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PEG介导原生质体转化构建链格孢荧光菌株及其侵染苹果花器特性

花匠小妙招
2024-11-09 23:44

苹果霉心病（moldy core）和心腐病（core rot）是苹果重要果实病害,在世界各苹果产区均普遍发生。苹果霉心病不仅引起采收前落果,成熟果实心室霉变腐烂,在贮藏期还可造成大量烂果,给果农、经销商及消费者均造成很大损失。另外,引起霉心病的多种病原真菌可产生真菌毒素（Logrieco et al. 2009）,对人类健康也造成威胁。

苹果霉心病是由多种病原真菌侵染引起的复合病害。目前,已经报道的病原真菌有20余种,不同地区的病菌种类因品种或环境条件的不同而有所差异,引起的症状也存在差异。Ellis & Barra（1983）从萼筒开放的红星苹果中分离出的真菌中有98%是链格孢属Alternaria真菌,其中链格孢A. alternata最为普遍。Combrink et al.（1985）从红星心腐果实中也分离出大量A. alternata。Serdani et al.（2002）研究发现南非红星苹果心腐病病原链格孢的优势种为细极链格孢A. tenuissima。van der Walt et al.（2010）通过对红星湿腐果实组织的分离,发现链格孢和青霉菌Penicillium spp.是心腐病的优势种。在我国,呼丽萍等（1996）研究发现甘肃天水地区红星苹果中霉心病菌链格孢的分离频率为79.9%。Gao et al.（2013）通过对富士苹果霉心病症状类型及病菌的系统研究,将霉心病分为霉心型、心腐型和褐变型等症状类型,其中褐变型病果中链格孢的分离频率为81.4%,霉心型病果中链格孢的分离频率为75.7%,心腐型病果中粉红聚端孢Trichothecium roseum的分离频率为52.8%,表明链格孢和粉红聚端孢分别是引起我国苹果霉心病和心腐病的主要病原菌。

苹果霉心病的病菌种类构成复杂,从侵染到发病周期长,且发病部位在果实内部,给开展病害侵染通道的研究造成困难。绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）标记菌株在荧光显微镜下显现绿色,可以在其侵染的组织中被直接观察到,因而该技术为霉心病菌侵染特性的研究提供一种有效途径。聚乙二醇（PEG）介导的遗传转化方法通过PEG改变细胞膜透性,使外源DNA进入原生质体从而整合到染色体上,利用PEG介导的遗传转化可以将GFP基因整合到真菌基因组中构建绿色荧光菌株。董秋月等（2018）将GFP和mCherry与果生炭疽菌Colletotrichum fructicola组蛋白基因融合,通过PEG介导的原生质体转化方法将其整合到基因组中,研究了细胞周期调控和有性繁殖过程。戴蓬博等（2019）基于PEG介导原生质体转化将GFP转入粉红聚端孢T. roseum,构建了荧光菌株,并明确了病菌的确切侵入通道（Dai et al. 2020）。

本研究拟对苹果霉心病的主要病菌链格孢A. alternata基于PEG介导的遗传转化方法构建GFP标记菌株,以期为病原链格孢在自然条件下侵入苹果心室的特征研究提供一种有效手段。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 菌株：链格孢A. alternata (Fr.) Keissl.野生型菌株ZQ251921,由西北农林科技大学真菌研究室从苹果霉心病果分离获得和保藏。

1.1.2 质粒：RP27-GFP-1,启动子为RP27,含有GFP基因、氨苄青霉素抗性和潮霉素抗性基因,由西北农林科技大学真菌实验室构建。

1.1.3 培养基和试剂：PDA、PDB培养基为常用培养基配方。TB3培养基、TB3 Bottom Agar培养基、TB3 Top Agar培养基、STC溶液、PTC溶液的配制参考韩小路等（2016）的方法。酶解液：0.1g崩溃酶（driselase）,0.1g蜗牛酶（snail enzyme）,0.1g溶壁酶（lysing enzyme）,溶解于10mL的0.7mol/L NaCl溶液中。潮霉素（hygromycin B）购自德国Roche公司,崩溃酶、溶壁酶、蜗牛酶购自美国Sigma公司,其他试剂、试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司。

1.2 PEG介导的链格孢菌丝体原生质体转化

1.2.1 原生质体制备：将野生型ZQ251921菌株接种在PDA平板上,置于25℃培养箱中培养3d。刮取幼嫩菌丝于PDB培养基中,25℃、200r/min摇培2d至生长出大量幼嫩菌丝球。用经灭菌的Miracloth过滤PDB摇培液,再用200mL灭菌水及50mL的0.7mol/L NaCl溶液冲洗菌丝体。挑取0.5g菌丝体到无菌的50mL离心管中,加入15mL配制好的酶解液,轻微振荡使菌丝分散。放入30℃、65r/min的摇床培养3h,镜检发现圆球状原生质体形成。将酶解混合物用经灭菌的Miracloth过滤到50mL无菌离心管中,再用20mL的0.7mol/L NaCl溶液冲洗。将滤液于4℃、4 000r/min离心机中离心10min后弃上清,加入10mL STC溶液重悬原生质体,再用3 500r/min离心10min后弃上清,留下约1mL STC溶液重悬。在显微镜下用血球计数板计数,用STC溶液将原生质体终浓度调至约5×107个/mL。

1.2.2 转化和再生：在灭菌的2mL离心管中加入原生质体200μL、50mol/L亚精胺4μL、2.5mg/mL肝素钠10μL、质粒DNA 15μL,用移液枪安装去枪尖枪头轻轻吹打混匀后再冰浴30min。然后缓慢加入1mL PTC,混匀后室温静置20min。将上述溶液加入到含TB3溶液10mL、氨苄青霉素（终浓度50μg/mL）的50mL离心管中,放入30℃、70r/min的摇床中培养过夜。4 000r/min离心10min后弃上清,加入50mL融化后冷却至50-60℃的TB3 Bottom Agar,再加入潮霉素（终浓度50μg/mL）和氨苄青霉素（终浓度50μg/mL）,混匀后平均倒入3个无菌培养皿中,置于25℃培养箱中培养10h。将50mL含有潮霉素（终浓度100μg/mL）、氨苄青霉素（终浓度50μg/mL）的TB3 Top Agar平均倒入上述3个平板中,置于25℃培养箱中培养2-3d。挑取转化子接种到潮霉素浓度为100μg/mL的PDA平板上,置于25℃培养箱中培养以备验证与保存。

1.3 链格孢转化子的检测与筛选

1.3.1 荧光观察：用接种针挑取转化子菌丝及分生孢子在荧光显微镜下观察。对绿色荧光较强的转化子进行继代培养3-4代,对荧光保持良好的转化子用甘油冷冻-80℃保存。

1.3.2 菌落形态观察及生长速率测定：将野生型菌株及筛选的转化子分别接种在PDA平板上,置于25℃培养箱中培养7d。用直径5mm的经灭菌的打孔器在PDA平板菌落边缘打取菌饼,接种于新的PDA平板中央,置于25℃培养箱中培养。每隔24h采用十字交叉法测量各平板菌落直径并记录数据,并在菌落长满培养皿之前进行正反面拍照。每个菌株分别接种3个PDA平板,试验重复3次。

1.3.3 致病性测定：用经灭菌的直径5mm打孔器在扩繁好的转化子和野生型菌株菌落边缘打取菌饼。选取大小一致的新鲜富士苹果（直径约80mm）,对果面进行清洗、酒精表面消毒,在超净工作台中用经灭菌的手术刀沿苹果中轴线切开露出心室。将菌饼接种于心室腔中,用喷有少许无菌水的保鲜膜保湿。每个菌株接种3个果实,以心室中接种不带菌的PDA培养基饼作对照。将果实放置于收纳盒中,在25℃培养箱中保育5d后测量果实病斑直径并拍照。试验重复3次。

1.4 田间接种链格孢荧光菌株

1.4.1 孢子悬液的制备：将筛出的转化子单孢分离后接种在PDA平板上,置于25℃培养箱中保育7d,此时链格孢产生大量分生孢子,向菌落加入10mL无菌水,用涂布器涂抹平板,将菌悬液用无菌Miracloth过滤,收集得到孢子悬液。在显微镜下用血球计数板计数,用无菌水将孢子悬液浓度调至约1×106个/mL。

1.4.2 田间接种：在苹果盛花期,将配制好的转化子孢子悬液用25mL小喷壶均匀喷撒花器,使花器充分润湿但不形成水滴,用喷水的保鲜袋包裹花器,保湿24h后去除保鲜袋。

1.4.3 调查采样：接种后24、48、96h分别采样,后期根据苹果生长发育情况进行定期采样。

1.4.4 侵染观察：在实验室,对采自田间发病的花瓣、花柱、花药、花丝等花器官及幼果分别制片,用荧光显微镜观察并拍照。

2 结果与分析

2.1 链格孢的遗传转化、荧光观察

链格孢为暗色丝孢菌,其细胞壁较厚,不易被降解,因此,菌丝的数量和幼嫩程度是制备大量原生质体的关键。在试验中,将链格孢野生菌株在PDB液体培养基中摇培48h后获得大量幼嫩菌丝。将0.5g湿菌丝体加入15mL酶解液酶解3h后可得到足量原生质体。摇培20h及更短时间则菌丝量不足。摇培时间超过60h菌丝分泌物增多难以冲洗,且菌丝老化不能被酶解。转化和再生后共获取了150个转化子,挑选15个绿色荧光明显的菌株,连续培养3代后,其绿色荧光依然保持良好,说明GFP基因已经整合到链格孢野生菌株基因组中。经比对荧光强度,最终选择孢子和菌丝都表现出较强荧光信号的转化子NC-1（图1）进行后续检测分析。

图1 绿色荧光蛋白在链格孢转化子NC-1中的表达

A：分生孢子在微分干涉差显微镜下呈现浅棕色;B：分生孢子在荧光显微镜下呈现较强绿色荧光;C：菌丝在微分干涉差显微镜下呈现淡褐色;D：菌丝在荧光显微镜下呈现较强绿色荧光. 标尺=5μm

Fig. 1 Expression of GFP in Alternaria alternata transformant NC-1.

A: Conidia showing light brown under differential interference contrast microscopy; B: Conidia emitting obvious green fluorescence under fluorescence microscopy; C: Hyphae showing pale brown under differential interference contrast microscopy; D: Hyphae emitting obvious green fluorescence under fluorescence microscopy. Bars=5μm.

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2.2 荧光标记转化子NC-1生物学特性和致病力

在PDA平板上,25℃培养8d,观察到转化子NC-1菌落形态和颜色与野生型菌株之间无显著差异（图2）。转化子NC-1生长速率与野生型菌株也无显著差异（图3）。以空白PDA培养基饼为对照,将直径为5mm的转化子NC-1和野生型菌株菌饼接种于苹果果实的心室,5d后转化子NC-1与野生型菌株均可引起果实心室发生病变,且病斑直径无显著差异（P>0.05）（图4）,以上结果表明链格孢转化子NC-1的生物学特性和致病性与野生型菌株相比未发生显著改变。

图2 链格孢野生型菌株和转化子NC-1在PDA上的菌落形态（8d）

A：野生型菌落正面;B：转化子NC-1菌落正面;C：野生型菌落反面;D：转化子NC-1菌落反面

Fig. 2 Colonies of wild type and transformant NC-1 of Alternaria alternata on PDA (8d).

A: The upper observation of wild type colony; B: The upper observation of transformant NC-1 colony; C: The reverse observation of wild type colony; D: The reverse observation of transformant NC-1 colony.

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图3 链格孢野生型和转化子NC-1在PDA平板上的生长曲线

Fig. 3 Growth curve of wild type and transformant NC-1 of Alternaria alternata on PDA.

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图4 链格孢野生型和转化子NC-1接种富士苹果5d后的致病情况

A：接种野生型菌株病斑直径为(26.35±0.89)mm;B：接种转化子NC-1病斑直径为(26.07±0.93)mm

Fig. 4 Pathogenicity expression of wild type and transformant NC-1 of Alternaria alternata on cv. Fuji apple fruit after 5 days of inoculation.

A: The lesion diameter (26.35±0.89)mm inoculated with wild type; B: The lesion diameter (26.07±0.93)mm inoculated with transformant NC-1.

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2.3 链格孢转化子NC-1侵染花组织观察

在苹果花期接种链格孢转化子NC-1孢子悬液（1×106个/mL）48h后,花瓣、花柱、花丝、花药等花器官均发生病变：花药颜色加深呈棕褐色,表面布满大量菌丝（图5E）,在荧光显微镜下显现较强的绿色荧光（图5I）;花瓣上出现大量水渍状病斑（图5F）,表面有大量菌丝扩展（图5J）;花丝出现褐变,病变部位布满菌丝（图5G）,在荧光显微镜下显现荧光（图5K）;花柱发生褐变皱缩（图5H）,且柱头上散布大量菌丝（图5L）。4d后发病严重的花脱落,花朵整体显现灰褐色干枯症状,表面布满大量灰黑色菌丝（图6A）;20d后感病幼果整体萎缩、霉变及脱落（图6B）,在发病柱头（图6C）及发病幼果的花器残体上（图6D）布满菌丝。以上结果显示田间接种链格孢转化子NC-1孢子悬液后,病原菌可以定殖于苹果花器组织并引起病变,当菌体数量繁殖到一定阶段可引起整个花器官以及幼果霉变、脱落。试验结果表明,链格孢可以侵染苹果的主要花器,包括花瓣、雄蕊和雌蕊,构建的链格孢荧光菌株NC-1荧光表达稳定。

图5 田间接种链格孢转化子NC-1 48h苹果花组织发病情况

A：未接种花药;B：未接种花瓣;C：未接种花丝;D：未接种花柱;E：接种花药;F：接种花瓣;G：接种花丝;H：接种花柱;I：花药上荧光菌丝体;J：花瓣间荧光菌丝体;K：花丝上荧光菌丝体;L：花柱上荧光菌丝体. 标尺：A,E,I,J,L=500μm;B,C,D,F,G,H,K=2mm

Fig. 5 The symptom of apple floral tissues after 48h of field inoculation with Alternaria alternata transformant NC-1.

A: Non inoculated anther; B: Non inoculated petal; C: Non inoculated filament; D: Non inoculated styles; E: Inoculated anther; F: Inoculated petal; G: Inoculated filament; H: Inoculated style; I: Fluorescent hyphae on anther; J: Fluorescent hyphae in petal; K: Fluorescent hyphae on filament; L: Fluorescent hyphae on style. Bars: A, E, I, J, L=500μm; B, C, D, F, G, H, K=2mm.

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图6 田间接种链格孢转化子NC-1苹果花和幼果的发病情况

A：接种4d苹果花;B：接种20d幼果;C：柱头上荧光菌丝体;D：幼果花器残体上荧光菌丝体. 标尺：A,B=2mm;C,D=300μm

Fig. 6 The symptom of apple flower and young fruit after inoculation with Alternaria alternata transformant NC-1 in field.

A: The flowers after 4d of inoculation; B: The young fruit after 20d of inoculation; C: Fluorescent hyphae on diseased stigma; D: Fluorescent hyphae on floral organ remnants. Bars: A, B=2mm; C, D=300μm.

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3 讨论

开展PEG介导遗传转化实验时,原生质体的数量和质量是转化效率的关键,而菌丝体的数量和菌龄直接影响原生质体的获得。伏建国等（2005）将链格孢菌落边缘的菌饼于液体培养基中进行摇培,20h后收集菌丝体。本研究改进后仅刮取菌落边缘幼嫩菌丝体进行液体摇培,使菌丝球容易分散,更有利于菌丝体的冲洗与酶解。另外,我们将液体培养时间延长至48h,方获得足够的幼嫩菌丝体。顾雪迎等（2016）以分生孢子为基础构建了链格孢苹果致病型的ATMT转化体系,但链格孢中许多菌株在培养条件下不易产孢,不宜采用孢子进行遗传转化。本研究以菌丝体为材料制备原生质体,构建了PEG介导的遗传转化体系,可广泛应用于链格孢遗传转化。

长期以来,由于人们对苹果霉心病菌侵染特性一直缺乏深入了解,从而在生产中无法制定有效的防治技术。最近,Dai et al.（2020）通过荧光标记方法,系统观察了粉红聚端孢T. roseum在富士品种苹果上的侵染特性,发现其菌丝主要通过苹果离生花柱间缝隙侵入,沿合生花柱缝、花柱延伸缝、心室壁裂缝扩展,最终引起心室周围果肉发病。苹果霉心病病原种类多样,其中链格孢A. alternata为世界范围苹果霉心病病原的优势种类,但其侵入苹果心室的特征目前还不清楚,本研究成功构建了链格孢荧光标记菌株,并研究了其侵染苹果花器组织的特征,为进一步开展心室侵染研究奠定了基础。

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