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一种植物免疫诱抗菌及其构建方法和应用

花匠小妙招
2024-11-20 14:14

一种植物免疫诱抗菌及其构建方法和应用

1.本发明涉及农作物生物防治技术领域，尤其涉及一种植物免疫诱抗菌及其构建方法和应用；具体地，所述植物免疫诱抗菌为转基因生防芽孢杆菌。

背景技术：

2.随着科学的发展以及技术的进步，逐渐解析了植物免疫的相关机制，植物免疫的原理也被广泛应用于农作物的病虫害防控。植物免疫通常由外源的激发子诱导产生，植物的免疫诱导抗性特点，将能够激活植物免疫的激发子开发成植物免疫诱抗剂，用于植物的病虫害防治。利用病原菌分泌的植物免疫激活蛋白激活植物免疫，从而增强植物抵御病原菌的能力，不仅绿色环保，而且使用浓度低、无残留、且病原菌不会产生抗药性。早在1992年，美国eden公司将梨火疫病菌分泌的诱抗蛋白harpin研制成新型生物农药messenger，对多种植物病害均具有良好的防治效果(wei et al,1992)。前期研究从大豆疫霉菌的培养液中发现了一种新的植物免疫激活蛋白并将其命名为pspii1，该植物免疫激活蛋白pspii1具有较强的活性，能够诱导植物的抗性和防卫反应，可以应用于大豆根腐病和烟草花叶病的防治。然而，免疫诱抗蛋白的应用存在一定的问题，例如，蛋白类药剂容易降解，导致持效期短，另一方面，生产纯化步骤繁琐，成本较高。这些问题的存在限制了免疫诱抗蛋白的应用和推广。
3.选择对植物友好的微生物，并将免疫激活蛋白编码基因构建到这些微生物的基因组上，利用微生物在植物根际生存过程中持续分泌免疫激活蛋白，可望实现将“蛋白发酵工厂”转移至植物根际的效果。已有研究利用工程细菌进行了相关尝试，例如将枯草芽孢杆菌与激发子stpep1创新结合，利用枯草芽孢杆菌高效表达系统将stpep1的诱抗作用放大，能够有效提高马铃薯对根结线虫的抗性(zhang et al,2020)。枯草芽孢杆菌是一种常见的根际促生细菌(plant growth-promoting rhizobacteria，pgpr)，因具有极强的适应能力和高效的抗菌活性，常被视作生防微生物的优先选择(黄海婵等，2005)。例如，gustafson公司开发的gbo3和microbio ltd公司开发的mbi600可以防控由镰孢菌(fusarium spp.)、曲霉属(aspergillus spp.)、链格孢属(alternaria spp.)和丝核菌属(rhizoctonia spp.)引发的豆类、麦类、棉花以及花生根部病害(赵达等，2007)。
4.然而，自然界分离到的生防芽孢杆菌菌株通常不易于进行遗传转化，而且往往具有较强的胞外蛋白酶分泌能力，异源表达的蛋白容易被降解。因此，筛选选择具有良好植物根部定殖能力、且易于遗传转化的枯草芽孢杆菌菌株作为出发菌，进一步利用免疫诱抗蛋白编码基因进行基因编辑，从而制备具有防治作用的生防菌，在农业生产中具有重要的实用价值。
5.参考文献：
6.wei zm,laby rj,zumoff ch,et al.harpin,elicitor of the hypersensitive response produced by the plant pathogen erwinia amylovora[j].science,1992,257(5066):85-88.
[0007]
zhang l,gleason c.enhancing potato resistance against root-knot nematodes using a plant-defence elicitor delivered by bacteria[j].nature plants,2020,6(6):625-629.
[0008]
黄海婵,裘娟萍.枯草芽孢杆菌防治植物病害的研究进展[j].浙江农业科学,2005(3):213-219.
[0009]
赵达,傅俊范,裘季燕,等.枯草芽孢杆菌在植病生防中的作用机制与应用[j].辽宁农业科学,2007(1):46-48.
[0010]
曲苇苇.水稻纹枯病菌对大豆的致病力及大豆品种对立枯丝核菌的抗性测定[d].南京农业大学,2021.

技术实现要素：

[0011]
为了克服现有技术中存在的至少一个问题，本发明提供了一种植物免疫诱抗菌，其为转基因枯草芽孢杆菌，并优化其构建方法，构建环境安全的表达载体、筛选相应的突变菌株以增强转基因工程菌的生物安全性，并将其应用于防治植物病害，可有效提高大豆根腐病的防治效率。
[0012]
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0013]
本发明的第一个方面是提供一种植物免疫诱抗菌，所述植物免疫诱抗菌为转基因生防芽孢杆菌，其通过将大豆疫霉激发子pspii1编码基因整合到枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)的基因组上获得；其中，编码所述大豆疫霉激发子pspii1的基因序列如seq id no.1所示。
[0014]
进一步地，所述转基因生防芽孢杆菌利用crispr/cas9基因编辑技术构建。
[0015]
进一步地，所述转基因生防芽孢杆菌的构建选择淀粉酶合成基因amye作为整合位点，使用的载体含有cas9蛋白和sgrna的表达元件。
[0016]
进一步地，所述载体为pjoe8999质粒；其中，所述pjoe8999质粒以枯草芽胞杆菌温敏型载体pe194ts为骨架。上述pjoe8999质粒30℃下正常复制，随着温度升高，拷贝数逐渐降低，45℃时停止复制，因此可采用高温清除质粒法消除整合载体，以达到无标记修复的目的。
[0017]
可理解地，上述转基因生防芽孢杆菌构建时采用的出发菌株可为具备容易转化特点的任一合适的枯草芽孢杆菌，例如具体可为枯草芽孢杆菌bs1，其保藏编号为cgmcc no.8138。
[0018]
本发明的第二个方面是提供一种如本发明第一个方面中任一所述的植物免疫诱抗菌的构建方法，包括如下步骤：
[0019]
步骤1)扩增得到目的基因序列，所述目的基因为大豆疫霉激发子pspii1编码基因；将整合位点的左右两侧序列作为同源左右臂，以枯草芽孢杆菌基因组dna为模板，分别扩增得到左臂序列、右臂序列；
[0020]
步骤2)将所述左臂序列、右臂序列和目的基因序列扩增得到左臂-目的基因-右臂的融合片段；
[0021]
步骤3)将步骤2)得到的所述融合片段克隆到pjoe8999载体上，获得载体pjoe-lr；
[0022]
步骤4)根据所述整合位点中的靶标序列设计并合成sgrna，将所述sgrna克隆到步
骤3)获得的所述载体pjoe-lr上，获得载体pjoe-pspii1；
[0023]
步骤5)将步骤4)获得的所述载体pjoe-pspii1转入枯草芽孢杆菌，构建获得转基因生防芽孢杆菌。
[0024]
进一步地，在上述构建方法中，所述步骤1)中，所述左臂序列如seq id no.2所示，所述右臂序列如seq id no.3所示。
[0025]
进一步地，在上述构建方法中，用于扩增所述左臂序列的引物(amyel-f/amyel-r)序列如seq id no.5和seq id no.6所示；用于扩增所述右臂序列的引物(amyer-f/amyer-r)序列如seq id no.7和seq id no.8所示；
[0026]
进一步地，在上述构建方法中，所述步骤1)中，所述目的基因序列的扩增以质粒pbes-pspii1为模板；用于扩增所述目的基因序列的引物(pbes-f/pbes-r)序列如seq id no.9和seq id no.10所示。
[0027]
进一步地，用于扩增所述融合片段的引物(amyel-f/amyer-r)序列如seq id no.5和seq id no.8所示。
[0028]
进一步地，在上述构建方法中，扩增左臂序列、右臂序列、目的基因序列以及融合片段的反应体系均为：2
×
phanta max buffer 25μl、10mm dntp mix 1μl、10μm上游引物2.5μl、10μm下游引物2.5μl、模板dna 100g、dna聚合酶0.5μl、ddh2o补足至50μl；扩增程序为：98℃1min，(98℃10s，50-72℃30s，72℃30s/kb)
×
32循环，72℃2min，4℃保存。
[0029]
进一步地，在上述构建方法中，所述步骤3)的具体步骤包括：
[0030]
步骤3-1)使用限制性内切酶分别对pjoe8999质粒、融合片段进行酶切，回收酶切产物；
[0031]
步骤3-2)将pjoe8999质粒的酶切产物和融合片段的酶切产物进行连接、转化，获得载体pjoe-lr。
[0032]
进一步地，在上述构建方法中，所述步骤3-1)中，使用的限制性内切酶为sfi i，其酶切体系如下：质粒/dna片段1μg、sfi i 1μl、10
×
nebuffer 5μl、ddh2o补足至50μl，反应温度50℃，反应时间2-4h。
[0033]
进一步地，在上述构建方法中，所述步骤3-2)中，利用t4 dna连接酶进行体外连接，连接体系如下：质粒片段3μl、融合片段10μl、t4 dna ligase 1.5μl、10
×
ligase buffer 2μl、ddh2o补足至20μl；转化步骤如下：连接液在16℃金属浴中过夜并转化至大肠杆菌，待转化子长出后进行菌落pcr鉴定并测序得到构建好的载体pjoe-lr。
[0034]
进一步地，在上述构建方法中，所述步骤4)中，所述靶标序列如seq id no.4所示。
[0035]
进一步地，在所述上述构建方法中，步骤4)的具体步骤包括：
[0036]
步骤4-1)合成两条方向互补的单链引物；将所述单链引物磷酸化、退火、延伸形成两端具有内切酶粘性末端的双链sgrna；
[0037]
步骤4-2)酶切载体pjoe-lr，回收酶切产物；将所述双链sgrna与所述酶切产物进行连接、转化，获得载体pjoe-pspii1。
[0038]
进一步地，在上述构建方法中，所述步骤4-1)中，单链引物(sg-f/sg-r)的序列分别如seq id no.11和seq id no.12所示，单链引物用buffer te溶解，浓度为100mm，磷酸化反应体系：sg-f(100mm)1μl、sg-r(100mm)1μl、10
×
t4 ligation buffer(neb)1μl、ddh2o 6.5μl、t4 pnk(neb)0.5μl，37℃反应30分钟；在磷酸化反应后放入沸水中5分钟，并自然冷
却至室温，-20℃保存，使两条单链引物退火、延伸形成双链sgrna，且两端含有bsa i粘性末端。
[0039]
进一步地，在上述构建方法中，所述步骤4-2)中，使用bsa i酶切载体pjoe-lr，酶切体系为：载体1μg、bsa i 1μl、10
×
nebuffer 5μl、ddh2o补足至50μl，37℃反应2-4h；连接体系为：酶切产物3μl、sgrna 13.5μl、t4 dna ligase 1.5μl、10
×
ligase buffer 2μl；转化步骤如下：连接液16℃过夜，转化至大肠杆菌感受态待长出单菌落，通过菌落pcr和测序筛选得到载体pjoe-pspii1。
[0040]
进一步地，在上述构建方法中，所述步骤5)的具体步骤包括：利用甘露糖诱导cas9蛋白表达，cas9蛋白在sgrna的引导下，对靶标序列进行剪切造成染色体双链断裂；枯草芽孢杆菌通过特定的同源重组修复，与步骤4)获得的所述载体pjoe-pspii1的同源左右臂发生双交换从而使pspii1编码基因整合到所述枯草芽孢杆菌的染色体dna上；采用高温清除质粒法消除pjoe8999质粒，获得转基因生防芽孢杆菌。
[0041]
进一步地，在上述构建方法中，高温清除质粒的具体步骤包括：挑取转化子到无抗性的lb平板上，置于50度培养箱中；待挑出的转化子长出，重新挑取到新的lb平板上，置于42培养箱中生长；待转化子长出，挑取至卡纳抗性的lb板上，37度过夜培养以确定质粒是否丢失。
[0042]
进一步地，在上述构建方法中，在高温清除质粒后，还使用外围引物筛选阳性转化子，根据测序结果将正确的转化子确定为所述转基因生防芽孢杆菌；其中，所述外围引物amye-out-vf和amye-out-vr的序列分别如seq id no.13和seq id no.14所示。
[0043]
本发明的第三个方面是提供一种如本发明的第一个方面中任一所述的植物免疫诱抗菌、或由本发明的第二个方面中任一所述的构建方法制得的植物免疫诱抗菌的应用，所述应用选自以下应用中的至少一种：在促进大豆黄化苗的生长中的应用、在防控病原菌中的应用、在防治大豆根腐病中的应用；其中，所述病原菌包括拟茎点种腐病菌、刺腐霉、立枯丝核菌、禾谷镰孢菌。
[0044]
进一步地，所述植物免疫诱抗菌降低黄化苗中病原菌的生物量，减少病原菌对黄化苗的侵染，提高大豆对病原菌的抗性，增高大豆株高，增加大豆的单株荚数，提高大豆产量。
[0045]
进一步地，所述大豆根腐病为由大豆根腐病菌引起的大豆根腐病，所述大豆根腐病菌包括拟茎点种腐病菌、刺腐霉、立枯丝核菌、禾谷镰孢菌；具体地，所述大豆根腐病为由拟茎点种腐病菌引起的大豆根腐病。
[0046]
本发明的第四个方面是提供一种如本发明的第一个方面中任一所述的植物免疫诱抗菌、或由本发明的第二个方面中任一所述的构建方法制得的植物免疫诱抗菌的培养方法，其包括：取转基因生防芽孢杆菌划线涂板于lb固体培养基中，并于37℃培养箱中培养12h；取已活化的菌株于lb液体培养基中，于37℃、220rpm摇床振荡培养12h；以1：500的浓度接种于lb液体培养基中，于28℃、220rpm摇床振荡过夜，扩大培养。
[0047]
与现有技术相比，本发明采用上述技术方案具有以下有益效果：
[0048]
本发明利用芽孢杆菌这一高效的蛋白分泌“细胞工厂”，充分地将激发子的免疫诱抗功能与芽孢杆菌的促生、定殖功能结合在一起，相对于原核表达系统而言，有效解决了蛋白类激发子实际生产应用过程中面临的易降解、持效期短、货架期短等问题；本发明直接利
用定殖在植物根部的转基因芽孢杆菌，不需要进行蛋白表达纯化，提取等后续步骤。
[0049]
本发明选取枯草芽孢杆菌作为出发菌株，利用crispr/cas9基因编辑技术将pspii1编码基因无标记整合到出发菌株的染色体dna，构建获得转基因生防芽孢杆菌，其能够在植物根际生存过程中持续分泌大豆疫霉激发子pspii1，其不仅能够减少大豆主要病原菌对黄化苗的侵染，还能提高大豆植株对病原菌的抗性；且在大田体系中验证，经上述转基因生防芽孢杆菌发酵液处理的大豆株高显著增高，大豆的单株荚数增加，大豆产量显著提高，其对大豆根腐病具有良好的生防效果。
附图说明
[0050]
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明仅用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
[0051]
图1为本发明一实施例中大豆根际、大豆根表分别涂布在培养基上的菌落数的结果示意图；
[0052]
图2为本发明一实施例中分别用生防菌bs1-pspii1和野生型bs1菌液处理且培育六天后的大豆黄化苗的照片及其相关指标的结果示意图；
[0053]
图3为本发明一实施例中使用立枯病菌侵染经生防菌bs1-pspii1处理后的大豆黄化苗下胚轴后的照片及其相关指标的结果示意图；
[0054]
图4为本发明一实施例中使用禾谷镰孢菌侵染经生防菌bs1-pspii1处理后的大豆黄化苗下胚轴后的照片及其相关指标的结果示意图；
[0055]
图5为本发明一实施例中使用刺腐霉病菌侵染经生防菌bs1-pspii1处理后的大豆黄化苗下胚轴后的照片及其相关指标的结果示意图；
[0056]
图6为本发明一实施例中使用拟茎点种腐病菌侵染经生防菌bs1-pspii1处理后的大豆黄化苗下胚轴后的照片及其相关指标的结果示意图；
[0057]
图7为本发明一实施例中接种了立枯病菌并且滴加了生防菌bs1-pspii1后、培育了21d的大豆盆栽的照片及其相关指标的结果示意图；
[0058]
图8为本发明一实施例中接种了禾谷镰孢菌并且滴加了生防菌bs1-pspii1后、培育了21d的大豆盆栽的照片及其相关指标的结果示意图；
[0059]
图9为本发明一实施例中接种了刺腐霉病菌并且滴加了生防菌bs1-pspii1后、培育了21d的大豆盆栽的照片及其相关指标的结果示意图；
[0060]
图10为本发明一实施例中接种了拟茎点种腐病菌并且滴加了生防菌bs1-pspii1后、培育了21d的大豆盆栽的照片及其相关指标的结果示意图；
[0061]
图11为本发明一实施例中分别用生防菌bs1-pspii1和野生型bs1处理并接种了大豆拟茎点种腐病菌的大豆大田实验照片及其相关指标的结果示意图。
具体实施方式
[0062]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照
国家标准测定。下述实施例中未注明出处的实验材料，均为市售原料。下述实施例中的各步骤中采用的设备均为常规设备。若没有相应的国家标准，则按照通用的国际标准、常规条件、或按照制造厂商所建议的条件进行。除非另外说明，否则所有的份数为重量份，所有的百分比为质量百分比。除非另有定义或说明，本发明中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术熟练人员所熟悉的意义相同。此外任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。
[0063]
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限定。
[0064]
以下实施例中所用到的实验材料如下：
[0065]
1)供试菌株：
[0066]
无标记整合pspii1的枯草芽孢杆菌菌株bs1(转基因生防芽孢杆菌bs1-pspii1)由本实验室与植病系伍辉军老师合作构建；野生型枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)bs1菌株由植病系伍辉军老师提供；供试大豆根腐病菌rhizoctonia solani dt6-7、phomapsis longicolla dt3-3、phomapsis longicolla xz1-s、fusarium graminearum ph-1、pythium spinosum 2-2由本实验室分离保存。
[0067]
2)供试培养基：
[0068]
lb培养基：称取10g nacl、10g蛋白胨(tryptone)、5g酵母提取物(yeast extract)加入1000ml超纯水中，搅拌混匀，分装。配置lb固体培养基时，在液体中加入15％的琼脂粉。使用高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌20min备用。
[0069]
10％的v8固体培养基：取100ml的v8原汁，加入1g碳酸钙并搅拌均匀，待其溶解后2500rpm离心5min，取上清液与超纯水按1：9比例稀释，分装，分装后在液体中加入1.5％琼脂粉。使用高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌20min备用。
[0070]
马铃薯葡萄糖琼脂培养基(pda)：称取46g马铃薯葡萄糖琼脂粉加入到1000ml的超纯水中，搅拌均匀，分装，使用高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌20min备用。
[0071]
3)供试菌株培养：
[0072]
供试生防菌培养：取生防芽孢杆菌bs1-pbe-s-pspii1、bs1-pspii1菌株、野生型枯草芽孢杆菌bs1菌株分别划线涂板于lb固体培养基中，并于37℃培养箱中培养12h；取已活化的菌株于lb液体培养基中，于37℃、220rpm摇床振荡培养12h；以1：500的浓度接种于lb液体培养基中，于28℃、220rpm摇床振荡过夜，扩大培养。
[0073]
供试大豆根腐病原菌培养：将培养基pda(培养真菌)、v8(培养卵菌)加热融化并放置冷却，将培养基分装倒入培养皿中。取保存的大豆根腐病菌株接种活化两代之后，接种于新的培养基，并放置于25℃培养箱中黑暗培养。
[0074]
下述实施例中所涉及的序列信息：
[0075]
[0076]
[0077][0078]
实施例1
–
转基因生防芽孢杆菌bs1-pspii1的构建
[0079]
本实施例为一较佳的以枯草芽孢杆菌bs1为例构建转基因生防芽孢杆菌的方法，上述枯草芽孢杆菌bs1是从大豆根部筛选到的枯草芽孢杆菌，能够促进大豆生长，同时易于进行遗传转化，以及外源蛋白的表达。上述构建方法具体包括步骤：
[0080]
(一)无标记整合载体pjoe-pspii1的构建
[0081]
(1)融合片段克隆到pjoe8999首先将同源左右臂和目的基因按照左臂-目的基因-右臂的顺序融合并连入载体。利用重叠延伸pcr(soe pcr)的原理设计引物，使三个片段的连接处含有互补部分并且两端含有酶切位点(sfi i)。
[0082]
1.1)以枯草芽孢杆菌bs1基因组dna为模板，amyel-f/amyel-r，amyer-f/amyer-r为引物，pcr扩增分别得到左臂和右臂；以质粒pbes-pspii1(pbe-s载体购买自大连宝生物公司(cat.#3380)，pbes-pspii1根据pbes载体说明书进行构建)为模板，pbes-f/pbes-r为引物扩增得到目的基因；以上述3个片段为模板和引物amyel-f/amyer-r扩增得到dna融合片段。上述线性片段扩增使用诺维赞公司的phanta max super-fidelity dna polymerase，扩增体系如下：
[0083][0084][0085]
扩增程序为98℃1min，(98℃10s，50-72℃30s，72℃30s/kb)
×
32循环，72℃2min，4℃保存。
[0086]
1.2)使用neb的限制性内切酶(sfi i)对pjoe8999质粒或dna融合片段进行酶切，使用omega的胶回收试剂盒对pcr或酶切产物进行回收。酶切体系如下：
[0087][0088]
反应温度50℃，反应时间2-4h。使用1％琼脂糖凝胶对酶切产物进行电泳检测并回收备用。
[0089]
1.3)利用t4 dna ligase将酶切的pjoe8999载体和酶切后的融合片段体外连接，体系如下：
[0090][0091]
1.4)连接液在16℃金属浴中过夜并转化至大肠杆菌top10，待转化子长出后使用引物pjoe-vf/pjoe-vr进行菌落pcr鉴定并测序得到构建好的载体pjoe-lr。
[0092]
(2)靶标sgrna克隆到pjoe-lr
[0093]
利用在线网站(http://crispr.mit.edu/)预测整合位点amye中的靶标sgrna。sgrna需要通过酶切位点bsa i连入载体，因此首先合成两条方向互补的单链引物，然后将合成的单链引物用buffer te溶解，浓度为100mm。并配置体系如下：
[0094][0095]
37℃反应30分钟使产物磷酸化。再放入沸水中5分钟，并自然冷却至室温，-20℃保存。这样能够使两条单链引物退火、延伸形成双链sgrna，且两端含有bsa i粘性末端。
[0096]
将sgrna连入pjoe-lr的bsa i位点，步骤如下：
[0097]
2.1)使用bsa i酶切载体pjoe-lr，体系如下：
[0098][0099]
37℃反应2-4h，使用1％琼脂糖凝胶对酶切产物进行电泳检测并纯化回收。
[0100]
2.2)利用t4 dna ligase将sgrna连接pjoe-lr，连接体系如下：
[0101][0102]
2.3)16℃过夜，转化至大肠杆菌e.coil top10感受态待长出单菌落。使用引物pjoe-vf/pjoe-vr进行菌落pcr和测序筛选得到载体pjoe-ps-pspii1。
[0103]
(二)pspii1无标记整合至枯草芽孢杆菌bs1
[0104]
枯草芽胞杆菌感受态的制备与转化步骤如下：
[0105]
(1)挑取宿主菌bs1的单菌落接至20ml lb液体培养基，37℃，200rpm过夜培养。
[0106]
(2)吸取800μl培养液，接种至50ml锥形瓶配置的25ml的spⅰmedium中，37℃200rpm摇床培养，2h后开始检测od
600
。当培养物生长到对数生长末期时(od
600 1.0～1.4)，快速吸取2.5ml菌液转接至25ml的spⅱmedium中，置于37℃100rpm摇床培养1.5h。
[0107]
(3)加入250μl的100
×
egta溶液，37℃，100rpm摇床继续培养10min后用灭菌的1.5ml ep管分装成500μl每管。
[0108]
(4)向离心管加入1μg的质粒，轻轻混匀，于37℃100rpm摇床培养30min，然后200rpm摇床继续培养1.5h。
[0109]
(5)4000rpm离心2min收集菌体，弃适量上清液，留100μl重悬菌体，涂布于含甘露糖(0.2％)和卡纳霉素的lb平板，于37℃过夜培养(16h)至长出单克隆。
[0110]
长出的转化子仍携带pjoe质粒，pjoe质粒在45度以上无法复制，所以可以以高温的方法消除质粒。首先用灭菌的牙签挑取转化子到无抗性的lb平板上，置于50度培养箱中。待挑出的转化子长出，重新挑取到新的lb平板上，置于42培养箱中生长。待转化子长出，挑取至卡纳抗性的lb板上，37度过夜培养以确定质粒是否丢失，通常情况下，90％的质粒会丢失。
[0111]
使用外围引物amye-out-vf/amye-out-vr筛选阳性转化子，结合测序结果挑选正确的转化子，命名为转基因生防芽孢杆菌bs1-pspii1。
[0112]
实施例2-转基因生防芽孢杆菌bs1-pspii1在大豆根部定殖的测定
[0113]
本实施例对转基因生防芽孢杆菌bs1-pspii1在大豆根部定殖进行测定，由于该定殖实验检测生防芽孢杆菌bs1-pspii1菌落时需要使用抗性培养基对其进行筛选，所以此实验使用的生防芽孢杆菌为带有抗性的菌株bs1-pbe-s-pspii1，所用到的pbe-s载体购买自大连宝生物公司(cat.#3380)，上述bs1-pbe-s-pspii1的构建步骤见载体的产品说明书。
[0114]
选择口径为12cm、高为11cm的盆钵并使用75％酒精消毒。使用自来水将无菌蛭石湿润混匀并分装入盆(调节湿度为80％-90％)，蛭石量控制在育苗盆2/3处，保持土面平整。挑选出豆粒饱满且无裂痕的大豆种子播种于盆钵中，每盆均匀播种10粒。播种当天，将浓度为1
×
108cfu/ml的生防芽孢杆菌bs1-pbe-s-pspii1菌液均匀滴在种子上，每粒滴加2ml，使用湿润蛭石覆盖种子，置于25℃光暗交替的温室中分别培育7d、14d以及21d。样品取样方法如下：
[0115]
(1)根际土壤样本：大豆植株在温室中培育7d、14d、21d时，将大豆植株连同土壤小
et al,2014)，方法如下：
[0125]
1)提前将托盘器具使用75％酒精消毒，吸水纸干热灭菌；
[0126]
2)取培育了5d的黄化苗使用自来水冲洗干净，放置于托盘中备用，并喷施适量的无菌水保湿处理，接种过程中用黑色塑料袋覆盖黄化苗；
[0127]
3)将吸水纸剪成7.5cm
×
7.5cm大小，使用无菌水将吸水纸湿润且不滴水，将其平铺于托盘中并将黄化苗下胚轴放置在纸上；
[0128]
4)取即将长满菌丝的直径为7cm的平板，使用直径为1cm的无菌打孔器，沿着菌丝最外围打孔，获得菌丝块备用；
[0129]
5)使用灭菌牙签挑出菌丝块，将菌丝块贴于黄化苗下胚轴处(菌丝面向下)。卷起吸水纸，尽量使菌丝块紧贴下胚轴，过程中保持下胚轴无创伤；
[0130]
6)接种五株黄化苗后用锡箔纸将其包裹，露出子叶，在锡箔纸上贴上标签，标注所接病原菌名称、菌株编号、处理发酵液名称以及接种时间；
[0131]
7)接种时长根据菌株致病性而定。其中，拟茎点种腐病菌、刺腐霉接种时长为3d，立枯丝核菌接种5d，禾谷镰孢菌接种4d。最后将接种后的黄化苗放置于25℃培养箱，期间保持湿度为70％；
[0132]
8)黄化苗下胚轴接种病原菌后，测量其病斑长度并检测病原菌侵染的生物量。生物量测定方法为：以供试黄化苗的接种点为中心，上下各取3cm，将6cm的下胚轴组织切下，取3株组织使用液氮研磨并提取总基因组，所用试剂盒为qiagen公司植物基因组dna提取试剂盒。以植物组织dna为模版，分别用相应病原菌和大豆的actin引物(seq id no.17～seq id no.26)进行实时定量pcr，从而进行精确的生物量分析。定量结果以lb对照组的黄化苗中病原菌侵染量为参照。
[0133]
由于立枯丝核菌病斑形成不规则，本实验对立枯丝核菌致病力分级，分级标准参考曲苇苇(曲苇苇.水稻纹枯病菌对大豆的致病力及大豆品种对立枯丝核菌的抗性测定[d].南京农业大学,2021)。
[0134]
立枯丝核菌致病力分级标准：
[0135][0136]
立枯丝核菌dt6-7接种黄化苗下胚轴的侵染情况见图3。lb对照组和野生型bs1组黄化苗接种菌丝块后，其病斑均出现上下扩展且绕茎侵染，而bs1-pspii1处理组的黄化苗
发病情况明显下降。参照曲苇苇病情分级标准，bs1-pspii1菌液处理的黄化苗接种立枯丝核菌dt6-7后，其发病情况从2级下降到1级，详见下述立枯丝核菌致病力分级表。为了将立枯丝核菌dt6-7的侵染进行更准确的量化，每个处理取3株黄化苗，提取总基因组做相对生物量检测。相比之下，使用bs1-pspii1菌液处理黄化苗后，其组织中立枯丝核菌dt6-7的生物量明显降低，且与野生型bsl组、lb对照组存在显著性差异(图3的b部分)。
[0137]
立枯丝核菌致病力分级表：
[0138][0139]
禾谷镰孢菌ph-1接种黄化苗下胚轴的侵染情况见图4的a-c部分。经bs1-pspii1菌液处理的黄化苗下胚轴接种禾谷镰孢菌ph-1后，其接种部位病斑没有明显的上下扩展，且未绕茎侵染。而野生型bs1组、lb对照组的黄化苗接种处病斑出现上下扩展且绕茎侵染(图4的a和b部分)。对供试黄化苗进行相对生物量检测，与野生型bsl组、lb对照组相比，bs1-pspii1菌液处理后的黄化苗内禾谷镰孢菌ph-1生物量显著降低(图4的c部分)。
[0140]
刺腐霉2-2接种黄化苗下胚轴的侵染情况见图5的a-c部分。经bs1-pspii1菌液处理的黄化苗接种刺腐霉2-2后，其发病部位的病斑扩展不明显。而野生型bs1菌液与lb培养基处理的黄化苗接种刺腐霉2-2后，其病斑明显上下扩展且绕茎侵染，接种部位出现凹陷腐烂(图5的a和b部分)。对供试黄化苗进行相对生物量检测，发现bs1-pspii1菌液处理黄化苗后，该组织中刺腐霉2-2的生物量显著低于野生型bs1组和lb对照组(图5的c部分)。
[0141]
拟茎点种腐病菌xz1-s接种黄化苗下胚轴的侵染情况见图6的a-c部分，bs1-pspii1菌液处理黄化苗下胚轴并接种拟茎点种腐病菌xz1-s后，其接种部位病斑没有明显上下扩展，且病斑显著小于对照组(图6的a和b部分)。取供试黄化苗提取总基因组并做定量检测，发现经bs1-pspii1菌液处理的黄化苗，其组织中拟茎点种腐病菌xz1-s的生物量显著小于野生型bs1组和lb对照组(图6的c部分)。
[0142]
实施例5-bs1-pspii1在盆栽接种实验中对不同病原菌的防控效果
[0143]
本实施例所用转基因生防芽孢杆菌菌株为无标记整合的bs1-pspii1，以野生型bs1菌液和lb溶液作为对照，验证在盆栽接种实验中对不同病原菌的防控效果，其步骤简述如下：
[0144]
1)选用口径为12cm、高为11cm的盆钵，使用75％酒精消毒。
[0145]
2)使用无菌手术刀将长满菌丝的培养基切成0.5cm
×
0.5cm的小块，取自来水将菌丝块和蛭石搅拌均匀，将混匀的蛭石分装入盆，蛭石量控制在育苗盆2/3处，保持土面平整。
[0146]
3)挑选出健康且豆粒饱满无裂痕的大豆种子，每盆均匀播种10粒。
[0147]
4)将浓度为1
×
108cfu/ml的生防芽孢杆菌bs1-pspii1菌液平均滴在种子上，每粒种子滴加2ml，使用少量的湿润蛭石覆盖种子。
[0148]
5)接种完毕后在盆身贴上标签，标明接种病原菌名称、处理的发酵液名称以及接种时间。放入25℃温室下光照培育，每日浇水，一周后再次灌根生防芽孢杆菌bs1-pspii1菌液，菌量如同第一次。待大豆种植3周后检测发病情况，统计病情指数。
[0149]
6)不同病原菌的拌菌量不同，其中刺腐霉、立枯丝核菌接种菌量为2个9cm直径的培养基，禾谷镰孢菌、拟茎点种腐病菌接种菌量为3个9cm直径的培养基。
[0150]
盆栽接种立枯丝核菌dt6-7的实验结果显示，与lb对照组、野生型bs1组相比，滴加了bs1-pspii1菌液的盆栽大豆出苗率和鲜重均显著提高，且植株长势较好(图7的a和c部分)。其中，bs1-pspii1处理组的大豆出苗率达73.33％、野生型bs1组出苗率为46.33％、而lb对照组大豆出苗率为43.33％(图7的b部分)。因此，生防芽孢杆菌bs1-pspii1能够提高大豆对立枯丝核菌dt6-7的抗性。
[0151]
根据盆栽接种禾谷镰孢菌ph-1的实验结果，在接种了禾谷镰孢菌ph-1的大豆盆栽中分别滴加lb溶液和bs1菌液，其大豆出苗率均为66.66％，而加入bs1-pspii1菌液后大豆的出苗率提高至83.33％(图8的b部分)。同时，滴加bs1-pspii1菌液的大豆植株鲜重显著高于野生型bs1组、lb对照组(图8的c部分)，且植株长势较好(图8的a部分)。因此，生防芽孢杆菌bs1-pspii1能够提高大豆对禾谷镰孢菌ph-1的抗性
[0152]
盆栽接种刺腐霉2-2的实验结果显示，bs1-pspii1菌液处理后的大豆鲜重有所提高，且与lb对照组存在显著性差异(图9的c部分)，且植株长势较好(图9的a部分)。lb对照组、野生型bs1处理组、bs1-pspii1处理组的大豆出苗率分别为36.66％、63.33％、83.33％，bs1-pspii1菌液处理后的大豆出苗率提高了47％(图9的b部分)。由此可见，生防芽孢杆菌bs1-pspii1能够提高大豆对刺腐霉2-2的抗性。
[0153]
为了更清楚地检测生防芽孢杆菌bs1-pspii1对拟茎点种腐病菌的防效，选择了强致病力的拟茎点种腐病菌dt3-3用于盆栽接种。盆栽实验结果显示，盆栽接种拟茎点种腐病菌dt3-3并滴加lb培养基和野生型bs1菌液的大豆出苗率分别为43.33％、56.66％，而在土壤中滴加bs1-pspii1菌液能显著提高大豆种子的出苗率，其出苗率为76.66％(图10的b部分)。此外，处理了bs1-pspii1菌液的大豆植株鲜重明显高于野生型bs1组和lb对照组(图10的c部分)，且植株长势较好(图10的a部分)。因此，生防芽孢杆菌bs1-pspii1能够增强大豆对拟茎点种腐病菌的抗性。
[0154]
实施例6-bs1-pspii1对大豆根腐病的田间防控效果
[0155]
本实施例在大田体系进一步考量bs1-pspii1的防效，其步骤简述如下：
[0156]
1)实验地点及主要材料
[0157]
实验地点：南京市溧水区南京农业大学白马基地。
[0158]
实验时间：2021年6月25日-2021年10月10日。
[0159]
生防菌株：转基因生防芽孢杆菌bs1-pspii1，对照菌株为野生型bs1。
[0160]
大豆品种：苏豆13。
[0161]
大豆病原菌：拟茎点种腐病菌phomapsis longicolla dt3-3。(拟茎点种腐病菌和禾谷镰刀菌均能导致大豆根腐病，但是拟茎点种腐病菌可随种子带菌进行传播，播种时接种后，对种子出苗等有严重危害；而禾谷镰孢菌接种一般对种子出苗影响不大，在生长一段时间后显症。)
[0162]
2)大豆拟茎点种腐病菌接种体的制备：在500ml的三角瓶装入125g高粱谷粒，加入蒸馏水浸泡一夜，沥干水分后在121℃高压下灭菌30min。冷却后，加入40ml蒸馏水再次高压灭菌30min。将接满菌丝的pda培养基切成小块接种到高粱培养基中，每个瓶中接种4个9cm直径的培养基菌量，使其均匀分布，置于25℃培养箱黑暗培养。每天将培养基震荡摇匀，使
菌丝均匀生长。待菌丝完全长满高粱米粒，将高粱取出，均匀的铺在牛皮纸上，自然阴干或28℃烘干。将烘干的高粱用研磨机磨碎成菌粉备用。
[0163]
3)试验设计与处理：实验设为2组，生防芽孢杆菌bs1-pspii1灌根组、bs1野生型对照组，每组均采用完全随机区组设计，3次重复(区组)。小区面积设为4平方米，10行区，行长1米，行距0.4米，株间距为0.1米。每穴播种4粒大豆种子，播种深度为3cm-5cm，每个小区播种100穴，密度为1.2万株/亩。所有处理播种时随种子播入拟茎点种腐病菌固体发酵粉8g，同时灌入浓度为od
600
＝1.0的生防芽孢杆菌bs1-pspii1发酵菌液，每穴用量为20ml，出苗后10d追加灌根1次。实验地四周设置保护行(区)，宽度不小于实验小区宽度。本实验使用野生型bs1菌液浇灌大豆作为对照。
[0164]
4)调查及统计
[0165]
防效调查：于大豆苗期(大豆播种35d左右)观察大豆长势，并在每个小区内随机选择5点，每点调查20株，测量株高。
[0166]
产量调查：于大豆生长100d左右，在各小区内随机选择5点进行调查，每点调查20株大豆植株，统计其果荚数、百粒重、亩产指标。
[0167]
根据大豆苗期的田间调查结果显示(图11的a和b部分)。种植大豆30d后，灌根了bs1-pspii1发酵液的大豆植株株高为88.55cm，bs1对照组为59.75cm。bs1-pspii1处理组的大豆植株株高明显高于对照组，且植株长势较好。
[0168]
大豆种植100d后对其产量进行调查。调查结果显示，在土壤中灌入bs1-pspii1菌液，能使大豆的单株荚数从77.5荚增加到93.71荚(图11的c部分)。而在百粒重的调查结果中，bs1-pspii1处理组的大豆百粒重与对照组没有显著性差异(图11的d部分)。对于产量，bs1-pspii1处理组的大豆亩产为120.3kg，而对照组亩产为81.4kg(图11的e部分)。由此可见，生防芽孢杆菌bs1-pspii1对由拟茎点种腐病菌引起的大豆根腐病具较好的生防效果。
[0169]
由上述实施例可知，本发明利用黄化苗下胚轴接种和盆栽接种两个体系，评估bs1-pspii1对大豆根腐病主要病原菌的防治效果。结果显示，bs1-pspii1不仅能够减少大豆主要病原菌对黄化苗的侵染，还能提高大豆植株对病原菌的抗性。此外，植株生长的过程中受温度、湿度、光照、人为等诸多因素影响。因此，在大田体系进一步考量bs1-pspii1的防效，更贴合大豆实际生产中的防治要求，上述实施例分别于大豆苗期、大豆收获期对大豆防效及其产量进行调查统计：大豆苗期调查结果显示，经bs1-pspii1发酵液处理的大豆株高显著增高，从59.75cm提高到88.55cm；大豆收获期调查显示，在土壤中加入bs1-pspii1发酵液后，能使大豆的单株荚数从77.5荚增加到93.71荚；同时，bs1-pspii1还能显著提高大豆产量，经bs1-pspii1浇灌后的大豆亩产可达120.3kg，相比对照组提高了38.9kg，生防芽孢杆菌bs1-pspii1对大豆根腐病具较好的生防效果。
[0170]
以上所述仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书及图示内容所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围。