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洋甘菊快速繁殖和FPS基因在烟草中的转化研究.pdf

花匠小妙招
2024-11-20 01:18

洋甘菊快速繁殖和FPS基因在烟草中的转化研究

摘要洋甘菊(Matricaria chamomilla L.)又称母菊，为菊科母菊属一年生的草本植物，含挥发性芳香油。洋甘菊不仅具有抑菌、消炎的作用，还具有解痉镇静、止痛等诸多作用，是一种开发潜力极大的芳香性植物和药用植物。母菊薁是洋甘菊挥发油的重要成分之一，为倍半萜类物质。母菊薁生物合成途径属于类异戊二烯代谢途径，其中法呢基焦磷酸合酶（FPS）为这个代谢途径的限速酶。本实验一方面通过植物组织培养技术建立洋甘菊快速繁殖体系；另一方面通过克隆法呢基焦磷酸合酶基因，构建FPS 基因真核表达载体，并在烟草中进行表达检测。为洋甘菊遗传转化体系建立和优良品种的选育提供理论依据。实验结果如下： 1.建立了一套高效快速的洋甘菊离体再生体系。本文以洋甘菊种子为外植体，获得无菌苗。并以无菌苗的叶柄为外植体，分别研究了单一植物激素和不同植物激素浓度及其组合对洋甘菊愈伤组织、不定芽、不定根诱导的影响，筛选出适合洋甘菊组织培养的最适培养基。结果表明：在研究范围内，洋甘菊愈伤组织诱导的最佳激素组合为MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.3mg/L ，愈伤组织的诱导率为91.6%；洋甘菊不定芽诱导的最佳激素组合为MS+6-BA1.0mg/L+NAA2.0mg/L ，不定芽的诱导率为79.4%；不定根分化的最佳培养基为 MS+6-BA0.3mg/L+NAA0.5mg/L ，根的诱导率可达 100%；试管苗移栽的最适基质为蛭石:珍珠岩: 草炭(1 ∶1 ∶1) 。 2.构建了洋甘菊法呢基焦磷酸合酶基因真核表达载体。根据洋甘菊法呢基焦磷酸合酶mRNA 全长序列，设计出特异性引物，以西德洋甘菊花序总RNA 为模板，利用特异性引物成功克隆出洋甘菊 FPS 基因，并将该片断连接至克隆载体pEASY-T4 Zero Cloning Vector 上，转化到Trans1-T1 感受态细胞中进行培养及基因测序。测序结果表明，通过RT-PCR 法获得的FPS 基因的开放阅读框为1032bp，共编码343 个氨基酸残基。将得到的洋甘菊 FPS 基因克隆至真核表达载体p BI 121，成功地构建了植物表达载体p BI 121-FPS 。 3.研究了洋甘菊FPS 基因在烟草中的转化表达。采用冻融法将真核表达载体导入根癌农杆菌中，利用农杆菌EHA105 转化烟草。取烟草的无菌苗叶片，预培养3d 后，农杆菌菌液稀释至OD 为0.6 左右，侵染预培养的叶盘10min，然后置于无菌滤纸上 600 I 吹干，转至共培养培养基上，暗培养3d，脱菌后将叶片转至含有75mg/L Kan 和400mg/L Cef 的筛选培养基上，25℃光照培养。待抗性芽长至2cm 左右，将抗性芽置于含有卡那霉素的生根培养基中培养，最终成功地获得了抗性烟草植株。本实验提取抗性烟草植株的基因组，采用PCR 法对筛选出的抗性烟草植株进行检测，结果表明，7 个烟草抗性植株中有 2 个与阳性对照FPS 基因大小一致且条带清晰单一，所以可以初步判断 FPS 基因在烟草基因组中进行了转化。关键词：洋甘菊，法呢基焦磷酸合酶，克隆，转化，再生体系 II Abstract Chamomile(Mauritania chamomile L.), an annual herbs from Asteraceae family, is one of the aromatic and medicinal plants, chamomile essential oil has been proved to have effects on antimicrobial, anti-inflammatory, antispasmodic, sedative, analgesic and anti-carcinogenic. The main component of the volatile oil of chamomile is chamazulene, which is a sesquiterpe