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一种显花植物株型相关基因及其编码蛋白与应用
技术领域
本发明涉及生物工程领域中一种显花植物株型相关基因及其编码蛋白与应用，特别涉及拟南芥的一种株型相关基因及其编码蛋白与应用。
背景技术
人类一直对形形色色的植物形态是如何形成的具有浓厚的兴趣。近年来的分子生物学和发育生物学的研究表明植物的茎干系统在植物多种形态的发生中起着重要的作用。茎干系统的形态建成起始于一个小小的初生茎端分生组织(SAM)，在胚胎形成时期它就已经出现，植物的主轴由它形成。种子萌发后又出现一些分生组织，它们形成各种分枝，这些分生组织何时发育、何处发育，对每种植物来说是不尽相同的。各种分生组织一起活动，形成了千姿百态的植物形态，尽管后天的环境因素会起一些影响，但是各种植物的株型是先天遗传因素决定的。
在被子植物中，侧向枝条大多是由腋生分生组织产生的。它的发育有两个主要阶段：腋生分生组织在叶腋中形成以及随后腋芽的生长。在许多植物中，包括模式植物拟南芥，腋生分生组织的生长是被初生花序所抑制的，这种现象通常被称作顶端优势。通常认为激素，特别是生长素和细胞分裂素，对于这一过程起着重要的作用。但是，具体的调控机制及遗传路径仍不清楚。近来，分离株型改变的突变体已经成为研究这种现象的有力手段。这些突变体可以被分为两类：在第一类中，突变并不影响腋生分生组织的早期发育，因此突变体中增加的分枝只是归因于侧芽的抑制被解除。拟南芥的生长素不敏感突变体axr1-12(Stirnberg et al.1999)及玉米突变体tb1(Doebleyet al.1997)就属于这种情况；在第二类中，突变影响了侧芽的早期发育，包括西红柿中的突变体blind，torosa，ls(Schmitz and Theres 1999)以及拟南芥REVOLUTA基因的功能丧失突变体，这个基因是顶端分生组织发育所必需的，且抑制腋生分生组织形成(Talbert et al.1995)。
目前，改变植物的株型，需要突变某个株型相关基因，还没有提到通过转入某个基因，使其异位表达就能改变植物的株型的例子。这种通过直接表达基因改变株型的方法在生产实践中更为简便可行。
发明创造内容
本发明的目的是提供一种株型相关基因及其编码蛋白。
本发明所提供的株型相关基因，名称为SAA(Sami Arabidopsis)，来源于哥伦比亚生态型的拟南芥(Columbia)，是下列核苷酸序列之一：
1)序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；
2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸；
3)与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
序列表中序列1的DNA序列由1244个碱基组成，该基因的读码框为自5’端第1到第1244位碱基，不含内含子。
拟南芥株型相关基因SAA编码蛋白SAA，是具有序列表中SEQ ID №：2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №：2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQID №：2衍生的蛋白质。
序列表中序列2氨基酸残基序列是由395个氨基酸残基组成的蛋白质。
含有本发明基因的表达载体及细胞系均属于本发明的保护范围。
利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的SAA基因的过量表达(overexpression)导入植物细胞，或者在其他植物中找到与SAA同源的基因异位表达，植物的株型就发生改变。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记或具有抗性的抗生素标记物。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物。本发明的基因可广泛用于改变植物株型的基因工程育种中。
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
图1为SAA基因异位表达后产生多片茎生叶的照片及对照野生型拟南芥茎生叶的照片
图2为基因异位表达后产生多个顶端分生组织的照片、对照及对照野生型拟南芥单个顶端分生组织的照片
图3为构建的表达载体的物理图谱
实施例中所用的植物材料：
野生型Columbia植株种植于营养土中。温室条件为16小时光照，8小时黑暗，22℃恒温。采集4周大的叶片用于提取基因组DNA。同时，采用去除初生花序一周后的植物做植物转化的材料。
实施例1、SAA地克隆及异位表达载体构建
www.TAIR.org网站得到at4g22390的序列，设计引物。
引物1：5’CAC-CAC-AAA-ATG-GCG-GAA-TGT-CCG-ACG-GAT-CTC 3’，
引物2：5’GAG-AAG-GGC-ATA-CCA-CCT-TTT-AGT-ACT-CTT-TGG 3’。
参照Paterson et al(1993)的方法提取拟南芥Columbia野生型基因组DNA作为以下PCR反应的模板：20μl体系，内含10×PCR缓冲液2μl，2.5mM dNTP mix1.6μl，5μM的引物1和引物2各2.0μl，pyrobest酶(Takara)0.1μl。在PE9600仪上扩增：94℃预变性3min，94℃ 1min，63℃ 1min，72℃ 1min，共计35个循环；72℃延伸7min，将获得的PCR产物，用E.Z.N.A.Cycle-Pure Kit纯化PCR产物，测序为SEQ ID №：1的DNA序列。将纯化产物克隆进入pENTR-TOPO载体中(invitrogen)，再利用LR重组体系(invirtrogen)重组进入植物表达载体pPTV中。
实施例2、异位表达植株的获得
将构建好的载体(如图3所示)用电击法转入农杆菌GV3101。挑一个阳性菌落于10ml含有Spe/Gen的YEB培养基中28℃培养24小时，以1∶500的比例接入400ml含有Spe/Gen的YEB培养基中继续在28℃培养至OD600达到0.8。4000g室温离心20分钟收集菌体，重新悬浮于渗透液(0.5xMS盐，1xB5有机生长物质，5％蔗糖，0.044μM 6BA，0.005％ Silwet L-77)至OD600达到0.8。将植物倒置浸入渗透液中，放入密闭容器中抽真空至0.05Mpa，放置5分钟后缓慢放气，取出植物继续正常培养。收集种子，干燥后铺在筛选平板上(0.5xMS盐，1xB5有机生长物质，1％蔗糖，0.8％琼脂糖，pH5.7，50mg/l庆大霉素)，4℃放置3天后，转入温室继续培养至抗性苗出现。将抗性苗转入营养土中继续培养，单棵收集种子再次铺在筛选平板上100粒种子，选取抗性苗/死亡苗比例为3∶1的平板上的抗性苗继续于营养土中培养，单棵收集种子再次铺在筛选平板上100粒种子，选取全部为抗性苗平板上的植株于营养土中继续培养。
实施例3、野生型拟南芥和异位表达拟南芥的表型观察结果
在相同培养条件下，同时播种野生型Columbia和纯合异位表达植株3个株系于营养土中。同野生型相比，转基因植株有以下表型：
1)次生花序抽苔早于初生花序
在正常条件下，野生型拟南芥的初生花序首先抽苔(图2A)，然后腋生花序开始抽苔，初生花序被人为除去后，次生花序才会继续发育并抽苔。但是异位表达植物的初生花序还未抽苔，次生花序就抽苔开花(图1C，D，E；图2B，C，D，E，F)。
2)腋生花序处的茎生叶产生莲座状叶
在正常条件下，野生型拟南芥的腋生花序叶只长一片(图1A，B)。但是异位表达植物的腋生花序叶却有若干不等的数目，株系1长出了2片腋生花序叶(图1D)，株系2长出了3片腋生花序叶(图1E)，株系3甚至长出8片腋生花序叶，形成又一个莲座状结构(图1B)。
3)出现多个顶端分生组织
在正常条件下，野生型拟南芥只有一个初生茎端分生组织，在胚的形态建成阶段就已形成，随着它的不断分裂分化形成植物的主轴(图2A)，其他的次生分生组织处于被抑制的状态。但是异位表达植物却同时出现多个大小相似的茎端分生组织。株系1有3个茎端分生组织(图2B，C)；株系2出现4个茎端分生组织(图2D，E，F)。
序列表
<160>2
<210>1
<211>1185
<212>DNA
<213>拟南芥属拟南芥(Arabidopsis thaliana(L.)HEYNH.)
<400>1
atggcggaat gtccgacgga tctcatcaac gaaatgtttc tccgtctcag agcaactacg 60
ctcgtaaagt gtcgcgtcct ctcaaagcct tgcttctctt tgatcgacag tcccgagttc 120
gtctcatctc atctccgtcg cagactcgaa acgggagaac atctcatgat cttactccga 180
ggacctcgtc ttctacgcac ggtggagcta gactcgcctg agaacgtctc cgacatccct 240
catcctttac aagccggagg ttttacagag gtttttggtt catttaacgg tgtcataggg 300
ttatgtaact ctcctgttga tctagcgatc tttaatcctt cgactaggaa gattcaccgt 360
ttaccaattg agccaattga tttcccagaa cgtgacatca ctcgtgagta tgtgttttac 420
ggtttgggtt atgattctgt gggcgatgac tttaaagttg tgaggattgt tcagtgtaag 480
cttaaagaag gtaaaaagaa atttccttgc cctgttgaag tcaaagtttt cagcttgaag 540
aagaattcgt ggaagagagt gtgtcttatg ttcgagtttc agattctttg gatttcgtac 600
tattaccatc tcttgcctcg tcgtggctat ggtgtggttg ttaacaacca tcttcactgg 660
attttgcctc gaaggcaggg agtcattgcc tttaacgcga taatcaaata tgatcttgcc 720
tctgatgaca ttggagtcct cagtttccca caggagcttt acattgaaga taacatggat 780
attggtgtgt tagatggctg cgtttgtttg atgtgttacg acgagtatag ccatgttgat 840
gtttgggttt tgaaagagta tgaggattat aaatcttgga ctaagctgta tagggtgccg 900
aaaccagaga gtgttgaatc ggttgagttc attagacctc tgatctgttc caaggacagg 960
agcaagattt tgctggagat taacaatgcg gcgaatctca tgtggtttga tttggaaagt 1020
cagagtctta caactgccgg aatagagtgt gatagttcat ttaccgcaga catcctcgtg 1080
agtagccttg ttttgggatg taaaggagat cctactcaag ctcagcgcag taaagatcag 1140
aagatgatgc caaagagtac taaaaggtgg tatgcccttc tctag 1185
<210>2
<211>395
<212>PRT
<213>拟南芥属拟南芥(Arabidopsis thaliana(L.)HEYNH.)
<400>2
Met Ala Glu Cys Pro Thr Asp Leu Ile Asn Glu Met Phe Leu Arg
1 5 10 15
Leu Arg Ala Thr Thr Leu Val Lys Cys Arg Val Leu Ser Lys Pro
20 25 30
Cys Phe Ser Leu Ile Asp Ser Pro Glu Phe Val Ser Ser His Leu
35 40 45
Arg Arg Arg Leu Glu Thr Gly Glu His Leu Met Ile Leu Leu Arg
50 55 60
Gly Pro Arg Leu Leu Arg Thr Val Glu Leu Asp Ser Pro Glu Asn
65 70 75
Val Ser Asp Ile Pro His Pro Leu Gln Ala Gly Gly Phe Thr Glu
80 85 90
Val Phe Gly Ser Phe Asn Gly Val Ile Gly Leu Cys Asn Ser Pro
95 100 105
Val Asp Leu Ala Ile Phe Asn Pro Ser Thr Arg Lys Ile His Arg
110 115 120
Leu Pro Ile Glu Pro Ile Asp Phe Pro Glu Arg Asp Ile Thr Arg
125 130 135
Glu Tyr Val Phe Tyr Gly Leu Gly Tyr Asp Ser Val Gly Asp Asp
140 145 150
Phe Lys Val Val Arg Ile Val Gln Cys Lys Leu Lys Glu Gly Lys
155 160 165
Lys Lys Phe Pro Cys Pro Val Glu Val Lys Val Phe Ser Leu Lys
170 175 180
Lys Asn Ser Trp Lys Arg Val Cys Leu Met Phe Glu Phe Gln Ile
185 190 195
Leu Trp Ile Ser Tyr Tyr Tyr His Leu Leu Pro Arg Arg Gly Tyr
200 205 210
Gly Val Val Val Asn Asn His Leu His Trp Ile Leu Pro Arg Arg
215 220 225
Gln Gly Val Ile Ala Phe Asn Ala Ile Ile Lys Tyr Asp Leu Ala
230 235 240
Ser Asp Asp Ile Gly Val Leu Ser Phe Pro Gln Glu Leu Tyr Ile
245 250 255
Glu Asp Asn Met Asp Ile Gly Val Leu Asp Gly Cys Val Cys Leu
260 265 270
Met Cys Tyr Asp Glu Tyr Ser His Val Asp Val Trp Val Leu Lys
275 280 285
Glu Tyr Glu Asp Tyr Lys Ser Trp Thr Lys Leu Tyr Arg Val Pro
290 295 300
Lys Pro Glu Ser Val Glu Ser Val Glu Phe Ile Arg Pro Leu Ile
305 310 315
Cys Ser Lys Asp Arg Ser Lys Ile Leu Leu Glu Ile Asn Asn Ala
320 325 330
Ala Asn Leu Met Trp Phe Asp Leu Glu Ser Gln Ser Leu Thr Thr
335 340 345
Ala Gly Ile Glu Cys Asp Ser Ser Phe Thr Ala Asp Ile Leu Val
350 355 360
Ser Ser Leu Val Leu Gly Cys Lys Gly Asp Pro Thr Gln Ala Gln
365 370 375
Arg Ser Lys Asp Gln Lys Met Met Pro Lys Ser Thr Lys Arg Trp
380 385 390
Tyr Ala Leu Leu ter
395
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