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《马铃薯花叶病》word版

花匠小妙招
2024-11-18 04:23

一马铃薯花叶病的表现1叶病包括4种病毒:1925年发现的马铃薯X病毒PVX、1952年发现的马铃薯S病毒PVS、1932年鉴定的马铃薯A病毒PVA及1931年记载的马铃薯Y病毒PVY

（1）马铃薯X病毒PotatovirusX简称PVX在马铃薯上引起轻花叶症，有时产生斑驳或环斑，病毒粒体线形，长480一580纳米，其寄主范围广，系统侵染的植物主要是茄科，病毒稀释限点100000~1000000倍，钝化温度68一75C，体外存活期l年以上导致的症状不同，通常的症状为轻型斑驳花叶，叶片颜色深浅不一，小叶片上叶脉间产生黄色嵌斑，严重时还会产生植株顶端坏死、叶片皱缩，植株矮化通常引起花叶伴有矮化症状大田可见顶花叶和系统花叶叶片局部浓绿或叶脉坏死叶片变窄叶上部畸形等.

（2）马铃薯S病毒PotatovirusS简称PVS，在马铃薯上引起轻度皱缩花叶或不显症，多数品种上引起叶脉颜色变深、下陷，叶片粗缩，叶尖下卷，叶色变浅；有的品种感病后产生轻度斑驳、脉带；有的易感品种在感病后期叶片变成古铜色，严重皱缩，叶面产生小的坏死斑病毒粒体线形，长650纳米，其寄主范围较窄，系统侵染的植物仅限于茄科的少数植物，病汁液稀释限点1一10倍，钝化温度55一60C，体外存活期3一4天目前主要根据在鉴别寄主昆诺黎上引起的症状不同把Pvs分为2个株系即Pvsoordinarystrain和PvsAAndeanStrain[

4.]前者在昆诺黎上引起局部坏死斑后者引起系统斑驳症状这2个株系在马铃薯上引起的症状也不尽相同前者单独侵染通常为隐症带毒后者常常导致叶片青铜色并伴有坏死斑点（3马铃薯A病毒PotatovirusA简称PVA病毒浸染植株后，叶片扭曲，叶间出现黄色斑驳，后期叶脉下陷，叶边缘粗缩在马铃薯上引起轻花叶或不显症病毒粒体线形，长730纳米，其寄主范围较窄，仅侵染茄科少数植物，病汁液稀释限点10倍，钝化温度44~52C，体外存活期12一18小时PVA单独浸染常引起花叶或皱叶有时无症状.马铃薯A病毒（PVA）一般会在马铃薯叶片上引起轻度花叶，在叶脉上或叶脉间会呈现出不规则的浅色斑，暗色部分比健叶颜色深，叶子表面粗糙，叶缘可产生皱褶呈波状，在有的栽培品种上可表现不同程度的卷曲和皱缩病株的茎枝向外弯曲，常呈开散状马铃薯Y病毒potatovirusY简称PVY，PVY是一种很典型的RNA病毒在马铃薯上引起严重花叶或坏死斑和坏死条斑，病毒粒体线形，长730纳米，该病毒寄主范围较广，可侵染茄科多种植物，病汁液稀释限点100一1000倍，钝化温度52一62C，体外存活期1~2天，这种病毒引起的马铃薯病一般分为马铃薯重花叶病、条斑垂叶坏死病、条斑花叶病条斑花叶病、点条斑花叶病.PVY具有PVY0株系普通株系、PVYc株系条痕花样株系、PVYN株系烟草叶脉坏死株系等多个不同特性的变异株系.依据血清学反应PVY分成PVYOC血清型和PVYN血清型;PVY粒子为弯曲的线条状粒子通常长约700一900nm直径11一15nm大小为730x11nm螺旋对称螺距

3.4nm颗粒含有大约5%的核酸和95%的蛋白质沉降为单一组分沉降系数约150s在cscl中浮力密度为

1.31g.cm一3致死温度52一55e体外保毒期2一3d稀释终点10一4--10一5二马铃薯病毒检测技术1指示植物法1病毒名称接种方式指示植物及其症状

（1）PVX汁液摩擦1千日红接种5-7天后叶片出现紫红环枯斑2千日红对马铃薯x病毒的反应是接种后在叶片上出现红色病斑3白花刺果曼陀罗接种10天后系统花叶4指尖椒接种10-12天后叶片出现褐坏死斑点，以后系统花叶

（2）PVY汁液摩擦1枸杞接种10天后接种叶片出现不清晰的褐色局部病斑2马铃薯A6接种5-10天接种叶片出现褐色环状枯斑，初侵染呈绿环斑3洋酸浆对马铃薯Y病毒的反应是接种后在叶片上出现小枯斑

（3）PVS汁液摩擦德伯尼烟初期明脉，以后系统绿块斑花叶

（4）PVA地霉松对马铃薯A病毒的反应是在叶片上出现许多小型点状病斑2电子显微镜技术3双抗体夹心酶联免疫吸附法在酶联反应板的每个孔中加入100ul稀释好的包被液在每10mL包被缓冲液中加入35ul待测病毒抗体37摄氏温度育3~4h或室温孵育5h取待测样品约

0.5g放入样品袋中加入

2.0mL提取缓冲液研磨样品至完全磨碎将包被好的反应板洗涤后每孔加入100ul样品液密封后将其放入4摄氏温度冰箱孵育过夜反应板经洗涤后每孔加入90ul已稀释的酶标液每10mL包被缓冲液中加入35Ll待测病毒对应的酶标抗体37摄氏温度育3~4h或室温下5h洗板后每孔中加入80ul的底物溶液30min左右观察结果并用酶联免疫吸附检测仪读出数据二马铃薯花叶病的取样匀桨法称取病叶l克加PB缓冲液O.IM磷酸缓冲液PH

7.0lml匀浆8000转/分离心10分钟取上清即为病毒悬液病毒悬液再用PB缓冲液分别稀释成10-110-

2......10-5备用.马铃薯X病毒的毒源分离、繁殖和提纯用一皱缩花叶症状的东农303马铃薯檀株作为接种体，摩擦接种于白花刺果蔓陀萝Daturastra—monism，以排除Y病毒，然后接种于千日红GomphrenaglobosaT_进行两次单斑分离，再接种于普通烟Nieotianatabagurlle4．HumgMiaoYu上繁殖病毒，Khurana等的方法，称取冷冻毒源叶片300g，以BeckanOptimaLE一8OK型超速离心机提纯病毒，用O．2M磷酸氢二钠，0．05M柠檬酸三钠缓冲液内含O．1％二乙基二硫代氨基甲酸钠和O．5％巯基乙醇匀浆毒源叶片，用7％正丁醇澄清提取液，先用聚乙二醇6000沉淀一次病毒，然后以10000drain离心90min沉淀病毒，再以10％-40％蔗糖密度梯度，28000r／min离心90min，用260nm监测，分部收集病毒带，然后台并病毒带加进一倍缓冲液，用45000r／min离心90min回收病毒三马铃薯花叶病病原培养基的制备四马铃薯花叶病病原的理化性质的鉴定2血清学检测对待测样品进行DAS一ELISA检测结果表明马铃薯PVX可与PVX抗血清产生明显的阳性反应图PvX病毒粒体表:各标样血清学反应及粒体形态2免疫学检测技术.1双抗体夹心酶联免疫吸附法DAS一ELISADAS一ELISA是:一种传统的植物检测技术在马铃薯病毒检测中有其独到的应用最早是由clark和AdnlnS1977年提出的现在被普遍应用于各种植物的病毒检测为了加快反应速度节省时间白艳菊等在常规DAS一ELISA方法基础上做了两方面的改进:第一由常规ELISA在一块板上一种酶标记一种抗体改为同块板上几种酶对应标记几种抗体以PVXPVYPvS第二DAS..ELISA各种反应均在恒温摇床中进行实现了快速同时检测多种马铃薯病毒Ellis等采用双抗体夹心法进行了PvY的鉴定和PvY血清型地理分布工作国内也广泛应用双抗体夹心法检测PvY并且己将此法应用于脱毒苗的检测中宋吉轩等分别用改进DAs一ELISA法和常规DAS一ELISA法对马铃薯4种主要病毒PVX!PVY!PVS!PLRV进行检测其检测结果完全一致且灵敏度也基本相同=-04]结果表明改进DAs一ELIsA法是一种快速准确可靠的检测方法适合种薯生产中大量样品的多种马铃薯病毒的快速检测3电子显微镜观察取与PVX抗血清有阳性反应的马铃薯叶片采用汁液负染法进行电镜观察结果表明病毒粒体均为弯曲的线条状大小5l5X13nm与PVX病毒相符4在紫外分光灯下刚定OD值246nmpvx为最低260nm为最高消光系数OD260/280分别为

1.22五马铃薯花叶病病原的分子生物学方法1根据NCBI报道的六种马铃薯病毒的保守序列设计马铃薯X病毒PVX!马铃薯Y病毒PVY!马铃薯卷叶病毒PLRV!马铃薯M病毒PVM!马铃薯S病毒PVS!马铃薯A病毒PVA的特异性引物对2马铃薯病毒单重RT一pCR检测的灵敏度测定在马铃薯病毒单重灵敏度测定中:将50一100mg马铃薯叶片或茎秆薯块可以取幼芽提取RNA放入研钵中迅速加入液氮并将样品研磨至粉状研磨充分后把粉末转移到离心管中加入500ml裂解液使用前应按比例加入p一琉基乙醇溶液和粉末振荡均匀后将匀浆转移到CS过滤柱上12000rpm下离心3min吸取上清液到另外的离心管中再加入上清液

0.5倍体积的乙醇混匀合均匀后将溶液和沉淀一起转移到CR吸附柱中12000rPm离心lmin倒掉收集管中的废液将吸附柱重新放回收集管向吸附柱中加入7O0ul去蛋白液RWI在12000rPm下离心lmin倒掉废弃液将吸附柱放回收集管然后向吸附柱中加入5O0ul漂洗液RW在1200OrPm下离心lmin倒掉废弃液重复洗涤一次洗涤完后将吸附柱在12000rpm下离心2一3min以去除残液让吸附柱在室温下放置几分钟后将吸附柱放入新的离心管中向吸附柱的膜中央加入50一80ulddHZO再在室温下放置几分钟在1200Orpm下离心Zmin得到提纯的总RNA提取的RNA溶液于一20e保存制备1%的琼脂糖凝胶电泳检测各病毒RNA的完整性在120伏恒压条件下电泳30分钟以上在凝胶成像仪上成像检测先将六种病毒的RNA模板分别进行反转录将得到的cDNA用核酸蛋白分析仪测定其含量经测定PVM的CDNA含量为710ng/ulPVS的CDNA含量为63Ong/ulPVX的CDNA含量为690ng/ulPVY的eDNA28含量为680ng/ulPVA的eDNA含量为605ng/ulPLRV的eDNA含量为665ng/ul再将各病毒的CnNA稀释为为:400ng/ul300ng/ul200ng/ul100ng/ul50ng/u125ng/u1六个梯度检测结果为PVSPVXPVM病毒的检测灵敏度较高达到50ng/u1PVAPVYPLRV病毒的检测灵敏度均为100ng/u1见图。