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发根农杆菌介导非组培依赖的芍药根系遗传转化种植方法

花匠小妙招
2024-11-13 01:49

本发明涉及芍药种植和分子育种，具体的说是一种发根农杆菌介导的非组培依赖式芍药根系遗传转化种植方法。

背景技术：

1、芍药是芍药科芍药属多年生花卉，其花型优美、花色高雅、花香芬芳素有“花仙”、“花相”之称。芍药花可观赏，根部可入药，种子可制油，从古至今都被作为一种重要的花卉作物。

2、现有技术中，常用的基因功能研究是将目的基因在本植物进行稳定遗传，得到转基因植株。芍药因其没有完整的基因组序列且组培体系研究仍处于前期探索阶段，导致其遗传转化工作无法正常进行，严重阻碍了芍药分子遗传机制和品种改良种植的研究进程。同时，芍药的扦插繁殖目前大多研究集中于地上部分茎段和根茎扦插上，肉质根扦插相关研究仍存在空白，而且现有的扦插繁殖方式存在生根周期长、生根率低等问题，难以应用于科研及生产实践。

3、目前，虽然国内外有关芍药属植物组织培养方面的研究有了一些进步，但仍然存在外植体易污染、褐化及玻璃化，愈伤组织再分化困难，难以诱导出健壮的丛生苗，以及芍药无菌苗生根困难等问题，尚未建立完整稳定的遗传转化体系，相应的分子机制研究也仅停留在拟南芥或矮牵牛等模式植物的异源转化上。

4、发根农杆菌是革兰氏阴性土壤细菌，隶属于根瘤菌科农杆菌属，是一种共生细菌，在细菌分类学上也被命名为发根根瘤菌。发根农杆菌的遗传转化原理是将ri质粒上的t-dna通过侵染植物受伤部位的方式整合到植物基因组中进而诱导植物形成阳性根系。通过其这一特点，发根农杆菌的技术常被用于植物性状分子机制研究、性状改良及新品种的培育等方面。目前，一些重要的农作物和观赏作物如苹果、柑橘、甘薯、玫瑰、菊花等通过发根农杆菌转化法建立了稳定的遗传转化体系，为后续优良性状分子机理基础研究和品种改良及新品种的开发等方面奠定了基础。

5、但由于芍药存在基因组特殊，繁殖困难，组织培养难度高等问题，导致发根农杆菌在芍药遗传转化种植方面的使用存在较大瓶颈。其主要表现在：1、现阶段几乎所有的遗传转化体系建立需要组培技术的支持，目前芍药没有完整的组培体系，无法进行遗传转化体系的建立；2、传统的农杆菌转化法依赖于高效稳定的组织培养体系，需要在无菌环境完成侵染及之后的阳性根诱导，但芍药当前不满足这一前提；3、发根农杆菌介导的遗传转化法同样需要组培体系和无菌环境，虽在技术层面相比传统转化增添了诱导生根的作用，但由于芍药没有完整的组培体系，仍不适用于芍药；4、芍药属于多年宿根植物，肉质根硕大且表皮坚韧，还需经过低温解除休眠方可萌蘖，因此，芍药的肉质根不易侵染农杆菌，造成其复合型植株不易形成，也难以种植成活。

6、因此，建立稳定高效的芍药遗传转化体系已成为当前致力于芍药农艺性状分子机理基础研究和分子遗传改良研究亟待解决的难题。

技术实现思路

1、本发明的技术目的为：提供一种发根农杆菌介导非组培依赖的芍药根系遗传转化种植方法，该方法以芍药的肉质根作为外植体，通过制备液体侵染物和固体侵染物，以及独特的侵染及共培养等步骤，突破了芍药转化难的技术障碍，获得了稳定转化的芍药转基因根系，为后续芍药育种资源和功能基因组学的研究奠定了基础。

2、为实现上述目的，本发明采取了以下技术方案：发根农杆菌介导非组培依赖的芍药根系遗传转化种植方法，包括芍药外植体制备的步骤、侵染物制备的步骤、侵染及共培养的步骤、新生根系诱导培养的步骤、转基因根检测的步骤和复合型转基因芍药株系获得的步骤，在芍药外植体制备的步骤中，选用4-5年生具有萌蘖能力的芍药作为受体材料植株，并切取其肉质根作为芍药外植体；

3、在侵染物制备的步骤中，需选用携带有标记基因的发根农杆菌，扩繁培养至菌液浓度为od600=0.6-1.0，并将该菌液平覆在lb固体培养基上，倒置培养至培养基表面覆盖一层均匀的发根农杆菌，作为固体侵染物；再选用携带有标记基因的发根农杆菌，采用重悬液重悬培养至浓度为od600=0.6-1.0，作为液体侵染物；

4、在侵染及共培养的步骤中，先使用固体侵染物对芍药肉质根的底端进行侵染处理，再利用真空泵进行辅助侵染负压处理，之后种植于基质中，浇注液体侵染物进行共培养。

5、进一步的，所述芍药的品种为珊瑚系列芍药。

6、进一步的，在芍药外植体制备的步骤中，芍药的取材时期为当年的10-11月份，切取的肉质根为1-2年新生肉质根，肉质根切取后需用流水冲洗直至其表面无泥土粘连，再埋入含水量为50-70%的河沙中保存。

7、进一步的，在侵染物制备的步骤中，所述携带有标记基因的发根农杆菌为携带绿色荧光标记基因35s::pcambia 2300-gfp的k599发根农杆菌菌株。

8、进一步的，所述侵染物制备步骤的具体操作为：

9、（1）、激活携带有标记基因的发根农杆菌，28℃培养36-48h，随后扩繁培养至菌液浓度为od600=0.6-1.0；

10、（2）、取部分菌液于4000 rpm条件下离心处理5-8 min，去除上清液，再用重悬液将离心管底部的发根农杆菌重悬培养至浓度为od600=0.6-1.0，作为液体侵染物；

11、（3）、在350 ml容积的玻璃瓶中加入50 ml lb固体培养基，待培养基凝固后，加入0.7-1.0ml od600=0.6-1.0的菌液，拧盖摇匀，使固体培养基表面均匀覆盖一层菌液，倒置培养至固体培养基表面覆盖一层均匀的发根农杆菌后，作为固体侵染物。

12、进一步的，所述侵染及共培养步骤的具体操作为：先对芍药肉质根进行表面冲洗，使其表面无杂质附着，之后，吸干表面水分，使用锋利刀具平切芍药肉质根的底端，保留根段长度为5-15 cm，将根段底端朝下立于固体侵染物中进行侵染处理30-45min，再利用真空泵进行辅助侵染负压处理10-15min，之后种植于营养土和河沙组构成的基质中，并对每个根段浇注25-50ml的液体侵染物进行共培养。

13、进一步的，使用固体侵染物侵染时，需将根段底端平放在固体侵染物上，保证底端切面与发根农杆菌紧密接触。

14、进一步的，所述基质由体积比为（1-3）：1的营养土与河沙构成，营养土由体积比为6:6:5:3的泥炭、椰糠、珍珠岩和碳化稻壳组成；

15、所述的芍药肉质根种植在基质深度为15-20 cm的花盆中，且种植时芍药肉质根在基质深度3-5 cm位置呈平卧摆放。

16、进一步的，所述新生根系诱导培养步骤的具体操作为：将共培养后的芍药肉质根连同基质置于温度为21-27℃，每天光照14 h，光照强度为2000-3000 lx，空气相对湿度为80-90%，土壤含水量为50-60%的环境中进行诱导培养60-90 d，即可得到新生根系。

17、进一步的，所述转基因根检测的步骤中，使用激发光源对芍药肉质根长出的新生根进行绿色荧光蛋白信号激发检测，确定其是否为转基因根；

18、所述复合型转基因芍药株系获得的步骤中，将具有转基因根的植株置于温度为21-27℃，每天光照14 h，光照强度为2000-3000 lx，空气相对湿度为80-90%，土壤含水量为50-60%的环境中进行培养60-90 d，即可得复合型转基因芍药株系。

19、本发明的有益效果：

20、1、本发明的一种发根农杆菌介导非组培依赖的芍药根系遗传转化种植方法，步骤简单，操作方便，方法本身以芍药的肉质根作为外植体，利用发根农杆菌进行遗传转化，通过制备液体侵染物和固体侵染物，以及独特的侵染及共培养等步骤，获得了稳定转化的芍药转基因根系，构建了一种芍药遗传转化的体系，突破了获得芍药转基因材料难的技术瓶颈，打破了当前芍药基因功能研究高度依赖拟南芥、矮牵牛等模式植物的现状，使芍药基因功能研究转向本源生物成为可能，也为后续芍药育种资源和功能基因组学的研究奠定了基础。

21、2、本发明的一种发根农杆菌介导非组培依赖的芍药根系遗传转化种植方法，建立的遗传转化体系无需借助组培过程及无菌环境，大大降低了遗传转化的繁琐操作和严苛条件，避免了芍药组培体系生根率低和移栽成活率低等问题，避免了因材料污染导致的试验误差和失败。

22、3、本发明的一种发根农杆菌介导非组培依赖的芍药根系遗传转化种植方法，通过发根农杆菌侵染物的制备和侵染，适宜基质配方以及培养环境等方面的把控，能够较好地诱导芍药肉质根萌蘖，并获得较多优质的萌蘖芽。采用本发明的方法制备得到的萌蘖植株成活率十分理想，填补了芍药肉质根扦插生芽的技术空白，为后续芍药优良品种的种质资源保护提供了技术支持。

23、4、本发明的一种发根农杆菌介导非组培依赖的芍药根系遗传转化种植方法，首次公开了发根农杆菌介导的芍药遗传转化方法，为可用于育种资源的转基因复合植株和完整转基因植株的获得，以及芍药功能基因组学的研究提供了技术支持，将很大程度上推动芍药品种改良和新品种的培育等方面研究的进程。

24、5、本发明的一种发根农杆菌介导非组培依赖的芍药根系遗传转化种植方法，给出了发根农杆菌侵染芍药肉质根的最佳侵染处理方式。即：使用具有较高菌液浓度的固体侵染物对芍药具有较坚韧细胞结构的肉质根进行侵染，以实现较好的侵染效果。同时，由于侵染是一个长效的过程，固体培养基有利于为发根农杆菌提供良好的生长环境，使其在侵染过程保持较高的生理活性。此外，侵染后的负压处理在真空状态下增加了菌液与外植体的接触面积，使其能够更好的渗透到植物组织内部，进而提升浸染效果。因此，本技术选择采用固体侵染物侵染外植体，同时负压真空辅助侵染，覆土种植后浇注含有发根农杆菌的液体侵染物共培养是最佳的侵染处理，可以有效提高发根农杆菌的侵染效率，获得更多的转基因根。