实、花和叶子后对E. amylovora具有拮抗作用[13]。Mikiciński等从苹果叶际分离出对梨火疫病菌有抗性的Pseudomonas graminis 49M，其抑菌效果在实验室和温室实验中优于商业生防菌荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens) A506，可达到与链霉素等同的抑菌效果[14]。目前大部分研究均是将生防菌用于果树地上部分进行梨火疫病的防控。Santander等研究表明，梨火疫病菌可以从果树根系向上传播[15]，因此，土壤防控也是预防梨火疫病传播的重要途径。

本研究通过从新疆库尔勒、轮台、库车、阿克苏等香梨种植区采集土壤样品，进行梨火疫病菌拮抗菌的筛选及温室内防效测定，为梨火疫病生防菌的开发与利用提供资源，以应对梨火疫病暴发风险，以期为新疆香梨和苹果产业的可持续发展奠定基础。

1 材料与方法1.1 材料

病原菌：梨火疫病菌Ea 0017由新疆出入境检验检疫局技术中心提供[16]。

供试土壤样品：采用随机取样法[17]，从新疆库尔勒、轮台、库车、阿克苏等地区梨园土壤(土壤层5-20 cm)采样，获得土壤样品100余份。

供试菌株：Lactobacillus plantarum LP1 (MW082825)、Lactobacillus plantarum LP2 (MW082826)、Lactobacillus plantarum R1 (MH094118)、Lactobacillus plantarum R7 (MH094119)、Bacillus subtilis BS-2 (MH094129)、Bacillus licheniformis WS-6 (MH094127)为实验室已有菌株，由本项目组前期工作中筛选获得并保存。

测定菌株解磷解钾特性：蒙金娜无机磷细菌培养基和硝酸盐细菌培养基[18]。

营养琼脂(Nutrient Agar，NA)培养基、营养肉汤(Nutrient Broth，NB)培养基、MRS肉汤培养基、MRS琼脂培养基、琼脂粉等，北京奥博星生物技术有限责任公司；引物、dNTPs、Taq酶等试剂，生工生物工程(上海)股份有限公司；DNA基因提取盒(Fungal/Bacterial DNA MiniprepTM D6005)，Zymo Research公司。

全自动凝胶成像系统、电泳仪，北京市六一生物科技有限公司；PCR仪，杭州博日科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 拮抗菌的初筛

病原菌的活化：将病原菌划线接种于NA平板，28 ℃条件下培养12 h，挑取单菌落接种于30 mL无菌NB液体培养基中，28 ℃、160 r/min恒温摇床中培养12 h[19]，梯度稀释至10-4，取100 μL涂布NA平板。

实验室菌株复壮：从甘油管中取100 μL乳酸菌菌液涂布MRS平板，置于30 ℃培养箱培养24 h，挑取单菌落划线于MRS平板，置于30 ℃培养箱培养24 h后备用。

土壤微生物的分离：称取5 g土壤样品置于装有50 mL无菌水的三角瓶中，30 ℃、160 r/min恒温振荡培养30 min，梯度稀释至10-3、10-4 [20]，取100 μL涂布含有病原菌的NA平板，30 ℃条件下培养24 h，对产生抑菌圈的菌株采用三线划板法进行纯化与保藏。

1.2.2 拮抗菌复筛

利用平板对峙法[21]对初筛获得的拮抗菌进行抑菌稳定性检测，具体操作如下：挑取拮抗菌单菌落点接于涂布了100 μL病原菌(102 CFU/μL)的NA平板(乳酸菌筛选培养基为1/2 NA+1/2 MRS)，每板点接4株拮抗菌，每个拮抗菌重复接种3块平板，28 ℃培养培养48-72 h，测量抑菌圈直径和菌落直径，以抑菌圈直径与菌落直径的比值代表抑菌能力。

采用牛津杯扩散法[22]对初筛获得的拮抗菌进行复筛，测试发酵上清液的抑菌效果，具体操作如下：在涂布100 μL病原菌(102 CFU/μL)的NA平板上放置2个无菌牛津杯备用。将初筛获得的拮抗菌接种于NB液体培养基中，实验室已有的植物乳杆菌活化后接种于MRS液体培养基中，30 ℃、160 r/min恒温培养12 h，取1 mL发酵液于12 000 r/min离心25 min。取上清液200 μL加入牛津杯，28 ℃培养48-72 h，测量抑菌圈直径，以抑菌圈直径代表抑菌能力。

1.2.3 拮抗菌的分类鉴定

采用三线划板法将拮抗菌接种于相应培养基平板上，30 ℃培养12-24 h。挑取单菌落接种至相应的液体培养基，培养12-24 h，采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA。以基因组DNA为模板，用细菌16S rRNA基因通用引物27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-CGGTTACCTTGTTACGACTTC-3′)进行PCR扩增。PCR反应体系(50 μL)[20]：模板DNA 2 μL，10×Buffer (含2.5 mmol/L Mg2+) 25 μL，Taq聚合酶(5 U/μL) 1 μL，dNTPs (10 mmol/L) 4 μL，27F和1492R (10 μmol/L)各1 μL，ddH2O补足50 μL。PCR反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，57 ℃ 40 s，72 ℃ 1.5 min，30个循环；72 ℃ 5 min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检验后，送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。所得序列提交至NCBI数据库进行BLAST比对，并申请基因登录号，采用MEGA 7.0软件进行系统发育分析[23]。

1.2.4 拮抗菌的生长特性测定

以麦氏比浊法为参照制备0.5麦氏比浊的菌悬液，以细菌微量检定管生理生化指标测定。参照《常见细菌系统鉴定手册》[24]及《伯杰氏细菌鉴定手册》[25]进行测定。

挑取单菌落接种于无菌蒙金娜无机磷细菌培养基(硅酸盐细菌培养基)中，30 ℃培养7 d后观察有无溶磷圈(油滴状菌落)出现[18]。

选取抑菌效果较佳的拮抗菌测定其生长特性，具体方法如下：挑取单菌落接种至30 mL相应液体培养基中，32 ℃、160 r/min培养12 h作为种子液。乳酸菌采用MRS培养基作为基础培养基，其他拮抗菌采用NB培养基为基础培养基，分别设置不同梯度pH值(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)、不同NaCl浓度(1%、3%、5%、7%、9%)的液体培养基50 mL/瓶，取1 mL种子液接入50 mL对应液体培养基中，32 ℃、160 r/min培养14 h后测定OD600。

1.2.5 拮抗菌生长曲线测定

挑取各菌株单菌落接种至30 mL NB液体培养基中(乳酸菌接种至30 mL MRS液体培养基中)，32 ℃、160 r/min培养12 h作为种子液，取1 mL种子液接种至100 mL相应液体培养基中，32 ℃、160 r/min培养，每个菌种重复接种3瓶，每隔2 h取4 mL菌液测定其OD600值[26]，调整OD600值在0.1-0.8之间，测定数值乘以稀释倍数为最终结果。

1.2.6 室内防效测定

盆栽苗预处理：对2年生盆栽杜梨苗松土并同时进行伤根处理。

选取抑菌效果较好的菌株，选用2年生盆栽杜梨苗于温室内，采用土壤接种法进行防效测定。将病原菌、拮抗菌分别挑取菌株单菌落接种于30 mL NB液体培养基，28 ℃、160 r/min振荡培养12 h作为种子液，取1 mL种子液接种于300 mL NB液体培养基，28 ℃、160 r/min振荡培养12 h后进行治疗型和保护型实验，并设置CK。

治疗型：每盆苗接种病原菌发酵液(2×108 CFU/mL) 300 mL，3 d后接种拮抗菌发酵液300 mL (2×108 CFU/mL)。

保护型：每盆苗接种拮抗菌发酵液(2×108 CFU/mL) 300 mL，3 d后接种病原菌液300 mL (2×108 CFU/mL)。

CK：每盆苗接种病原菌发酵液(2×108 CFU/mL) 300 mL，3 d后浇水300 mL。

实验于温室内进行，每个处理10盆。接种病原菌后采用棚布遮盖保湿3 d。统计每盆杜梨苗枝条数，待枝条出现发病症状，逐一进行统计。病斑长度≤1/3枝条长度，计为1级；1/3枝条长度 < 病斑长度≤2/3枝条长度，计为3级；病斑长度 > 2/3枝条长度，计为5级[16]。按如下公式计算病情指数和防效值：

实验完毕，全部实验用品，包括三角瓶、移液器枪头、废弃平皿、培养液、苗木及土壤采用高温灭菌，所用花盆等器具采用消毒液浸泡处理。

1.3 数据分析

数据采用SPSS软件进行单因素方差分析中的Duncan法进行显著性分析，Excel 2019制图，MEGA 7.0软件构建系统发育树。

2 结果与分析2.1 拮抗菌的分离与筛选

土壤微生物分离：采用平板对峙法从新疆香梨种植区土壤样品中初筛共获得36株对梨火疫病菌具有拮抗作用的菌株。

采用平板对峙法对上述36株拮抗菌抑菌能力进行初筛，以抑菌圈直径(D)与菌落的直径(d)比值(D/d)来表示拮抗菌抑菌能力，结果得到9株拮抗效果优良(D/d > 1.70)且稳定的菌株，分别命名为JE1-JE9。结果如表 1所示，实验所获得的9株代表菌对梨火疫病菌具有明显的抑制作用。其中，JE7的抑菌作用最强，抑菌直径可达19 mm，D/d值为3.53；其次为JE4、JE6和JE1，D/d值分别为3.33、3.17、3.00；JE2、JE3、JE5、JE8、JE9的抑菌直径在13.00-18.50 mm之间，D/d值均大于1.70。乳酸菌平板对峙实验结果表明，乳酸菌在1/2 NA+1/2 MRS上不能正常生长，未产生明显拮抗效果，因此后期收集其发酵液采用牛津杯扩散法进行筛选。

表 1　拮抗梨火疫病菌初筛结果Table 1　Preliminary screening result of antagonistic Erwinia amylovora strains

Strain No. D/d JE1 3.00±0.25b JE2 1.83±0.11d JE3 2.40±0.20c JE4 3.33±0.38ab JE5 1.74±0.17d JE6 3.17±0.38ab JE7 3.53±0.31a JE8 1.78±0.11d JE9 2.14±0.13c注：D表示抑菌圈直径；d表示菌落直径；D/d值越大表明拮抗作用越强。不同字母表示差异显著(P < 0.05)
Note: D is the diameter of inhibition zone; d is colony diameter; The greater the D/d value, the stronger the antagonism. Different letters indicate significant difference (P < 0.05)

选取JE1-JE9中抑菌作用较强的拮抗菌(D/d > 2.40) JE1、JE3、JE4、JE6、JE7及实验室已有的2株乳酸菌(分别命名为LP1和LP2)，采用牛津杯扩散法对菌株发酵液抑菌效果进行复筛。复筛结果如表 2所示，以抑菌圈直径判断发酵液的抑菌效果。其中，土壤来源的拮抗菌JE7和实验室已有的乳酸菌LP1、LP2抑菌效果最强，抑菌圈直径分别为29.33、27.33、26.33 mm；其次为JE4，抑菌直径为20.33 mm；其他代表菌的抑菌能力依次为JE6 > JE1 > JE3。部分拮抗菌发酵液抑制梨火疫病菌的结果如图 1所示。

表 2　拮抗菌发酵液对梨火疫病菌的抑菌圈直径Table 2　The diameter of inhibition zone produced by antagonistic fermentation broth against Erwinia amylovora

菌株编号
Strain No. 抑菌圈直径
Diameter of inhibition zone (mm) JE1 15.67±1.53cd JE3 13.33±2.08d JE4 20.33±2.52b JE6 16.67±1.53c JE7 29.33±0.58a LP1 27.33±1.15a LP2 26.33±1.53a注：不同字母表示差异显著(P < 0.05)
Note: The different letter means significant difference (P < 0.05)

图 1　部分拮抗菌发酵液抑制梨火疫病菌结果Figure 1　Partial antagonistic fermentation broth against Erwinia amylovora 注：A：JE7；B：左LP1，右LP2 Note: A: JE7; B: LP1 left, LP2 right

2.2 拮抗菌的分类鉴定

对上述拮抗效果较好的11株菌分别提取基因组DNA进行16S rRNA基因扩增并测序。获得的菌株序列提交至NCBI数据库进行比对，并申请基因登录号，结合相似度最高的模式菌株序列构建系统发育树。结果表明，所得的11株拮抗菌分别归属于细菌域厚壁菌门的2个属，如图 2所示。其中，9株为芽胞杆菌属(Bacillus)，分别为贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)、解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)和多粘类芽胞杆菌(Paenibacillus polymyxa)；2株为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。

图 2　基于16S rRNA基因序列构建的拮抗菌系统发育树Figure 2　Phylogenetic tree of antagonist bacteria based on 16S rRNA gene sequence 注：T为模式菌株；分支上的数字为Bootstrap值，表示构建系统进化树时计算1 000次时形成该节点的百分比，只显示大于50%的值；括号内数值为GenBank登录号；标尺0.5代表 50%的16S rRNA基因序列的进化差异 Note: T is the model strain; The bootstrap values (%) presented at the branches were calculated from 1 000 replications, only showing bootstrap values higher than 50%. Numbers in parentheses are GenBank accession numbers; The scale bar 0.5 represents 50% evolutionary variation in the 16S rRNA gene sequence

2.3 拮抗菌生长特性的测定

对上述11株拮抗菌的生理生化特性进行分析，结果如表 3所示，11株拮抗菌均为革兰氏阳性菌，均可利用D-葡萄糖且接触酶呈阳性，而氧化酶、硫化氢产气、吲哚试验呈阴性，但对鼠李糖、甲基红、甘露醇的利用存在一定差异。此外，除LP1和LP2外，9株芽胞杆菌均可利用L-阿拉伯糖，而且明胶液化、水解淀粉、硝酸盐还原试验、VP试验等实验结果均呈阳性。上述11株拮抗菌均无溶磷、解钾特性。

表 3　拮抗菌的生理生化特性Table 3　Physiological and biochemical characteristics of antagonistic bacteria

测定指标
Identification index JE1 JE2 JE3 JE4 JE5 JE6 JE7 JE8 JE9 LP1 LP2 D-葡萄糖D-glucose + + + + + + + + + + + L-阿拉伯糖L-arabinose + + + + + + + + + - - 明胶液化反应Liquefy glutin + + + + + + + + + - - 硝酸盐还原Nitrate reduction + + + + + + + + + - - 革兰氏染色Gram stain + + + + + + + + + + + 接触酶反应Contact enzyme test + + + + + + + + + + + 淀粉水解Starch hydrolysis + + + + + + + + + - - VP + + + + + + + + + - - 氧化酶Oxidase - - - - - - - - - - - 硫化氢产气H2S production test - - - - - - - - - - - 吲哚试验Indole test - - - - - - - - - - - 鼠李糖Rhamnose + + - - - - - - + - - 甲基红Methyl red + + - - - - - - - + - 甘露醇Mannitol + + + + + + + + + + - 解钾Dissolving potassium - - - - - - - - - - - 溶磷Dissolving phosphate - - - - - - - - - - -注：+：阳性；-：阴性
Note: +: Positive; -: Negative

对复筛拮抗效果较强的JE4、JE7及LP1生长特性进行分析，结果如图 3所示。NaCl浓度和pH耐受实验结果表明，JE4在NaCl浓度为1%-7%、pH值为5.0-8.0时生长良好；JE7在NaCl浓度为1%-5%、pH值为4.0-8.0时生长良好；LP1在NaCl浓度为1%-5%及pH值为5.0-9.0时生长良好。

图 3　NaCl浓度和pH值对菌株生长的影响Figure 3　The effect of NaCl concentration and pH on the growth of strains

2.4 拮抗菌的生长曲线

对复筛拮抗效果较强的JE4、JE7、LP1进行生长曲线测定，结果如图 4所示。实验结果表明，3株拮抗菌生长曲线的变化趋势和进入延迟生长期、对数增长期、稳定期和衰退期的时间存在区别。LP1在2-10 h为延迟生长期，10-12 h为对数增长期，12-18 h为生长稳定期，18-22 h为衰退期。JE4和JE7生长曲线的变化趋势较为接近，但JE4在2-4 h为延迟生长期，4-10 h为对数增长期，10-16 h为稳定期，16-22 h为衰退期；JE7在0-6 h为延迟生长期，6-16 h为对数生长期，18-20 h为稳定期，20-22 h为衰退期。

图 4　拮抗菌的生长曲线Figure 4　The growth curve of antagonistic bacteria

2.5 拮抗菌的室内防效测定

对复筛拮抗效果较强的JE4、JE7及LP1于温室内进行防效实验，结果如表 4所示。结果表明，贝莱斯芽胞杆菌JE4防效最佳，保护型防效可达74%，治疗型防效可达73%；LP1防效最差，保护型防效为49%，治疗型防效为38%。3株菌的保护型防效均优于治疗型。

表 4　温室防效测定结果Table 4　The results of control effect in greenhouse

处理
Treatment 病情指数
Disease index (%) 防效
Efficacy (%) CK
(The total number of branches 68) 88.66±3.5a JE4 protected
(The total number of branches 48) 22.9±1.0e 74.17±4.5a JE7 protected
(The total number of branches 40) 36.5±4.4d 58.83±2.4bc LP1 protected
(The total number of branches 125) 45.2±1.7c 49.02±4.5d JE4 remedy
(The total number of branches 34) 23.7±1.3e 73.26±5.7a JE7 remedy
(The total number of branches 44) 40.6±8.8cd 54.21±3.1cd LP1 remedy
(The total number of branches 96) 64.6±3.3b 38.41±8.8b注：不同字母表示差异显著(P < 0.05)
Note: The different letter means significant difference (P < 0.05)

3 讨论与结论

生物防治是预防植物病害、减少化学农药污染和残留的重要手段，优良拮抗菌种的筛选是生物防治取得良好成效的重要前提。Stockwell等采用成团泛菌(Pantoea agglomerans) Eh252对梨火疫病进行防治，并通过施加于果树上进行防治等方法测试了对E. amylovora的防治效果[27]，但在果园中使用时抑菌效果明显降低。El-Goorani等曾在实验室筛选出5株在平板对峙实验中对E. amylovora具有拮抗作用的枯草芽胞杆菌，但其在植株防效测定时对病原菌却未展现出抑菌作用[28]。由此可见，生防菌田间使用效果与环境条件密切相关，拮抗菌株首先要对当地环境有良好的适应性，能在土壤中或植物组织上存活并大量繁殖，才能充分发挥其防病效果。新疆地处典型的内陆干旱区，紫外线辐射较强、气候干燥、土壤盐碱度高等均成为限制生防菌功效发挥的影响因素。因此，本文主要以香梨种植区土壤为材料进行拮抗菌筛选，以提高拮抗菌的环境适应性，从而提高拮抗菌的应用价值。本研究从土壤中筛选获得的拮抗菌进行平板对峙实验时，JE7、LP1拮抗效果最佳，二者无显著差异，JE4效果次之；采用盆栽杜梨苗进行防效测定时，JE4防效最佳，JE7次之，LP1防效最差。植物乳杆菌在平板对峙时拮抗效果最佳，采用土壤接种时防效却最差，推测可能是植物乳杆菌在土壤中定殖能力不如贝莱斯芽胞杆菌强，因此植物乳杆菌可能不适合单独施用于土壤中。实际生产中，可以考虑将植物乳杆菌采用叶喷方式在树体上使用，贝莱斯芽胞杆菌采用土壤灌根方式进行配伍使用。另外，由于环境等多因素影响，单一菌剂效果往往不如复合菌剂效果优良。因此，在后期研究中，可就复合菌剂协同作用展开研究。

新疆土壤大多属于盐碱土壤，本研究中拮抗菌NaCl浓度和pH值耐受能力检测结果显示，3株菌均具有较强的盐碱耐受能力，表明其对新疆土壤具有较强的适应性。

多批次盆栽防效实验结果显示，保护型防效均优于治疗型防效，表明提前预防比后期治疗更有效。因此，在日常的栽培管理中，若以有机肥为载体，配合施用梨火疫病拮抗菌，将大大提升梨树、苹果树等蔷薇科植物抵御梨火疫病暴发风险，对新疆香梨、苹果等产业可持续发展具有重大意义。

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