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Advances in regulation and function of the bacterial type Ⅵ secretion system

花匠小妙招
2024-11-13 03:44

摘要: Ⅵ型分泌系统(Type Ⅵ Secretion System，T6SS)是近年来研究较多的一种细菌分泌系统，广泛存在于革兰氏阴性菌中，在细菌的毒力、定殖、扩散及竞争遗传中发挥着重要的作用。本文综述了细菌T6SS的结构、调控以及生物学功能的最新研究进展，以期为基于T6SS的抗菌药物研制及细菌感染的诊断与防控提供新思路。

Abstract: Type Ⅵ secretion system (T6SS) that widely exists in Gram-negative bacteria has been extensive studied in recent years. It plays important roles in the virulence, colonization, spread and competition inheritance of bacteria. This paper reviews the latest research progresses in the structure, regulation and biological function of T6SS. Hopefully, the review could inspire the development of antibacterial drugs based on T6SS and provide new thoughts for the diagnosis and control of bacterial infections.

2006年，T6SS在铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和霍乱弧菌(Vibrio cholerae)中首次发现，并被鉴定为一个与细菌致病性相关的新型细菌分泌系统[1-2]。后来研究者逐渐发现T6SS存在于多种革兰氏阴性菌中，如：肠集聚性大肠埃希菌(Enteroaggregative Escherichia coli，EAEC)、类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei)等[3]。最初T6SS被认为是专门针对真核宿主细胞的毒力因子分泌系统，会促进细菌的感染。最近的研究表明，T6SS还可以调节细菌之间的相互作用和竞争遗传，有利于细菌在宿主细胞内的定殖和扩散[4]。T6SS这些作用的发挥与其表达调控密切相关。本文将主要综述T6SS的表达调控和生物学功能的最新研究进展。

1 T6SS的结构

T6SS是一种由15-25个基因编码的多分子复合物，以倒置的T4噬菌体样结构嵌于细胞膜上[5]。一般可将T6SS结构分为3个部分：噬菌体样结构、膜复合物和基板复合物(图 1)。

图 1　T6SS的结构示意图Figure 1　Schematic structure of the T6SSNote: OM: Outer membrane; IM: Inner membrane

噬菌体样结构包括溶血素调节蛋白(Hemolysin Coregulated Protein，Hcp)、缬氨酸-甘氨酸重复蛋白G (Valine-Glycine Repeat Protein G，VgrG)和六型B亚基(Type Six Subunit B，TssB)/TssC复合物；Hcp是一个内径为4 nm的六边形环，与λ噬菌体的尾部蛋白gpV相似，可折叠成管状结构，定位于VgrG三聚体的下面；VgrG与T4噬菌体的针尖状结构gp27/gp5复合物相似，能刺穿细菌细胞膜。VgrG三聚体的上面还有一个锥形Proline-Alanine-Alanine- Arginine (PAAR)蛋白复合物；另外2个亚基TssB和TssC也能形成管状结构，其约10 nm的内径能容纳外径约9 nm的Hcp管，TssB/TssC复合物最终会形成一个包围Hcp管的鞘状结构，类似于T4噬菌体的尾鞘结构[5]。

在EAEC T6SS的研究中，发现其膜复合物由TssM、TssL、TagL和TssJ等4种蛋白组成[4]。TagL的一部分位于细菌细胞外，使T6SS锚定到靶细胞的细胞壁上；另一部分插入细菌细胞内膜，与内膜蛋白TssL结合，TssL又与内膜蛋白TssM结合，形成TssM/TssL复合物[6]。TssJ是一种脂蛋白，固定在细菌细胞外膜上，与TssM形成复合物。TssL-TssM-TssJ复合物结合成环状结构，形成一个跨膜通道通过酵母双杂交实验发现TssM与TssB有相互作用，Hcp与TssM/TssL复合物有免疫共沉淀，这些结果表明，包围Hcp管的鞘状结构嵌入到TssL-TssM-TssJ复合物形成的跨膜结构中[7]。

基板复合物主要由TssK、TssF、TssG和TssE组成；TssG作为一个连接器，与2个TssK三聚体和2个TssF前体相互作用，再加上TssE形成基板复合物；TssF和TssG相互作用，与TssK、TssE、VgrG以及T6SS的鞘状结构相接触[8]。TssK是一种胞质蛋白，其C端与膜复合物的TssL和TssM同时结合，N端与TssF相互结合[9]。

2 T6SS的调控

T6SS的组装、收缩、拆卸和再组装过程对细菌细胞的能量消耗很高，因此T6SS的表达和组装受到严格的调控。对不同细菌的T6SS研究发现，转录调控是最常见的。一些转录调节因子(Transcriptional Regulators，TRs)直接调控T6SS基因，将RNA聚合酶(RNA Polymerase，RNAP)招募到T6SS基因的启动子区域，诱导其表达；另外一些TRs则将环境信号，比如群体感应、铁消耗、温度、pH、含盐量或其他外界压力等传递给细菌，诱导T6SS基因转录表达。

2.1 组装过程

近年来，根据荧光显微等实验的观察结果，研究者总结出了T6SS的组装过程。首先，TssM、TssL、TssJ形成的膜复合物和TssK、TssF、TssG、TssE形成的基板复合物使T6SS固定在细菌细胞膜上；其次，VgrG及效应蛋白被招募到基板复合物中；然后Hcp从VgrG开始聚合成管状结构，同时TssB和TssC聚合形成包裹Hcp管的鞘状结构；当T6SS被激活时，与靶细胞接触，TssB/TssC复合物收缩推动Hcp管，顶端的VgrG刺穿靶细胞细胞膜，释放多种效应蛋白[10-11]。收缩状态下的TssC暴露了N端的ClpV识别区域，ClpV与其结合，利用ATP水解的能量对TssB/TssC复合物进行解聚、回收，Hcp管也被解聚、回收，为下次组装激活做准备[12-13]。

2.2 表达调控

2.2.1 群体感应调控

群体感应(Quorum Sensing，QS)是一种细菌之间的沟通方式，通过特定的信号分子进行交流。这种特定信号分子的浓度与所处环境中细菌数量的变化呈正相关，当信号浓度达到一定值时，即细菌数量也处于较高水平，此时细菌会诱导相关基因的表达来适应环境的变化。病原菌在感染宿主的过程中，需要达到一定数量时，信号分子浓度才能达到诱导感染宿主重要基因表达的水平，成功完成感染[14]。

QS可以协调T6SS的活性，即在低细胞密度时抑制T6SS激活，在高细胞密度时促进T6SS激活。在V. cholerae中，QS相关的基因通过连续的磷酸化进行调控，其中涉及4种组氨酸激酶CqsS、LuxPQ、CqsR和VpsS；在低细胞密度时，这4种组氨酸激酶使磷酸转移蛋白LuxU磷酸化，进而使蛋白LuxO磷酸化，磷酸化的LuxO又激活4种称为Qrr1–4的小RNA的转录，这种小RNA可以和转录T6SS的mRNA结合，从而抑制T6SS的转录；而在高细胞密度时，LuxO未被磷酸化，Qrr1–4的转录也未被激活，所以T6SS的转录翻译正常进行[15]。

2.2.2 金属离子调控

金属离子在各项生理活动中扮演着不可缺少的角色，例如铜、锌、铁等微量元素，不仅是人体发育所必需的，也是病原菌增殖过程中必不可少的[16]。在病原菌与宿主的互作过程中，宿主的免疫系统会影响细菌对金属离子的摄取，同时会产生一定浓度的金属离子攻击细菌，抑制病原菌的生存及增殖，而病原菌为了对抗宿主，也通过自身的调控系统做出一系列反应[17]。

铁吸收调节蛋白(Ferric Uptake Regulator，Fur)是一种细菌体内调控铁离子摄取的转录调控因子。在铁离子存在时，Fur与启动子区域内一个称为Fur盒的序列相互作用，从而抑制转录过程[18]。在EAEC和迟钝爱德华菌(Edwardsiella tarda)这2种肠道条件致病菌中，T6SS的转录被Fur抑制；E. tarda毒力蛋白包括T6SS由E. tarda Virulence Proteins (Evp)基因簇编码，同时也受Fur调节；Fur和Evp簇的第一个基因EvpP上游的Fur盒序列结合，使Evp基因簇不能表达，从而抑制T6SS转录。EAEC的T6SS基因簇上游的一个Fur盒与一个DNA腺嘌呤甲基转移酶(DNA Adenine Methyltransferase，Dam)甲基化位点重合，阻止甲基化酶进入该位点；在缺铁的宿主细胞中，Fur的抑制作用会减弱，Fur与Dam甲基化位点解离，使RNA聚合酶结合并启动转录，同时，也会导致位点的甲基化，抑制Fur的再结合；所以，低浓度的胞质Fe(Ⅱ)可以稳定地表达T6SS[7]。在鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)的感染过程中，Fur与T6SS的clpV基因的启动子区域直接结合，从而抑制clpV的表达；而在缺铁条件下，Fur对clpV的抑制作用减弱，clpV的表达显著上调，促进了S. typhimurium的致病力[19]。Zn2+也参与了细菌的许多生物反应过程；B. pseudomallei的T6SS-2的启动子区域包含一个Zur盒，是与Zn2+招募利用相关的基因上游的一个调控序列；当细胞内Zn2+过量时，Zn2+结合蛋白Zur与Zur盒子结合，抑制T6SS-2转录；而当胞内Zn2+下降时，Zur与Zur盒子不再结合，即T6SS-2的转录也不被抑制[20]。

2.2.3 氧化应激调控

当细菌侵入宿主，宿主细胞会产生一系列免疫反应进行对抗。吞噬细胞会被招募到感染部位，对细菌进行吞噬，然后宿主的NOX2 (Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate Oxidase，NADPH Oxidase)复合物被激活，在吞噬体中产生超氧化物和过氧化氢(Hydrogen Peroxide，H2O2)[21]。同时，一氧化氮合成酶(Nitric Oxide Synthase，iNOS)也被激活，产生的一氧化氮(Nitric Oxide，NO)与吞噬体中的超氧化物反应形成过氧硝酸盐(Peroxynitrite，ONOO-)、二氧化氮(Nitrogen Dioxide，NO2)和其他有毒的活性氮(Reactive Nitrogen Species，RNS)[22]。然而宿主细胞产生的这些氧化物会破坏细菌的DNA和蛋白质等，不利于细菌的繁殖；细菌在氧化胁迫下，已经进化出各种机制来应对宿主的免疫反应，其中就包括合成某些具有抗氧化作用的蛋白，从而保护自身免受宿主的氧化攻击[23]。

研究表明，在氧化应激的条件下，假结核耶尔森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)的T6SS-4被诱导表达，而且受氧化应激调节因子OxyR的调控。T6SS-4的突变导致Y. pseudotuberculosis胞内活性氧的累积，而且对H2O2介导的杀伤作用更加敏感，这说明T6SS-4有助于细菌的抗氧化应激[24]。在泰国伯克霍尔德氏菌(Burkholderia thailandensis)的OxyR突变株中，T6SS-2表达增加且对氧化应激的抵抗力也增强；用氧化剂Cumene Hydroperoxide (CPH)处理B. thailandensis，T6SS-2表达未被抑制，这说明在氧化应激的条件下，T6SS-2是被激活的；T6SS-2的启动子区域包含了OxyR的结合位点，OxyR在氧化应激过程中发生构象变化，不能在结合位点结合，这说明T6SS-2受OxyR的负调控[20]。B. pseudomallei的毒力依赖于T6SS的表达，在感染宿主的过程中，通过组氨酸激酶感受器VirA感知宿主细胞产生的氧化物，从而激活T6SS[25]。

2.2.4 苏氨酸磷酸化途径调控

当P. aeruginosa在固体培养基上培养时，其中某些P. aeruginosa会自发地激活其T6SS，然后去攻击邻近的P. aeruginosa，被攻击的P. aeruginosa则会激活自身的T6SS，并发起反击，而最初的攻击者会感知到反击，又会进行报复；由于P. aeruginosa对自身T6SS的效应蛋白有免疫性，所以这种相互攻击不是致命的，反而会稳定地持续几分钟，但对异种细菌却是致命的，同时这种杀伤性在有T6SS的前提下才会存在[26]。在V. cholerae和P. aeruginosa共同培养的条件下，T6SS+ (野生株)的V. cholerae会被杀死，而T6SS– (敲除株)的V. cholerae却不会[27]。在T6SS+和T6SS–的B. thailandensis中也有类似的现象[28]。这种现象在P. aeruginosa中称为“T6SS Dueling”。

P. aeruginosa中的“T6SS Dueling”由苏氨酸磷酸化途径调控。P. aeruginosa的T6SS激活是通过一种110 kD的苏氨酸激酶跨膜蛋白——绿脓杆菌蛋白激酶(P. aeruginosa Protein Kinase，PpkA)磷酸化含有叉头样结构域的蛋白Fha (Forkhead-Associated Domain-Containing)来实现的，而PpkA的自磷酸化激活又需要外膜相关蛋白TagR (Type Six Secretion-Associated Gene R)[29]。TagR对信号的感知导致PpkA的二聚化和自磷酸化，随后是Fha的磷酸化，活化的Fha促进T6SS的组装[30]。另外3种辅助蛋白(TagQ、TagS和TagT)作用于PpkA的上游，TagS和TagT形成一个复合物，其缺失能抑制T6SS的激活，而脂蛋白TagQ的缺失表现出T6SS活性水平的升高[26-27, 31]。

3 T6SS的生物学功能

T6SS最初被认为是一种细菌对真核宿主细胞的毒力机制，以接触依赖的方式将效应蛋白传递到细菌和真核靶细胞中。随后的研究表明，T6SS还参与了多种细菌的相互作用和竞争遗传，通过将毒力蛋白传递到邻近细胞导致细胞生长抑制和死亡(图 2)。

图 2　T6SS的调控和生物学功能总结图Figure 2　Regulation and biological function of the T6SS

3.1 毒力作用

T6SS有2种毒素传递机制。第一种是VgrG作为效应蛋白直接进入靶细胞中，VgrG蛋白具有双重功能，既是T6SS结构的重要组成部分，又是T6SS组装的直接效应器；第二种是小分子的毒力蛋白，其编码基因与编码T6SS的基因簇没有直接联系，这些毒力蛋白通过Hcp管传递到靶细胞中[32]。

最近的研究表明，P. aeruginosa的T6SS效应分子VgrG2b会导致细胞膜空泡化，干扰细胞分裂，从而抑制细胞生长，这表明T6SS传递一种周质毒素，破坏细菌细胞形态[31]。T6SS-1对B. pseudomallei的毒力至关重要。B. pseudomallei感染靶细胞后，T6SS-1会促进细胞融合，导致多核巨细胞(Multinucleated Giant Cells，MNGCs)的形成，最终导致细胞死亡[33]。

3.2 抗菌作用

在多种细菌的竞争环境中，T6SS发挥着重要作用。哺乳动物的胃肠道里有多种微生物群落定殖，细菌在胃肠道中争夺生态位和资源。对于一些肠道病原菌，如S. typhimurium以T6SS依赖的方式杀死共生细菌，从而在宿主肠道定殖[34]。志贺菌(Shigella)中有致病性的是福氏志贺菌(Shigella flexneri)和宋内志贺菌(Shigella sonnei)，其中，S. sonnei编码的一种T6SS在肠道中提供了竞争优势；在体外培养中，S. sonnei相对于大肠杆菌(Escherichia coli)和S. flexneri有竞争优势，但在T6SS突变株中这一优势减弱；在小鼠体内，S. sonnei以T6SS依赖性的方式持续存在并导致E. coli和S. flexneri死亡[35]。假单胞菌(Pseudomonas protegens)的T6SS也有相似的作用，P. protegens利用T6SS入侵昆虫肠道，其肠道微生物群发生显著变化，对肠道共生菌的优势菌群肠杆菌的影响尤为显著；P. protegens利用T6SS破坏共生菌群，进而在宿主体内定殖[36]。

此外，恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的T6SS可作为抗植物病原菌的植物保护剂；当P. putida和野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)共感染烟草叶时，叶片的坏死明显减少，这种保护作用依赖于P. putida的T6SS，说明P. putida的T6SS能除去其他植物病原菌，有助于提高P. putida对抗竞争能力[37]。

3.3 其他功能

T6SS也被认为是遗传多样性的驱动者，在细菌间竞争中，其可以使活下来的细菌获得死亡细菌的遗传物质，这种机制称为基因的水平转移。V. cholerae可利用其T6SS “刺穿”与其邻近的其他细菌，并导致这些细菌死亡，释放出遗传物质，随后V. cholerae吸收这些遗传物质，使得V. cholerae获得如耐药性等其他功能[5, 38]。

4 小结

在很多革兰氏阴性细菌中，T6SS是一个主要的毒力系统，发挥着重要作用。目前在T6SS结构、调控和生物学功能等方面有较多研究，但对T6SS的认识尚不完全。在结构方面，还需加强对T6SS基板复合物部分的研究，完整地了解T6SS的结构有利于对其生物学功能的理解；在调控方面，温度、pH和含盐度等对T6SS的具体调控机制，以及将毒力蛋白分泌到宿主细胞内的分泌途径需要进一步探讨，这有助于揭示病原体的致病机理；在生物学功能方面，T6SS不仅有毒力作用，也参与细菌间的相互作用，并具有抗菌活性，其详细的作用机制也还有待研究，这可能为发展新的抗菌治疗策略提供新的靶点。

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