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Food Chemistry | 不同加工方式对栀子花品质的影响

花匠小妙招
2024-11-16 15:02

栀子花及其亚种在不同干燥过程中香气和醇溶性成分的鉴定、定量及生物活性分析

期刊：Food Chemistry

IF：8.8

发表时间：2023年3月

单位：浙江农林大学

2023年3月，浙江农林大学张新凤老师团队于“Food Chemistry”在线发表了题目为“Identification, quantitative and bioactivity analyses of aroma and alcohol-soluble components in flowers of and its variety during different drying processes”的研究论文。本研究通过对两种栀子花GJE和GJM的不同部位(全花、花瓣、雄蕊)和不同干燥处理(冻干、焯水和干燥)样本中的醇溶性成分进行检测分析，采用气相色谱-质谱法对栀子花的香气成分进行了分析；利用高效液相色谱法测定栀子花中环烯醚萜类、黄酮类和酚类，并结合醇溶性成分的差异和变化，采用主成分分析法筛选样品中的指示化学成分并进一步对样品进行抗氧化和降糖活性分析。明确了GJE和GJM的质量评价指标；阐明栀子花去雄蕊的必要性和加工方法的科学性，为栀子花的食用加工方法提供理论依据。迈维代谢提供了广泛靶向代谢组检测服务。

研究背景

栀子花是一种具有药用和食用价值的重要观赏植物，作为栀子属的非药用部分，研究和利用还没有果实那么全面，其质量指标也不是很明确。本研究重点探讨两种栀子花是否具有相同的香气成分和生物活性成分。

技术路线

样本：GJE 和GJM；不同部位：全花、花瓣和雄蕊；三种处理：冻干（FD）、焯水干燥（BD）和热风干燥（HD）。

技术路线

研究结果

1.栀子花芳香物质的检测及分析

为了确定两种栀子花中香气成分组成和含量的差异，采用精油蒸汽蒸馏法和HS-SPME吸附法提取香气成分，采用GC-MS分析香气成分。从栀子花中共鉴定出56种挥发性化合物，主要为萜烯类、酯类和少量其他物质。如芳樟醇、辛烯、α-法尼烯、月桂烯、α-松油醇等24种萜类化合物；顺-3-己烯基2-甲基丁酸酯、顺-3-己烯基丁酸酯、己烯基丁酸酯、2-甲基丁酸己酯等24种酯类化合物。

作者以香叶醇为内标，采用HS-SPME吸附法结合GC-MS法测定了GJE和GJM花各部位（全花、花瓣、雄蕊及雌蕊）香气成分的含量。也检测了GJE和GJM精油中物质含量，其中GJE和GJM中萜类含量分别为1106.67±55.86 μg.g 和414.41±21.26 μg.g ，酯类含量分别为224.74±10.61 μg.g 和759.14±40.18 μg.g 。从组成上看，精油中具有较高沸点的组分α-松油醇、神经醇和愈创木酚、α-二醇、T -二醇、(Z, Z)-3-己烯基-2-甲基-2-丁酸酯、(Z)-7-十二-5-油内酯、顺式-3-己烯基苯甲酸酯等比HS-SPME吸附的样品更丰富。

从挥发性化合物的雷达分布图可以看出(图2)，萜类化合物主要存在于GJE中，尤其是雄蕊和雌蕊，而酯类化合物主要存在于GJM中，其中花瓣中的酯类含量明显高于植株其他部位。GJE和GJM的香气成分以萜类和酯类为主，但其挥发性成分在花各部位的分布因品种而异。

图1 栀子花挥发物雷达图

2.总酚酸、总黄酮、抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶活性检测

整个花的总酚酸（TPC）和总黄酮（TFC）各不相同(图3A和3B)。栀子花GJE的全花、花瓣、雄蕊和雌蕊中的TPC分别为37.13 mg GAE/g DW、33.47 mg GAE/g DW和41.53 mg GAE/g DW，TFC分别为29.09 mg RE/g DW、3.79 mg RE/g DW和28.74 mg RE/g DW。GJE和GJM花的不同部分中TPC和TFC分布是一致的。雄蕊和雌蕊的TPC和TFC含量均显著高于花瓣，说明花中的黄酮类化合物和酚类化合物更集中于雄蕊和雌蕊。

BD和HD干燥处理的样品中酚类物质和黄酮类物质的损失与FD干燥的全花有所不同。GJE在BD处理后的TPC和TFC分别上升至42.16 mg GAE/g DW和51.47 mg RE/g DW，如图3A和3B所示，而HD处理的TPC和TFC分别下降至32.13 mg GAE/g DW和10.54 mg RE/g DW；GJM在BD处理后全花的TPC和TFC分别为38.68 mg GAE/g DW和32.59 mg RE/g DW。BD处理样品的TPC含量略有下降，但TFC显著下降(9.08 mg RE/g DW)。BD处理的花是保存它们的较好方法，一般情况下，栀子焯水后放入冷冻室保存，能很好地保存原有的总酚类和总黄酮。

通过测定栀子花对ABTS•+和DPPH•的清除能力来测定其抗氧化生物活性（3C和D）。两个品种花的雄蕊和雌蕊提取物对自由基的清除能力均显著强于花瓣提取物。因此，栀子花提取物中清除自由基的主要成分主要存在于雄蕊和雌蕊中，通过相关分析，发现两种栀子的抗氧化能力与总酚和总黄酮的浓度呈正相关。不同干燥样品的自由基清除能力大小顺序为BD、FD、HD，这与TPC、TFC的结果一致。以冻干全花为例，两种清除自由基的能力GJE略优于GJM。BD后的样品在TPC、TFC和自由基清除能力方面表现良好。

两种栀子提取物均表现出一定抑制α-葡萄糖苷酶活性的潜力(图3E)。GJE全花和花瓣对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用显著高于GJM，且两种花的花瓣对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用均优于雄蕊。FD处理对α-葡萄糖苷酶的抑制效果最好，HD次之，BD处理后效果最差。在BD和HD干燥后，GJM对α-葡萄糖苷酶的抑制作用强于FD。总体而言，GJE对α-葡萄糖苷酶的抑制能力强于GJM。进一步对样品乙醇提取物中TPC、TFC与ABTS、DPPH、α-葡萄糖苷酶活性半抑制率进行相关性分析。TPC和TFC与ABTS和DPPH自由基半抑制率呈负相关。花部位和干燥样品中TFC和TPC含量越高，抗氧化活性越强，IC50值越低，说明其在栀子花中发挥了重要的自由基清除作用。其中TFC对抗氧化活性有显著贡献，栀子花雄蕊和雌蕊中含有高浓度的黄酮类和酚类物质，具有很强的抗氧化能力。TPC与α-葡萄糖苷酶半抑制率呈负相关，说明栀子花中某些酚类化合物具有较好的降糖作用。

图2栀子花乙醇提取物的TPC、TFC及活性研究

3.HPLC指纹图谱

栀子花中含有环烯醚萜、类黄酮和酚类成分。为了实现样品HPLC色谱峰间更好的分离和更高的检测灵敏度，对流动相和检测波长的选择进行调试至关重要。在之前的实验中，一是发现乙腈作为流动相可以满足分离要求，所以确定乙腈作为流动相A。二是选择0.2%的乙酸作为B相，因为低浓度的有机酸可以保留酸性有机物，减少色谱峰的阻力。所有色谱峰均在60 min内解析，峰间分辨率一致。DAD检测器能有效扫描各峰的全波长光谱，有利于确定最佳检测波长。对比238 nm(图4A)和330 nm(图4B)两种色谱，后者缺少一些保留时间在15 min之前的峰，前者可以检测到更多的物质。因此，选择238 nm作为主要检测波长。对各色谱峰的紫外特征吸收光谱进行分析，发现栀子花的主要成分为环烯醚萜、黄酮类化合物和酚类化合物。三种成分的紫外吸收特性不同。如环烯醚萜类化合物在238 nm处有最大吸收峰，黄酮类化合物在200-400 nm处有两个主要紫外吸收带，多酚类化合物在240 nm和325 nm处有两个强吸收峰。因此，考虑到300 nm以上对环烯醚萜类化合物没有吸收，三种成分共有的强吸收峰在238 nm左右，最终选择该波长作为栀子花的检测波长进行HPLC分析。

使用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A)”软件进行处理和分析以获得栀子花样品的指纹图谱。色谱峰主要在60 min内出现，可分离检测到60多个色谱峰，共有18个峰组分(图4C)。紫外光谱分析表明(图4D)，环烯醚萜类化合物峰有1、2、3、4和8，黄酮类化合物的峰有9、10、11、13和14，酚类化合物峰有5、6、7、12、15、16、17和18，其最大吸收峰为217、240、297和325 nm。

图 3 HPLC色谱图

4.特征峰的定性和定量

根据UPLC-ESI-MS/MS色谱条件，对样品的75%乙醇提取物进行分离，收集各分离峰的质谱信息，得到混合样品的总离子色谱图。MRM模式下代谢物的多峰检测图显示了样品中检测到的物质。单峰定性鉴定主要基于紫外光谱法、质谱法、质谱数据、离子信息结合现有标准品、参考文献和文献数据，推测9个目标峰的化学结构（图5）。确定峰5、6、15、16、17分别为绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C；峰3和8为羟异栀子苷和栀子苷；峰13和14分别为芦丁和花旗松素。上述结果表明，栀子花中含有丰富的酚类、环烯醚萜和黄酮类物质，花旗松素在栀子花中首次被检测到。

以鉴定出的化合物为标准品，通过检出限(LOD)、精密度、重复性、稳定性和回收率试验对定量分析方法进行验证，建立了9个目标化合物的标度曲线，选取最优的定量测定条件，LOD范围为0.09 ~ 0.17 μg/mL。精密度、重复性和稳定性的RSD分别为0.3 ~ 2.1%、0.25 ~ 3.31%和0.9 ~ 3.12%，加样回收率为97.88% ~ 106.06%，RSD为1.01% ~ 2.16%。

根据所鉴定化合物的含量，羟异栀子苷和栀子苷两种环烯醚萜类成分在栀子花中的分布明显高于其他化合物。羟异栀子苷在GJE的雄蕊和雌蕊中的含量分别为15.62 mg/g和17.28 mg/g，均高于花瓣中的含量。而栀子苷在GJE花瓣中的含量为7.32 mg/g，在GJM中的含量为11.61 mg/g，均略高于雄蕊和雌蕊，说明两种环烯醚萜在花的不同部位均有积累；绿原酸(0.21 ~ 0.26 mg/g)、隐绿原酸(0.03 ~ 0.05 mg/g)、异绿原酸B (0.04 ~ 0.05 mg/g)、异绿原酸C (0.04 ~ 0.05 mg/g)和异绿原酸A (0.03 ~ 0.17 mg/g)主要存在于雄蕊和雌蕊中。花瓣中未检出绿原酸、隐绿原酸、芦丁、异绿原酸B、异绿原酸A和异绿原酸C。这也解释了为什么栀子花的雄蕊和雌蕊具有很好的抗氧化能力；花旗松素在花瓣中的含量略高于雄蕊和雌蕊。GJE中芦丁、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A和异绿原酸C的含量显著高于GJM。GJE和GJM在不同部位的有效成分分布和变化趋势相似。有效成分在植物各部位的分布有显著差异。

BD处理后GJE中黄酮类化合物和多酚类含量较高。其中绿原酸(0.77 mg/g)、隐绿原酸(0.18 mg/g)、芦丁(0.25 mg/g)、花旗松素(0.91 mg/g)、异绿原酸A (0.51 mg/g)、异绿原酸B (0.15 mg/g)和异绿原酸C (0.25 mg/g)含量显著高于对照组。GJM中隐绿原酸和异绿原酸C的含量在BD处理后略有升高。HD处理后，黄酮类和酚类含量明显减少。其中花中异绿原酸C和异绿原酸B的含量均低于HD检测限。

图4 栀子花中已鉴定的化合物的结构

5.栀子花不同部位和不同处理的PCA分析

使用ORIGIN2021软件对九种醇溶性成分和生物活性的半抑制率进行PCA分析。聚类结果（图6A）显示各组分与不同处理呈正相关，与不同生理活性的半抑制率呈负相关。前两个变量解释了总变异的83.7%。第一主成分 (PC1)与花旗松素、芦丁、异绿原酸和绿原酸含量呈正相关，占总变异量的61.5%。第二主成分（PC2）占总变异的22.2%，DPPH和ABTS的半抑制率与栀子苷含量呈正相关。栀子花不同部位及品种的特征指数组分分布差异显著。GJE和GJM的雄蕊和雌蕊簇聚为一类，羟异栀子苷、异绿原酸C和异绿原酸B簇在其周围。结果表明，羟异栀子苷、隐绿原酸和异绿原酸B主要集中在雄蕊和雌蕊部位。GJE和GJM的花瓣形成一个单一的簇，其特征是栀子苷含量高。此外，主成分分析结果表明，栀子花的雄蕊、雌蕊和全花具有较强的抗氧化活性。栀子花抗氧化能力的主要成分为黄酮类化合物和酚类，而花瓣与α-葡萄糖苷呈负向关系，说明栀子花花瓣的抗氧化能力较好，这可能与栀子苷和花旗松素的成分有关。

不同处理后的栀子花进行PCA分析（图6B）显示，前两个变量解释了总变异的82.3%，其中第一主成分 (PC1)占总变异的65.1%，第二主成分 (PC2)占总变异的17.2%。从BD和FD处理中分离出GJE和GJM。花旗松素、绿原酸、异绿原酸B、隐绿原酸、芦丁、异绿原酸C和异绿原酸A主要集中在经BD处理的GJE样品中，说明这些成分在GJE BD处理后保存效果最好。在BD和FD处理后，栀子花与DPPH和ABTS自由基半抑制率呈负相关，表明其抗氧化活性较强。这可能与酚类和黄酮类化合物的成分有关。在GJE和GJM经HD处理后的样品中，形成了一个以羟异栀子苷和栀子苷均高含量为特征的单一组。α-葡萄糖苷酶活性的半抑制率与BD、FD和HD呈负相关，说明GJE的降糖能力较好，这可能与异绿原酸C、羟异栀子苷和栀子苷和花旗松素有关。

图5 栀子花不同部位(A)和不同处理(B)的主成分分析

6.柱前ABTS/DPPH高效液相分析

通过比较加入ABTS/ DPPH工作液前后样品组成的含量可以发现，去除ABTS/ DPPH自由基后，色谱峰面积下降，如图7A所示。酚类和类黄酮是主要的抗氧化剂。加入ABTS/ DPPH工作液后，峰面积明显减小，尤其对异绿原酸C具有较好的抗氧化能力。酚类成分具有显著的抗脂质过氧化和清除氧自由基的作用。因此栀子花具有良好的清热解毒作用。添加ABTS和DPPH后，栀子苷和羟异栀子苷的峰面积变化不显著，这也说明虽然花瓣及HD处理后环烯醚萜含量较高，但BD和FD处理后雄蕊和雌蕊的抗氧化能力仍显著低于BD和FD后雄蕊和雌蕊的抗氧化能力。ABTS/ DPPH-HPLC分析结果与PCA及相关分析结果一致。

7.鉴定到的化合物的α-葡萄糖苷酶抑制能力分析

测定9种化合物对栀子花α-葡萄糖苷酶的抑制活性（图7B），绿原酸、花旗松素、异绿原酸B、异绿原酸A和异绿原酸C具有良好的抑制能力，其半抑制率(IC50)分别为0.17 mg/mL、0.23 mg/mL、0.39 mg/mL、0.45 mg/mL和0.76 mg/mL。对α-葡萄糖苷酶的抑制活性均高于阳性对照阿卡波糖(IC50为4.13 mg/mL)。相关分析表明，样品中总酚含量与抑制栀子花α-葡萄糖苷酶活性的半抑制率呈负相关，说明其中酚类成分具有较好的降糖活性，这与单一化合物抑制α-葡萄糖苷酶活性的结果一致。

迈维小结

⚫ 通过GC-MS分析发现，GJE与品种GJM的花香成分相似。它们主要由萜类和酯类组成，但两种植物的花和部位之间存在显著差异。GJE花的雄蕊和雌蕊中以萜类为主，而GJM花的花瓣中以酯类为主。栀子花醇溶性提取物成分丰富。

⚫ 通过LC-MS鉴定出9个特征峰化合物，包括环烯醚萜类化合物(栀子苷和羟异栀子苷)、酚类化合物(绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B和异绿原酸C)和黄酮类化合物(芦丁和花旗松素)。本研究首次从栀子花中鉴定出花旗松素。

⚫ 活性评价结果表明，GJE花和GJM花中黄酮类化合物和多酚类具有潜在的抗氧化活性，且GJE花中酚类物质对α-葡萄糖苷酶的抑制作用优于GJM花。

⚫ 两种栀子花加工前后花及其部位的成分分布存在一定的差异和变化。栀子苷和花旗松素主要集中在花瓣中，其他成分主要集中在雄蕊中。BD处理后，环烯醚萜类成分部分流失，黄酮类和多酚类保留较好，不同处理后，GJE的生物活性和化学成分保存效果均优于GJM。

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