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【一起学】农杆菌浸花法如何转化拟南芥？

花匠小妙招
2024-11-09 23:39

拟南芥作为模式生物，具有很多其他常见植物无法比拟的优势：
1.基因组较小，大约包含1.57亿个碱基，仅为小麦的1/80，只含有5对同源染色体。小的基因组规模为尽早地全基因组诠释提供了便利，蛋白组学也有很大进展。
2.植株小，环境适应能力强，方便人工规模化培养；
3. 生活周期短，繁殖能力强，节省实验周期。
4. 严格的闭花自花传粉，基因高度纯合，能保留基因突变和其他遗传特征。
5. 很强的可诱变性，可通过物理手段（X-Ray和慢中子）和化学手段（EMS，生物的T-DNA插入等）进行较高突变率地人工诱变。。
6. 分布广，种质资源丰富。大量的野生突变体和超过300 000个独立的T-DNA插入株可通过T-DNA database网站查阅。
7. 整个幼苗以及成苗的根呈现半透明，方便光学显微镜进行直观研究。

拟南芥转基因技术

目前，拟南芥转基因技术主要是利用农杆菌介导的转化。该方法简单，不需要经过复杂、技术含量要求高的组织培养和重新诱导分化，即可直接获得转基因植物，为植物基因功能、遗传发育和生理代谢研究提供便利。拟南芥转基因的原理是将目的基因以及相关元件插入载体，比如pCAMBIA系列和pPZP系列等。具体构建方法同一般的质粒构建。构建好的质粒在大肠杆菌中进行扩增和制备，再通过化学转化或电击法将载体转入农杆菌GV3101菌株的感受态细胞中。该菌株带有庆大霉素（Gent）和利福平(Rif)抗性，而载体携带卡那霉素（Kan）抗性基因，经三种抗生素共同抗性筛选去除大肠杆菌和未转化的农杆菌。再利用PCR或酶切鉴定得到阳性农杆菌克隆。

拟南芥蘸花法示意图。

浸花法（floral dip method）（Clough等，1998）是农杆菌介导拟南芥遗传转化的一种常用方法。用于转化的植株需培养4～5周，直到其抽苔开花，转化前去除果荚和已授粉的花，提高转化的阳性率。将拟南芥的花序放到含有农杆菌的转化介质中浸泡3～5分钟，农杆菌可以穿过植物细胞壁和质膜，侵染胚囊，将带有目的基因和元件的T-DNA片段整合到雌配子的基因组上，完成转化。
以下是蘸花法的protocol（徐远涛,徐强 2018）：
材料与试剂
培养钵、保鲜膜、营养土 (泥炭土:蛭石:牛粪=1:1:1)、带有目的基因载体的农杆菌菌株、苗龄5周左右的拟南芥植株、蔗糖、Silwet-77、含抗生素的LB培养基、VB、
仪器设备
剪刀、生长室、震荡培养箱、离心机、分光光度计
实验步骤

长日照 (光照16 h、黑暗8 h) 环境下种植健壮的拟南芥植株 (约5周)。剪掉最开始抽出的1-5 cm长的初生主花序 (促进长出更多的侧生花序)。修剪后一个星期内进行渗透转化 (一般3~5 d)。并且在渗透转化的前1 d植株需充分浇水，以便植物气孔在转化时充分张开。准备农杆菌液。通常先用1 ml 含抗生素的LB培养基培养已经转化了目的表达载体的农杆菌液，然后再吸取150 μl培养过夜的菌液加入到150 ml 新鲜的液体LB培养基中28 °C环境下震荡培养24 h。 4,000 x g，20 min离心菌液，然后将菌重悬于120 ml渗透液 (10%蔗糖 + 400 μl/L Silwet-77，蘸花前充分混匀，OD600=0.8-1.0) 中。与此同时，剪掉植株上的果荚和已经完全开放的花。将植株的地上部分浸入菌液中1 min，轻微震荡。用保鲜膜将侵染过的植株罩起来以保持湿度，暗培养1 d，然后置于正常培养条件，2~3 d后可去掉保鲜膜，转化后1周左右方可浇水，并定期继续侵染几次。继续培养至植物成熟，收种子放在干燥环境中1周左右，即可筛选转化子。

注意事项

在去除初生花序后，次生花序约2-10 cm时最适宜侵染。因为此时有许多可用来侵染的花蕾。渗透液浓度在0.15~1.74之间时，转化率没有明显变化。 Silwet L-77浓度在0.02%~0.1%时，转化率是0.005%时的10-20倍，故一般采用的浓度为0.05%。但是，值得注意的是利用高浓度的Silwet L-77进行侵染时，在某些环境下会导致植物组织坏死。

参考文献：
1. 徐远涛 , 徐强 . (2018). 拟南芥蘸花侵染. Bio-101: e1010203. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010203.