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一种枯草芽胞杆菌基因组无痕编辑载体及其构建方法和应用

花匠小妙招
2024-11-13 05:25

本发明属于基因编辑，具体涉及一种枯草芽胞杆菌基因组无痕编辑载体及其构建方法和应用。

背景技术：

1、枯草芽胞杆菌(bacillus subtilis)是一种革兰氏阳性细菌，因其具有生产抗微生物化合物、刺激植物防御反应和与植物病原体竞争资源的优势，成为生防制剂的重要研究对象。然而，要充分发挥枯草芽胞杆菌作为生物防控剂的潜力以及深入研究其作用的分子机制，高效的基因修饰和精确的基因组编辑至关重要。现有方法中，基于整合抗性基因至基因组作为选择标记的方式最为常用。然而，由于抗性基因的可用性有限以及可能会影响细胞的生理功能，很难在同一染色体上进行多位点的迭代编辑。

2、虽然crispr-cas9系统被认为是一种强大的基因组编辑技术，但其效率取决于多个因素，包括cas9蛋白活性、递送方法、靶位点选择、需要已知基因组序列进行有效的短导rna设计以及构建载体步骤繁琐和周期长等问题。因此，这种技术对于具有未知遗传背景的菌株可能不完全适用，且基于核酸酶的基因编辑技术存在一个严重的缺陷，即“脱把效应”，显著降低了基因编辑的特异性和准确性。而基于毒性元件的反筛系统，应用广泛的是利用如甘露醛-6-磷酸异构酶基因(mamp)、尿嘧啶磷酸核糖基转移酶基因(upp)等毒性蛋白作为反筛标记，但这些方法需要构建毒性蛋白编码基因的缺失突变体菌株，且靶位点留下的重复序列会影响多重突变菌株的稳定性，使得操作上更加繁琐和不稳定。最近，有研究利用毒素蛋白mazf和毒素-抗毒素蛋白rele/relb作为反筛标记物，对枯草芽胞杆菌基因组进行无痕编辑。但由于枯草芽胞杆菌的抗毒能力强、诱导性启动子表达泄露以及不同菌株对毒素蛋白敏感性不同的问题，导致已有的无痕编辑技术在枯草芽胞杆菌中的特异性不强和系统不稳定。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一种枯草芽胞杆菌基因组无痕编辑载体，具有编辑效率高、编辑结果稳定的特点。

2、本发明提供了一种枯草芽胞杆菌基因组无痕编辑空载体，为在基因编辑载体中包括以下串联的基因元件：用于大肠杆菌质粒复制的复制子、大肠杆菌-枯草芽胞杆菌通用抗性基因、用于枯草芽胞杆菌质粒复制的温度敏感型复制子和筛选指示基因。

3、优选的，所述筛选指示基因包括组成型启动子和筛选指示编码基因；

4、优选的，所述组成型启动子包括pconst启动子；所述pconst启动子的核苷酸序列如seq id no:1所示；

5、优选的，所述筛选指示编码基因包括荧光蛋白基因和lacz基因；

6、进一步优选的，所述荧光蛋白基因包括以下至少一种：红色荧光蛋白编码基因、绿色荧光蛋白编码基因或黄色荧光蛋白编码基因；

7、更进一步优选的，所述lacz基因的核苷酸序列如seq id no:2所示；

8、更进一步优选的，所述红色荧光蛋白编码基因mcherry的核苷酸序列如seq idno:3所示。

9、优选的，所述用于大肠杆菌质粒复制的复制子包括pmb1复制子；

10、所述pmb1复制子的核苷酸序列如seq id no:4所示。

11、优选的，所述大肠杆菌-枯草芽胞杆菌通用抗性基因包括卡那霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、四环素抗性基因和盐酸博来霉素抗性基因；

12、优选的，卡那霉素抗性基因的核苷酸序列如seq id no:5所示。

13、优选的，所述用于枯草芽胞杆菌质粒复制的温度敏感型复制子包括repf；

14、优选的，所述repf的核苷酸序列如seq id no:6所示。

15、本发明提供了一种枯草芽胞杆菌基因组无痕编辑载体，在所述枯草芽胞杆菌基因组无痕编辑空载体中包括待敲除的靶基因的上游同源臂和下游同源臂。

16、优选的，所述靶基因包括环二鸟苷酸降解酶编码基因pdeh；

17、所述环二鸟苷酸降解酶编码基因pdeh的上游同源臂的核苷酸序列如seq id no:7所示；

18、所述环二鸟苷酸降解酶编码基因pdeh的下游同源臂的核苷酸序列如seq id no:8所示。

19、本发明提供了所述枯草芽胞杆菌基因组无痕编辑载体的构建方法，包括以下步骤：

20、将质粒pjoe8999用bamh i/affi限制性内切酶进行酶切，回收骨架载体片段；

21、将筛选指示基因的dna片段克隆至骨架载体片段中，得到枯草芽胞杆菌基因组无痕编辑空载体；

22、将待敲除的靶基因的上游同源臂和下游同源臂克隆至所述枯草芽胞杆菌基因组无痕编辑空载体中，得到枯草芽胞杆菌基因组无痕编辑载体。

23、本发明提供了所述枯草芽胞杆菌基因组无痕编辑空载体、所述无痕编辑载体或所述构建方法制备的枯草芽胞杆菌基因组无痕编辑载体在枯草芽胞杆菌基因功能研究中的应用。

24、本发明提供了所述枯草芽胞杆菌基因组无痕编辑空载体、所述无痕编辑载体或所述构建方法制备的枯草芽胞杆菌基因组无痕编辑载体在枯草芽胞杆菌基因编辑研究中的应用。

25、本发明提供了一种枯草芽胞杆菌基因组无痕编辑空载体，为在基因编辑载体中包括以下串联的基因元件：用于大肠杆菌质粒复制的复制子、大肠杆菌-枯草芽胞杆菌通用抗性基因、用于芽孢杆菌质粒复制的温度敏感型复制子和筛选指示基因。本发明利用用于芽孢杆菌质粒复制的复制子作为反筛标志物，同时以筛选指示基因作为筛选指示，建立一种高效、稳定的枯草芽胞杆菌基因组无痕编辑的空载体。本发明提供的枯草芽胞杆菌基因组无痕编辑空载体能够实现100％的反筛效率。

26、本发明提供了一种枯草芽胞杆菌基因组无痕编辑载体，在所述枯草芽胞杆菌基因组无痕编辑空载体中包括待敲除的靶基因的上游同源臂和下游同源臂。本发明将所述无痕编辑载体中插入环二鸟苷酸降解酶编码基因pdeh的上游同源臂和下游同源臂进行枯草芽胞杆菌的无痕遗传操作，结果表明pdeh无痕敲除的突变效率为100％。可见，本发明提供枯草芽胞杆菌基因组无痕编辑载体在实现枯草芽胞杆菌基因组的基因编辑的基础上，不残留基因编辑元件，同时基因编辑在基因组中完成，保证了基因编辑的稳定性。

技术特征：

1.一种枯草芽胞杆菌基因组无痕编辑空载体，其特征在于，是在基因编辑载体中包括以下串联的基因元件：用于大肠杆菌质粒复制的复制子、大肠杆菌-枯草芽胞杆菌通用抗性基因、用于枯草芽胞杆菌质粒复制的温度敏感型复制子和筛选指示基因。

2.根据权利要求1所述枯草芽胞杆菌基因组无痕编辑空载体，其特征在于，所述筛选指示基因包括组成型启动子和筛选指示编码基因；

3.根据权利要求1所述枯草芽胞杆菌基因组无痕编辑空载体，其特征在于，所述用于大肠杆菌质粒复制的复制子包括pmb1复制子；

4.根据权利要求1所述枯草芽胞杆菌基因组无痕编辑空载体，其特征在于，所述大肠杆菌-枯草芽胞杆菌通用抗性基因包括以下至少一种：卡那霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、四环素抗性基因和盐酸博来霉素抗性基因；

5.根据权利要求1～4中任意一项所述枯草芽胞杆菌基因组无痕编辑空载体，其特征在于，所述用于枯草芽胞杆菌质粒复制的温度敏感型复制子包括repf、pub110、pe194等；

6.一种枯草芽胞杆菌基因组无痕编辑载体，其特征在于，在权利要求1～5中任意一项所述枯草芽胞杆菌基因组无痕编辑空载体中包括待敲除的靶基因的上游同源臂和下游同源臂。

7.根据权利要求6所述枯草芽胞杆菌基因组无痕编辑载体，其特征在于，所述靶基因包括环二鸟苷酸降解酶编码基因pdeh；

8.权利要求6或7所述枯草芽胞杆菌基因组无痕编辑载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

9.权利要求1～5中任意一项所述枯草芽胞杆菌基因组无痕编辑空载体、权利要求6或7所述无痕编辑载体或权利要求8所述构建方法制备的枯草芽胞杆菌基因组无痕编辑载体在枯草芽胞杆菌基因功能研究中的应用。

10.权利要求1～5中任意一项所述枯草芽胞杆菌基因组无痕编辑空载体、权利要求6或7所述无痕编辑载体或权利要求8所述构建方法制备的枯草芽胞杆菌基因组无痕编辑载体在枯草芽胞杆菌基因编辑研究中的应用。

技术总结
本发明提供了一种枯草芽胞杆菌基因组无痕编辑载体及其构建方法和应用，属于基因编辑技术领域。本发明提供了一种枯草芽胞杆菌基因组无痕编辑载体，包含用于大肠杆菌质粒复制的复制子、大肠杆菌‑枯草芽胞杆菌通用抗性基因、用于枯草芽胞杆菌质粒复制的温度敏感型复制子和筛选指示基因形成的串联元件，以及靶基因上游同源臂和下游同源臂序列。实验表明，所述基因组无痕编辑载体可以实现基因的无痕敲除、插入、替换等操作，反筛效率和基因编辑效率可达100％，具有简便、快捷和高效的特征。

技术研发人员：李燕,赵羽,王琦,王震铄
受保护的技术使用者：中国农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/10/21