《普通植物病理学》实验指导
《普通植物病理学》实验指导
前言
《普通植物病理学实验指导》主要是配合《普通植物病理学》的教学内容,帮助学生理解和掌握《植物病理学》的基础理论,学习基本知识和基本技能的实验指导课。内容包括两大部分,一是植物病害的症状识别和病原生物的形态特征的观察,二是有关病害的侵染、流行和有关实验研究的基本技术。通过实验,培养和提高学生的观察、思考、分析的能力,锻炼学生独立操作的能力。
实验内容的安排旨在引导学生逐步进入植物病理学的领域,并为以后深入学习病原生物学、农业植物病理学、植物病害防治学和进一步开展试验研究打下坚实的基础。
目录
注意事项
1.每次实验前,学生要仔细预习实验指导,明确实验的目的与要求,了解实验内容和应注意的事项。
2.认真昕取老师指导,按要求逐项细心操作,爱护仪器设备,节约材料,损坏物品要及时报告。
3.遵守实验室纪律。实验时,不准在实验室内谈笑喧哗、吸烟与饮食,不要在室内来回走动,共同保持室内的整洁与安静。严禁以酒精灯互相点火,以确保安全。
4.认真记录实验的结果,绘图要精确,比例要适当,按时上交实验报告。
5.实验结束时,仪器用具要擦干净并放回原处,清除垃圾,实验室要打扫干净。
6.需要进一步培养观察的实验材料,应写好标签,注明实验内容、日期和试验人员姓名,以防混淆或丢失。
7.学生应准备绘图纸、报告纸、HB和2H的绘图铅笔、直尺、小刀和橡皮等绘图用具等。
实验一：植物病害症状观察
一、目的要求
认识各类病害对植物造成的为害，了解植物病害的种类及其多样性，初步掌握主要病害的症状表现及其特点，学会植物病害症状的描述,为今后病害的诊断奠定基础。
二、材料、试剂与仪器
按照植物病害的病状类型(变色、坏死、斑点、腐烂、畸形)和病征类型(粉状物、霉状物、点状物、菌核、溢脓等)的盒装标本、瓶装浸渍标本及新鲜标本。
各类症状的挂图、模型、多媒体课件等。
拨针、刀片、木板、酒精灯、火柴、裁玻片、盖玻片、纱布、乳盼油、二甲苯、显微镜、擦镜纸、吸水纸等。
三、内容与方法
（一）植物病害症状观察
植物病害的症状是植物患病后由于异常生理活动而发生在细胞和组织上的病理变化,最后表现为肉眼可见的形态变化。植物病害的症状可区别为两类不同性质的特征：病状和病征。
病状是一定的寄主植物和病原在一定外界条件的影响下相互作用结果的外部表现,是以各自的生理机能或特性为基础的。而每种生物的生理机能,都是在质上有特异性,并且是相对稳定的。病变,作为这种相互作用过程的结果,一般说其发展是定向的。病状作为病变过程的表现,其特征也是较稳定的和具有特异性的。这就是利用病状诊断植物病害的基础。
病征是由病原微生物的群体或器官着生在寄主表面所构成的。它更直接地暴露了病原物在质上的特点。如真菌子实体在寄主表面形成的霉层、黑点等。由植物病毒、植原体、许多病原细菌、非侵染性植物病害等无病征的表现。病征的出现与否和出现的明显程度,虽受环境条件的影响很大,但一经表现出来却是相当稳定的特征,所以根据病征能够正确地判定病害。
病状和病征，尤其是前者,作为诊断病害的依据也有其局限性。首先是许多植物病害常产生相似的病状,因此要从各方面的特点去综合判断；其次,植物常因作物品种的变化或受害器官的不同,而使病状有一定幅度的变化；第三,病害的发生发展是一个过程,有初期和后期,病状也随之而发展变化；第四,环境条件对病状和病征有一定的影响,尤其是湿度对病征的产生有显著地作用,加之发病后期病部往往会长出一些腐生菌的繁殖器官。因此,症状的稳定性和特异性只是相对的,要认识症状的特异性和变化的规律,在观察植物病害时,须认真地从症状的发展变化中去研究和掌握症状的特殊性。观察和采集植物病害标本,仔细地区别病征的那种微小的、似同而异的特征,这样才能正确地诊断病害。
1病状的观察
（1）斑点 观察玉米大斑病、棉花角斑病、大麦条纹病、大葱或大蒜紫斑病、番茄早疫病、十字花科霜霉病等标本。注意不同类型病害所表现病斑的形状、大小、颜色等的异同以及病斑上有无轮纹、花纹伴生,同时注意观察各类病斑上有无病征以及病征的特点。斑点类发生在叶、茎、果等部位,受病组织局部坏死,一般有明显的边缘。斑点中还可以伴生轮纹、花纹等特点。根据病斑的颜色、形状等特点而分为褐斑、黑斑、紫斑、角斑、条斑、大斑、小斑、胡麻斑、轮纹斑、网斑等多种类型。
（2）腐烂 观察甘薯黑斑病病薯、马铃薯环腐病病薯、柑橘溃疡病等病害标本,认识该类病害对植物所造成的为害,同时掌握这类病害的病状特点。腐烂类病状发生在植物的各个部位,由于组织分解的程度不同,有软腐、干腐之分。根据腐烂的部位,有根腐、基腐、茎腐、果腐、花腐等名称,还伴随有各种颜色变化的特点,如褐腐、白腐、黑腐等。
（3）.萎蔫 观察棉花、黄瓜等植物枯萎病、棉花和茄子黄萎病、玉米和茄科植物青枯病、马铃薯环腐病等标本。注意区别枯萎、黄萎、青枯等病状类型,必要时可以剖开病株茎秆观察维管束是否褐变。典型的萎蔫病状是植物根、茎的维管束组织受到破坏而发生的叶片或枝条萎垂现象,皮层组织完好,萎蔫病害常无外表的病征。植物受萎蔫菌侵染后,不一定都能引起萎蔫,发病初期有半边叶片、半个枝条萎垂的现象,但更常见的是全株性萎蔫。
提示：对于萎蔫类病害病状的观察应以新鲜标本为主,有条件时最好在田间进行,这类病害发生具有一定的地域性,观察时要注意其维管束组织的病变,干标本则失去了原有的特点。
（4）.变色 变色主要有两种类型。一种表现为黄化，是整个植株或叶片部分地或全部地均匀褪绿、变黄,或呈现其他的颜色。多数伴生有整株或部分的畸形。另一种为花叶，病株叶片色泽浓淡不均,深绿与浅绿部分相间夹杂,一般遍及全株,上部叶片较为显著,无病征表现。比较观察烟草花叶病、苹果花叶病、小麦黄矮病、瓜类、十字花科和茄科植物的病毒病病状，注意每一种病害的病状特点。
（5）.畸形 畸形类病状由不同组织、器官的病变，如叶片的膨肿、皱缩、小叶、蕨叶；果实的缩果及其他畸形；整个植株的徒长、矮缩；局部器官如花器和种子的退化变形和促进性的变态等。瘤、瘦、癌、丛枝和发根也是常见的畸形病状。观察桃缩叶病、十字花科根肿病、马铃薯癌肿病、果树根癌病、油菜白锈病、枣疯病、泡桐丛枝病、玉米黑粉病、小麦粒线虫病等。
2 病征的观察
（1）粉状物 借助扩大镜或实体解剖镜观察麦类锈病、十字花科白锈病、麦类白粉病、玉米黑粉病和麦类黑粉病等病害标本。注意粉状物的颜色、质地和着生状况等。
（2）霉状物 借助扩大镜或实体解剖镜观察黄瓜霜霉病、瓜类软腐病、柑橘青霉病、番茄灰霉病和番茄叶霉病等病害标本或瓶装标本。注意区别霜霉、黑霉、绵霉、青霉和灰霉等不同类型的霉状物。
（3）点状物 取小麦白粉病、瓜类炭疽病、棉花茎枯病、芹菜斑枯病、苹果树腐烂病和麦类赤霉病等病害标本,借助扩大镜或实体解剖镜观察。注意点状物是埋生、半埋生还是表生,以及在寄主表面的排列状况、颜色等。
（4）菌核 观察油菜菌核病等病害标本。注意菌核的大小、形状、颜色、质地等,并观察菌核萌发状况。
（5）溢脓 溢脓为细菌性病害特有的病征。观察十字花科细菌性软腐病、棉花角斑病和黄瓜角斑病等病害标本。注意溢脓的颜色、出现位置等。用剪刀将植物病组织剪成4mm2的小块,放于载玻片上,加一滴水,盖上盖玻片,在显微镜下观察或直接用载玻片对光观察喷菌现象。
四、实验作业与思考题
将植物病害症状的观察结果填入下表。
五、实验学时：2学时。
实验二 真菌一般形态观察
一、目的要求
通过观察，认识病原真菌的营养体及其变态,认识真菌的子实体、有性繁殖、无性繁殖产生的各种类型孢子。
二、仪器与用品
拨针、刀片、木板、酒精灯、火柴、裁玻片、盖玻片、纱布、乳酚油、二甲苯、显微镜、擦镜纸、吸水纸等。
三、实验材料
1. 瓜果腐霉病菌(Pytium aphanidermatum)
2. 立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)
3. 镰刀菌（fusarium）
4.小麦白粉病菌（Blumeria graminis）
5.大白菜霜霉病菌（Peronospora parasitica）
6. 甘薯软腐病菌（Rhizopus stolonifer）
7. 小核菌属（Sclerotium）
8. 苹果或甘薯紫纹羽病菌
9. 麦角病菌（Claviceps purpurea）
10. 疫霉菌（Phythophtora spp.）
11. 根霉菌（Rhizopus spp.）
12.毛霉菌（Mucor spp.）
13.犁头霉菌（Absidia spp.）
14. 玉米小斑病（Bipolaris maydis）
15.小麦白粉病〈无性世代〉〈Oidium monilioides〉
16.马铃薯早疫病〈Alternaria solani〉
17. 棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporium)
18. 桃缩叶病菌〈Taphrina deformans〉
19.小麦赤霉病菌〈Giberella zeae〉
20. 小麦腥黑穗病菌〈Tilletia caries〉
四、内容与方法
病原真菌的营养体即真菌营养生长阶段的结构统称为真菌的营养体。真菌典型的营养体是丝状体,少数为单细胞。
单根丝状的营养体称为菌丝,许多菌丝在一起就称为菌丝体。用挑针挑取在培养皿内的瓜果腐霉病菌(Pytium aphanidermatum)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、镰刀菌（fusarium）的菌丝体,用蒸馏水或乳酚油作浮载剂,制临时玻片镜检,观察菌丝隔膜的有无、菌丝体直径变化是否明显以及颜色有无差别等。
（一）真菌营养体的变态 病原真菌营养体在一定条件下可发生变态而形成特殊的结构,这些变态是真菌适应性的表现,其作用是抵抗不良的环境条件,有利于传播、固着吸收和繁殖。主要的变态有吸器、假根、菌核、子座以及根状菌索等。
1 吸器：吸器的形态有圆球状、棒状、裂片状、掌状、根状等。在示范镜下观察小麦白粉病菌（Blumeria graminis）和大白菜霜霉病菌（Peronospora parasitica）的吸器形态,也可用小镊子撕取病叶的表皮,制临时玻片放在显微镜下观察,注意吸器的形状和在细胞内的位置。
2假根：是由菌丝分化的根状分枝。从培养皿内的培养基上挑取甘薯软腐病菌（Rhizopus stolonifer）制片,镜检,观察在孢囊梗基部的假根。
3菌核：是菌丝纠结而成的坚固的颗粒状休眠体。观察小核菌属（Sclerotium）的菌核切片及标本,以及水稻和油菜上菌核的标本。比较两种菌核的大小、形状和色泽有何不同?
4根状菌索：许多菌丝体平行生长并纠结成绳索状,称为根状菌索。在示范镜下观察苹果或甘薯紫纹羽病菌的根状菌索。
5子座：由菌丝体或由菌丝体和寄主组织共同组成的着生子实体的垫状物。在子座上形成无性或有性孢子。在显微镜下观察麦角病菌（Claviceps purpurea）头状子座的切片，注意其内部结构与菌核的区别。
（二）病原真菌的繁殖体一一子实体真菌产生孢子的机构称为子实体。病原真菌孢子的形态特征是鉴定和分类学上重要的依据。真菌的孢子可分为无性孢子和有性孢子两类：
1无性孢子 指真菌无性繁殖过程中产生的各种孢子。这类孢子在形成过程中没有经过任何性结合的过程。
（1）游动孢子囊和游动孢子：鞭毛菌亚门真菌的无性繁殖器官是孢子囊。大多数鞭毛菌孢子囊可释放出具鞭毛、在水中能游动的孢子,即游动抱子,故其孢子囊又称为游动孢子囊。镜检疫霉菌（Phythophtora spp.）在水中的培养物,注意观察菌丝有无分隔、孢子囊的形态、游动孢子的形成以及释放过程,游动孢子休止后的形态,注意孢囊梗与菌丝有无区别。
（2）孢子囊和孢囊孢子：接合菌亚门真菌的无性繁殖器官是孢囊孢子。镜检根霉菌（Rhizopus spp.）、毛霉菌（Mucor spp.）、犁头霉菌（Absidia spp.）的孢子囊结构、孢囊孢子、孢囊梗、假根及匍匐丝。
（3）分生孢子：半知菌亚门真菌和子囊菌的无性世代繁殖时都可产生分生孢子。分生孢子的色泽、形态变化较大,从无色至深色、单孢到多抱,并具多种形态。分生孢子着生在分生孢子梗上,分生孢子梗有色或无色、散生或聚生,或着生在分生孢子盘或分生孢子器内。
采用挑、刮或切片的方法,观察玉米小斑病（Bipolaris maydis）、小麦白粉病〈无性世代〉〈Oidium monilioides〉、马铃薯早疫病〈Alternaria solani〉病害标本,注意观察其分生孢子的颜色,有隔或无隔,隔膜的类型及其形态，分生孢子梗的形态,是否分枝及分枝的类型、颜色、着生位置等,若着生在分生孢子盘或分生孢子器内,注意观察分生孢子盘或器的形态。
（4）厚壁孢子：又称厚垣孢子。由菌丝中个别细胞膨大、细胞壁加厚而形成的一种厚壁孢子。对不良环境的抵抗能力较强。
挑取棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporium)的培养物制片、镜检,观察厚垣抱子的形状、颜色和壁的厚度。
2 有性孢子 真菌有性生殖产生的孢子是由两个有亲和力的性细胞结合后发育形成的,包括卵孢子、接合孢子、子囊孢子和担孢子。.,
（1）卵孢子：是鞭毛菌亚门真菌产生的有性孢子,常由形态、大小不同的雌、雄性器官交配形成。卵孢子通常形成于藏卵器内,每个藏卵器内可包含1至多个卵孢子,其数目因真菌种类不同而异。
镜检谷子白发病菌卵孢子玻片标本。
观察藏卵器的形态、色泽、壁光滑或有饰纹,雄器形态及其位置,卵孢子形态,每个藏卵器内卵孢子的数目、卵孢子是否充满藏卵器。
（2）接合孢子：接合菌亚门真菌产生的有性孢子,由两个形状和大小相似的雌、雄配子囊结合而成。
观察毛霉〈Mucor sp.〉或梨头霉〈Absidiαsp.〉接合孢子的形状、表面的饰纹、色泽、配囊柄的形状,有无丝状附属物。
（3）子囊孢子：子囊菌亚门真菌的有性孢子,产生在子囊内。子囊孢子有色或无色、单孢或多孢,具多种形状。子囊通常棍棒状,有的近球状,散生或着生在一定形态的子囊果内。
观察桃缩叶病菌〈Taphrina deformans〉子囊孢子的形状、单细胞或多细胞、有色或无色。小麦全蚀病菌〈Gaeomanomices graminis〉子囊的形状,是否具双层子囊壁,子囊有无固定孔口，子囊果的类型,有闭囊壳、子囊壳、子囊盘或子囊腔。
（4）担孢子：担子菌亚门真菌产生的有性孢子。担孢子产生在担子上。观察小麦腥黑穗病菌〈Tilletia caries〉冬孢子萌发形成的担子及担孢子的形态。
五、实验作业
绘制有隔菌丝、无隔菌丝、各类无性孢子和有性孢子的形态图。
六、实验学时：2学时。
实验三 鞭毛菌亚门真菌形态及其所致病害症状观察
鞭毛菌亚门真菌是一类低等真菌，其中不少是水生的。它们的共同特征是无性繁殖时产生有鞭毛的游动孢子。根据菌体的形态和游动孢子鞭毛的特征分为根肿菌纲、壶菌纲、丝壶菌纲和卵菌纲。其中与植物病害关系较为密切的有根肿菌纲、壶菌纲、卵菌纲。
一、目的要求
了解鞭毛菌亚门中根肿菌纲、壶菌纲和卵菌纲真菌的主要形态特征,掌握与植物病害有关的重要属的形态特征、分类依据及所致病害的症状特点。同时,学习使用检索表来鉴定病菌,为分类鉴定打下初步基础。
二、仪器与用品
显微镜、幻灯机、技影仪、计算机及多媒体教学设备；载玻片、浮载剂(蒸馏水或乳酚油)、吸水纸、解剖刀、拨针、镊子、纱布、酒精灯、无菌水等。
三、实验材料
1. 芸薹根肿菌(Plasmodiophora brassicae)。
2. 玉蜀黍节壶菌(Physoderma maydis)。
3.瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)。
4. 致病疫霉(Phytophthora infenstans)。
5.禾生指梗霉(Sclerospora graminis) 。
6. 葡萄霜霉病菌(Plasmopara viticola)。
7. 寄生霜霉(Peronospora parasitica)。
8. 瓜类霜霉病菌(Pseudoperonospora cubensis)。
9. 莴苣盘梗霉(Bremia lactucae)。
10. 十字花科白锈病菌(Albugo candida)。
以上病害标本或新鲜材料、挂图、病原菌永久玻片,多媒体教学课件(包括幻灯片、录像带、光盘等影像资料)以及水霉、腐霉和疫霉游动孢子形成与释放的录相带等。
四、观察内容和方法
(一)根肿菌纲
芸薹根肿菌(Physoderma maydis) 取甘蓝根肿菌切片,镜检切片中的病原菌。有的寄主细胞内可见到许多堆集在一起的鱼籽状颗粒,是病菌的休眠孢子。休眠孢子近球形。
(二)壶菌纲
玉蜀黍节壶菌(Physoderma maydis) 观察由玉蜀泰节壶菌引起的玉米褐斑病标本。用拨针挑取受害病组织内呈黄色粉末状物制成临时玻片,或对病组织作徒手切片,镜检可见到许多金黄色扁球状的休眠孢子。休眠孢子椭圆形,一面扁平有盖。
(三)卵菌纲
1 腐霉属(Pythium) 观察瓜果的腐烂病病果上的白色菌丝体,将生长旺盛的小块菌丝体移至清水中培养24~48h,菌丝顶端即形成大量游动孢子囊,用针挑取在清水中培养过的菌丝,观察腐霉菌的游动孢子囊。游动孢子囊丝状、姜瓣状或球状等,顶生或间生,无特殊分化的孢囊梗。孢子囊不脱落,萌发时在其顶端产生一管状物,原生质经管状物排出而形成泡囊。游动孢子产生在泡囊内。
2 疫霉属(Phytophthora) 取马铃薯或番茄晚疫病标本制片观察。孢囊梗2~3支成丛,自气孔伸出,假轴状分枝,小梗基部膨大,多次产生孢子囊,使孢子囊梗上部呈节状； 孢子囊近球状、卵形或梨形等,具乳突。
3霜霉属(Peronospora) 取十字花科植物(油菜、白菜等)的霜霉病标本从叶背面刮取霉层观察。孢囊梗二叉状锐角分枝,末端尖锐。
按照寄生霜霉的观察方法,选取禾生指梗霉、葡萄霜霉病菌、瓜类霜霉病菌、莴苣盘梗霉等材料,对照下列检索表,制片观察各种霜霉病的病原菌或观察病菌永久玻片标本,掌握霜霉科几个常见属的主要形态特征。
霜霉科主要属的检索表
1. 孢囊梗粗壮,上部为重复2~3次的不规则二叉分枝…………指梗霉属（Sclerospora）
孢囊梗较细………………………………………………………………………………2
2. 孢囊梗单轴分校,小轴与主轴成直角,分枝末端平钝…………单轴霉属(Plasmopara)
孢囊梗呈现锐角二叉分枝………………………………………………………………3
3.分枝两侧不对称,顶端尖锐……………………………假霜霉属(Pseudoperonospora)
分枝两侧对称……………………………………………………………………………4
4.分枝顶端尖细……………………………………………………霜霉属(Peronospora)
分枝顶部膨大,呈盘状,具3~4个指状周生小梗……………………盘梗霉属(Bremia)
4 白锈菌属(Albugo) 镜检十字花科白锈病菌组织切片,或取以上病叶徒手切片制成临时玻片镜检。孢囊梗平行排列在寄主表皮下,短棍棒形, 孢子囊串生。白锈菌为害症状是在寄主表面产生乳白色或粉状的病斑,这是病菌在寄主表皮下形成的孢子囊堆,白色粉状物是成熟的孢子囊。
五、实验作业与思考题
1.鞭毛菌亚门真菌的共同特征和分类依据是什么?
2.以营养体、无性繁殖、有性生殖来比较鞭毛菌亚门三个纲的区别。
3.观察十字花科蔬菜根肿病菌、玉米褐斑病菌、水霉菌或绵霉菌,绘休眠孢子囊或游动孢子囊图。
4.绘瓜果腐霉病菌、马铃薯晚疫病菌或十字花科蔬菜白锈病菌孢囊梗、孢子囊、卵孢子图。
5.绘瓜类霜霉病菌、莴苣霜霉病菌、葡萄霜霉病菌孢囊梗、孢子囊图。
6.详绘大白菜霜霉病和粟白发病的病原形态图(包括无性繁殖和有性生殖)
7.卵菌纲真菌有哪些特点?结合它们的生物学特性、说明本纲真菌进化的情况。
六、实验学时：3学时。
实验四 接合菌亚门真菌形态及其所致病害症状观察
接合菌亚门真菌的共同特征是有性生殖产生接合孢子。大多数是腐生的,少数可以引起农产品的腐烂。接合菌营养体为发达的无隔菌丝体,无性繁殖产生具细胞壁的孢囊孢子,有性生殖产生接合孢子。 孢子囊的形态、孢囊孢子释放以及寄生性等是重要的分类依据。
一 目的要求
通过实验掌握接合菌的一般形态及其所致病害的症状类型。
二仪器与用品
显微镜、幻灯机、投影仪、计算机及多媒体教学设备；灭菌培养皿、载玻片、盖玻片、浮载剂（蒸馏水或乳酚油）、吸水纸、解剖刀、拨针、镊子等。
三、观察内容和方法
(一) 甘薯软腐病（Rhizopus stolonifer）症状观察
受害甘薯变软腐烂,有时散发出酒味,病薯表面长出白色、灰色至黑色毛状物。仔细观察,能见到白色菌丝体中有许多小黑点。小黑点是病菌的孢子囊。
用针挑取霉层制片、镜检,观察孢子囊、孢囊孢子、孢囊梗及囊轴、假根的形态。
(二) 匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)培养物的镜检观察
用拨针仔细地从培养的匍枝根霉菌中挑取少许连有培养基的培养物,制成临时玻片,在低倍镜下检查,或者用实体解剖镜直接观察培养皿上的菌体。观察菌丝的形态和具有分枝的孢囊梗及其基部的假根, 孢囊梗之间有匍枝状的菌丝相连,在孢囊梗基部有深入寄主细胞或基质中分枝状的假根。在每一个孢囊梗的顶端产生一个圆球状的孢子囊。用高倍镜观察孢子囊内部的构造,在未成熟的孢子囊内,往往只有大量的小颗粒体,接近成熟的或成熟的孢子囊内则充满了许多褐色圆形的孢囊孢子。孢子囊壁破裂后, 孢子散出,露出锣锤形的囊轴。
(三) 接合孢子观察
取根霉属(Rhizopus)、毛霉属(Mucor)和犁头霉属(Absidia)接合孢子玻片标本观察,并注意原配子囊、配囊柄及配子囊的发育特点。成熟的接合孢子深褐色,表面粗糙。犁头霉菌的接合孢子在配子囊柄的着生处有附属丝。注意观察配囊柄的形状及大小。
四、实验作业和思考题
1.接合菌亚门真菌的主要特点是什么?与鞭毛菌亚门有何区别?
2.绘匍枝根霉菌孢子囊、孢囊梗、孢囊孢子、假根、匍匐菌丝和接合孢子形态图。
五、实验学时：1学时。
实验五：子囊菌亚门真菌形态及其所致病害症状观察
子囊菌是一类高等真菌。菌丝体一般都很发达,有隔膜,具分枝,有的菌丝体可以形成菌核、子座等机构。子囊菌的共同特点是有性生殖产生子囊和子囊孢子。子囊菌所致病害的种类很多,其中许多是重要的经济作物病害。子囊菌亚门分纲的主要依据是子囊果及子实层的有无、子囊果的类型、子囊的特征等。据此分6个纲：半子囊菌纲、不整囊菌纲、核菌纲、腔菌纲、盘菌纲和虫囊菌纲。
一 目的要求
通过实验,了解子囊菌亚门各个纲病原菌的主要形态特征,掌握子囊菌中与植物病害有关的重要属的形态特征、分类依据及所致主要病害的症状特点。
二 仪器与用晶
显微镜、幻灯机、投影仪、计算机及多媒体教学设备；载玻片、盖玻片、浮载剂(蒸馏水或乳酚油)、吸水纸、解剖刀、拨针、镊子、纱布、刀片、擦镜纸、无菌水等。
三、实验材料
1桃缩叶病(Taphrina deformans)。
2散囊菌(Eurotium sp.)。
3禾白粉病菌(Blumeria graminis)。
4向日葵白粉病菌(Erysiphe cichoracearum)。
5瓜白粉病菌(Sphaerotheca fuliginea)。
6桃白粉病菌(Podosphaera tridactyla )。
7洋槐白粉病菌(Microphaera sp.)
8桑里白粉病菌(Phyllactinia corylea)。
9葡萄白粉病菌(Uncinula necator)。
10甘薯黑斑病菌(ceratocystis fimbriata)。
11玉蜀黍赤霉菌(Gibberella zeae)。
12苹果树腐烂病菌(Valsa mali)。
13小麦全蚀病菌(Gaeumannomyces graminis)。
14黑麦麦角菌(Claviceps purpurea)。
15竹多腔菌(Myriangium haraeanum)。
16葱叶枯病菌（Mycrosphaerella sp.)。
17核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)。
以上病害标本或新鲜材料、挂图、病原菌永久玻片、多媒体教学课件（包括幻灯片、录像带、光盘等影像资料）。
四、观察内容和方法
(一)半子囊菌纲
外囊菌属(Taphrina)。取桃缩叶病材料作临时玻片,在显微镜下检查。可看见子囊在寄主叶片的表皮下排列成栅栏状,形成无包被的子囊层,子囊下有足胞,常含孢子4~8个。子囊圆筒形,近球形或椭圆形。
(二)不整囊菌纲
散囊菌属(Eurotium)。观察示范镜下散囊菌的闭囊壳、子囊或散在闭囊壳内的子囊孢子。闭囊壳壁薄,只有2~3层细胞构成。子囊孢子单胞、近圆形。
(三)核菌纲
1.白粉菌目 是专性寄生菌。白粉菌侵染植物可引起多种植物的白粉病。白粉菌菌丝表生，在寄主体表扩展蔓延。一般在叶部引起褪绿或黄色斑,以后叶面出现白色或灰白色的粉状物,即白粉菌的无性繁殖形成的分生孢子。生长后期,在病部形成许多黑色小颗粒。这些小黑点是白粉菌的闭囊壳。闭囊壳有附属丝,附属丝呈丝状,其形态因种而异。闭囊壳内子囊数目也不一样,一至多个。附属丝的形状和子囊数目的多少是分属的依据。
选取小麦白粉病、向日葵白粉病、瓜白粉病、桃白粉病、洋槐白粉病、桑里白粉病、葡萄白粉病等不同材料。在实体解剖镜下观察闭囊壳及附属丝的轮廓及形态。挑取闭囊壳作临时玻片，在显微镜下检查；注意闭囊壳的形状、有无孔口、闭囊壳表面附属丝的形状和着生部位。然后轻轻挤压盖玻片,使闭囊壳破裂。观察闭囊壳内的子囊,数数是单子囊还是多子囊。
对照下列检索表,观察各种白粉病的病原菌永久玻片或标本,掌握白粉菌科几个常见属的主要形态特征及所致病害症状。
白粉菌主要属检索表：
1.闭囊壳内单个子囊……………………………………………………………………2
闭囊壳内多个子囊……………………………………………………………………3
2.附属丝菌丝状…………………………………………………单囊壳属(Sphaerotheca)
附属丝刚直,较粗,顶端二叉状重复分枝,分校末端螺旋状卷曲…叉丝单囊壳属(Podosphaera)
3.附属丝菌丝状…………………………………………………………………………4
附属丝非菌丝状………………………………………………………………………5
4.附属丝发育不良,较短-………………………………………布氏白粉菌属(Blumeria)
附属丝较长………………………………………………………白粉菌属(Erysiphe)
5.附属丝刚直,基部膨大,顶端尖锐……………………………球针壳属(Phyllactinia)
附属丝基部不膨大……………………………………………………………………6
6.附属丝粗,刚直,顶端二叉状重复分枝,分枝末端卷曲………叉丝壳属(Microphaera)
附属丝不分枝,顶端卷曲…………………………………………钩丝壳属(Uncinula)
2.球壳菌目
(1)长嗦壳属(ceratocystis) 观察甘薯黑斑病菌培养物,挑取病菌灰白色物中间深褐色或黑色毛刺状小点,观察病菌的子囊壳。子囊壳深色、球形,有长颈,开口处有须状物,称口须。轻压盖玻片将子囊壳压破,成熟的子囊孢子头盔状,子囊壁早期胶化消解。
(2)赤霉属(Gibberella) 取培养在麦粒上的玉蜀泰赤霉菌子囊壳,制成临时玻片在显微镜下观察。子囊壳蓝色或紫色,散生或聚生。子囊孢子多个细胞,梭形。
(3)黑腐皮壳属(Valsa) 取苹果树腐烂病菌切片镜检,子囊壳埋生在子座内,有长颈伸出子座。子囊孢子单细胞,香蕉形。
(4)顶囊壳属(Gaeumannomyces) 观察小麦全蚀病害标本,注意病株基部根系生长不良,茎基部叶鞘枯腐,叶鞘内有黑色小颗粒状物,即病菌的子囊壳。取含有子囊壳叶鞘做切片,置显微镜下观察子囊壳形态,子囊壳顶端有短喙,子囊孢子细线状,多细胞。
(5)麦角菌属(Claviceps) 取黑麦麦角菌切片,置显微镜下观察。头状子座内壁周围有瓶状子囊壳,子囊壳开口向外。子囊壳内有子囊和子囊孢子。子囊细长,子囊孢子线形。
(四)腔菌纲
1.多腔菌属(Myriangium) 取竹多腔菌切片置显微镜下观察,可见到很发达的子囊座组织。子囊球形,单生,子囊孢子有纵横隔膜,砖格状。
2.球腔菌属(Mycosphaerella ) 取葱叶枯病菌切片,置显微镜下观察。单腔多子囊，子囊圆柱形至棍棒形,有双层壁。子囊初期束生,后平行排列；子囊孢子椭圆形,双胞。
3.格抱腔菌属(Pleospora) 取首宿轮纹病病菌切片,置显微镜下观察。子囊孢子长圆形或卵圆形,砖格状(多细胞,有纵横分隔)。
(五)盘菌纲
核盘菌属(Sclerotinia) 取油菜菌核病菌子囊盘切片,置显微镜下观察。子囊盘具长柄,子囊孢子椭圆形或纺锤形。观察油莱菌核病症状及菌核萌发标本。菌核球形至豆瓣形,鼠粪状,一般生子囊盘4~5个。菌核上形成的子是盘具长柄。
五、实验作业与思考题
1.子囊菌亚门各纲的主要特征是什么?
2.绘外囊菌属和散囊菌属的形态图。
3.白粉属和单丝壳属、叉丝壳属和叉丝单囊壳属的主要区别是什么
4.绘白粉属、叉丝单囊壳属、球针壳属、钩丝壳属的形态图。
5.绘赤霉属、多腔菌属、核盘菌属形态图。
6.子囊菌有性繁殖体的病征类型和特点是什么?
六、实验学时：4学时。
实验六 担子菌亚真菌形态及其所致病害症状观察
担子菌亚门真菌一般称作担子菌,是真菌中最高等的。其共同特征是有性生殖产生担子和担孢子。担子菌亚门的分纲依据是担子果的有无。担子果的发育类型可分为三个纲：冬孢菌纲、层菌纲、腹菌纲。与植物病害关系密切的是冬孢菌纲。根据担子的来源及特征,担孢子的数目及位置,冬孢菌纲分为锈菌目和黑粉菌目。锈菌的分类主要依据冬孢子的形态、排列和萌发的方式。而黑粉菌主要依据冬孢子的萌发方式、孢子的分隔、排列及其大小、形状及是否有不孕细胞等进行分类。
一、目的要求
通过实验了解担子菌亚门冬孢菌纲主要病原菌的形态特征,掌握锈菌目和黑粉菌目中与植物病害有关的重要属的形态特征、分类依据及所致主要病害的症状特点。
二、仪器与用品
显微镜、幻灯机、技影仪、计算机及多媒体教学设备；灭菌培养皿、载玻片、盖玻片、浮载剂(蒸馏水或乳酚油)、吸水纸、解剖刀、挑针、镊子、纱布、蒸馆水滴瓶、刀片、擦镜纸、酒精灯、无菌水、PDA培养基等。
三、实验材料
1.锈菌目
(1) 菜豆锈菌(Uromyces appendiculatus)。
(2) 禾柄锈菌(Puccinia graminis f.sp. tritici)
(3) 小麦叶锈菌(Puccinia recondita)。
(4) 小麦条锈菌(Puccinia striiformis)。
(5) 梨胶锈菌(Gymnosporagium haraeanum)。
(6) 蔷薇多胞锈菌(Phragmidium rosae－multiflorae)
(7) 亚麻锈菌(Melampsora lini )。
(8) 花椒鞘锈菌(Coleosporium xanthoxyli)
(9) 松枥锈菌(Cronartium quercum)
(10) 枣层锈菌(Phakopsora ziziyphi－vulgaria)
2.黑粉菌目
(1) 小麦散黑粉菌(Ustilago tritici )
(2) 玉蜀黍黑粉菌(U.maydis)。
(3) 丝孢堆黑粉菌(Sporisorium reilianum)。
(4) 高粱坚孢堆黑粉菌(Sporisorium sorghi)。
(5) 高粱散孢堆黑粉菌(Sporisorium crtentum)
(6) 小麦网腥黑穗菌(Tilletia caries)。
(7) 小麦光腥黑穗菌(Tilletia tritici)。
(8) 稻尾孢黑粉菌(Neovossia horrida)
(9) 稻叶黑粉菌(Entyloma oryzae)。
(10) 小麦条黑粉菌(Urocystis tritici)。
以上病菌引起的病害标本或新鲜材料、挂图、病原菌永久玻片和病菌的PDA培养物；多媒体教学课件(包括幻灯片、录像带、光盘等影像资料)。
四、观察内容和方法
{一}冬孢子萌发试验
冬孢菌纲不同类型冬孢子萌发方法各不相同，几种常见的冬孢子的萌发方法如下：
1.小麦网腥黑穗菌和光腥黑穗菌 将冬孢子撒在保湿器内用1%硝酸钙液润湿的滤纸上,在17～22℃下培养,每天于日光灯下照射4h,3d后检查萌发情况。
2.小麦条锈病菌 取带冬孢子病叶在0.5%~1%柠檬酸中浸15min,再放于两层潮湿的滤纸之间,于－2～－5℃下冷冻5d后,挑取冬孢子置于水滴内,在冰箱内(4℃)保存48h即可萌发。
(二)锈菌目
1.单胞锈菌属(Uromyces) 观察菜豆锈病标本,挑取冬孢子制成玻片观察。冬孢子具柄,单细胞。
2.柄锈菌属(Puccinia) 观察小麦轩锈病、小麦叶锈病或小麦条锈病标本,冬孢子堆黑色。将有冬孢子堆的寄主叶片组织切下,制切片于显微镜下观察。冬孢子有一隔膜,分隔处稍缝缩,柄不胶化。
3.胶锈菌属(Gymnosporagium ) 从用水浸泡过的胶锈菌冬孢子角上用挑针挑取冬孢子制片观察。冬孢子双胞,分隔处不缝缩或稍缝缩。柄丝状,很长,含胶质。
4.多胞锈属(Phragmidium) 挑取攻瑰锈病组织上的冬孢子,制片观察。冬孢子多细胞,通常下部膨大易胶化。
5.栅锈菌属(Melampsora) 取亚麻锈菌病组织制作徒手切片观察。冬孢子无柄,集成壳状或垫状,冬孢子仅侧面结合成一层,埋生于寄主表皮下。
6.鞘锈菌属(Coleosporium) 取花椒锈病组织制作切片观察。冬孢子堆生于叶背或排列成环状,圆形黄褐色。冬孢子无柄,集成壳状或垫状的孢子粒,集生于寄主表皮层下。
7.柱锈菌属(Cronartium) 取马尾松锈病标本制片观察。冬孢子堆生于叶背,毛状,冬孢子梭形。
8.层锈菌属(Phakopsora) 取枣锈病组织制作切片观察。冬孢子堆呈黑色,冬孢子排成2~4层,长椭圆形或多角形。
(三)黑粉菌目
1.黑粉菌属(Ustilago) 孢子堆外露,很少由寄主组织长期包裹。担子分隔,担孢子生在担子每一细胞的侧面。
挑取小麦散黑粉(穗)病组织上的冬孢子制成玻片观察。冬孢子球形或近球形。另取冬孢子萌发切片观察。冬孢子萌发产生4个细胞的担子,从担子的不同细胞分别生出丝状分枝,不产生担孢子。
挑取玉米瘤黑粉病组织上的冬孢子制片观察,冬孢子球形至卵形。另取冬孢子萌发切片观察。冬孢子萌发时产生有隔担子,担子顶端或分隔处侧生梭形的担孢子。
2.孢堆黑粉菌属(Spoisorium) 冬孢子堆周围有膜(不孕菌丝),中央有寄主组织,担子分隔,担孢子生在担子每一细胞的侧面。
挑取高粱丝黑穗病组织上的冬孢子制片观察。冬孢子卵圆形或球形,暗褐色,有时混生有不孕细胞。不孕细胞无色透明。
取高粱坚粒黑穗病标本观察。孢子堆生于子房中。冬孢子多圆形或近圆形,不孕细胞长圆形至近圆形。
取高粱散粒黑穗病标本观察。冬孢子堆有由菌丝体组成的灰白色被膜。冬孢子球形,分散。
3.腥黑粉菌属(Tilletia) 取小麦网腥黑穗病或小麦光腥黑穗病标本观察。冬孢子单生, 孢子堆成熟时呈粉末状,冬孢子较小。孢子堆生于子房内,外包果皮,内部充满黑紫色粉状子包子,有腥味。
4.尾孢黑粉菌属(Neovossia) 取水稻粒黑穗病标本挑片观察。孢子堆寄生于子房内,产生黑粉。挑取黑粉制片,显微镜下可见, 孢子球形,常有一部分未成熟的透明孢子。
5.叶黑粉菌属(Entyloma) 取水稻叶黑粉病标本,切片观察。孢子堆生于叶的两面,圆形至长条形。孢子多角形，结合紧密。取萌发的担孢予玻片观察,担孢子顶生于担子上,纺锤形。
6.条黑粉菌属(Urocystis) 取小麦秤黑粉病标本,制片观察。一至多个厚垣孢子集结成牢固的孢子球, 孢子球外有淡色而小的不孕细胞包围。
五、实验作业
1.绘黑粉菌属、腥黑粉菌属和条黑粉菌属冬孢子形态图。
2.绘腥黑粉菌属冬孢子萌发图。
3.绘柄锈菌属、单胞锈菌属、栅锈菌属和胶锈菌属冬孢子形态图。
实验七 半知菌亚门真菌形态及其所致病害症状观察
半知菌亚门真菌的种类很多,其中不少是植物病害的重要病原菌。半知菌的分类主要是根据无性阶段的形态特征,包括分生孢子的形态、载孢体的类型、产孢方式等。半知菌亚门分3个纲。
芽孢纲：营养体为单细胞或发育程度不同的菌丝体或假菌丝,通过产生芽孢子繁殖；
丝孢纲：营养体是发达的菌丝体,分生抱予不产生在分生孢子盘或分生孢子器内；
腔孢纲：分生孢子产生在分生孢子盘或分生孢子器内。
与植物病害关系比较密切的是丝孢纲和腔孢纲。
一、目的要求
通过实验认识半知菌子实体的类型及重要致病菌属的形态特征,掌握常见植物病原半知菌属的鉴别特征。
二、仪器与用品
显微镜、幻灯机、投影仪、计算机及多媒体教学设备；灭菌培养皿、载玻片、盖玻片、浮载剂(蒸馏水或乳酚油)、吸水纸、解剖刀、挑针、镊子、纱布、刀片、酒精灯、放大镜、恒温箱、方木块、剪刀等。
三、实验材料
半知菌引起的病害标本或新鲜材料、挂图、病原菌永久玻片和病菌的PDA培养物；多媒体教学课件(包括幻灯片、录像带、光盘等影像资料)。
1.丝孢纲
(1) 立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)。
(2) 齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)。
(3) 稻梨孢(Pyricularia oryzae)。
(4) 玉蜀黍平脐蠕孢(Bipolaris maydis)。
(5) 玉米大斑突脐蠕孢(Exerohilum turcicum)。
(6) 大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)。
(7) 芸薹链格孢(Alternaria brassicae)。
(8) 球座尾孢(Cercospora personata)。
(9) 梨黑星孢(Fusicladium virescens)。
(10) 灰葡萄孢(Botrytis cinerea)。
(11) 粉红聚端孢(Trichothehecium roseum)。
(12) 意大利青霉(Penicillium italicum)。
(13) 褐孢霉(Fulvia fulva)。
(14) 尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporium)。
2.腔孢纲
(1) 胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)。
(2) 葡萄痂圆孢(Sphaceloma ampelinum)。
(3) 梨壳囊孢(Cytospora carphosperma)。
(4) 芹菜生壳针孢(Septoria apiicola)。
(5) 高粱生壳二孢(Ascochyta sorghina)。
(6) 甜菜蛇眼病菌(Phoma beta )。
(7) 梨叶点霉(Phyllosticta pyrina)。
四、观察内容和方法
(一)丝孢纲
1.丝核菌属(Rhizoctonia) 观察预先培养的棉花立枯病菌或小麦纹枯病菌菌落。菌核褐色至黑褐色。挑取菌丝制片观察。菌丝粗壮,菌丝分校呈直角,分隔处常缢缩。
2.小核菌属(Sclerotium) 取花生白绢病或小麦、大豆、棉花、烟草等白绢病菌标本或培养观察。病菌菌丝白色绢丝状；菌核圆形至长圆形,褐色至黑色,表面暗色,中心无色,组织致密,干时极硬,彼此无菌丝相连。
3.梨孢属(Pyricularia) 取水稻稻瘟病标本,用挑针挑取病叶上的霉状物制片观察。分生孢子梗细长,淡褐色,顶部以合轴式延伸,呈屈膝状,分生孢子多胞,梨形。
4.平脐蠕孢属(Bipolaris) 取玉米小斑病叶,挑取病斑上的霉层观察。分生孢子梗单生或丛生,上部呈屈膝状弯曲；分生孢子蠕虫形或长椭圆形,,多胞,脐点稍微突出,平截状。
5.突脐蠕孢属(Exerohilum) 取玉米大斑病病叶,用挑针挑或刮取其上的黑色霉状物制片,置显微镜下观察。其分生孢子梗暗色,具分隔,一般少分枝,上部呈屈膝状。分生孢子棱形,多胞,脐点明显突出于基细胞外部。
提示：观察时注意与平脐蠕孢属的区别,主要在于其脐点是否突出。
6.镰孢属(Fusarium) 取瓜类枯萎病菌培养观察。气生菌丝白色,绒毛状,在PDA培养基上底部呈淡黄色或淡紫色。拨针挑取培养物制片观察。小型分生孢子量大,无色,卵圆形,单胞,偶尔双胞；大型分生孢子无色,纺锤形或镰刀形，1~5个隔膜,基部有时有一显著的突起,称足胞。
提示：有时可观察到厚垣孢子,顶生或间生于菌丝体上。
7.轮枝孢属(Verticillium) 取培养好的棉花黄萎病菌平皿,直接放于显微镜载物台上观察。其分生孢子梗细长,直立,具分隔,呈轮状分枝。分生孢子梗呈直角分枝。分生孢子单胞,生于分枝顶端。
提示：培养菌用的培养基不宜太厚,以便透射光能穿透,平皿放到载物台上小心移动,使视野覆盖菌落边缘,这样才能找到理想的轮状分枝结构。
8.链格孢属(Alternaria) 取白菜黑斑病病叶,用挑针挑取病斑上的黑色霉状物制片,显微镜下观察。分生孢子长棍棒状,具纵横分隔,呈砖格状,顶端有一长条形喙状细胞。
9.尾孢属(Cercospora). 取芹菜早疫病(斑点病)病叶,挑取霉层制片观察。分生孢子梗不分枝或少有分枝。分生孢子单生,鞭状,具多数分隔。
10黑星孢属(Fusicladium) 挑取梨黑星病叶上的煤烟状霉层制片观察。分生孢子梗暗色,顶部稍屈曲, 孢痕明显。分生孢子淡褐色,1~2胞,瓜子形。
提示:注意分生孢子梗的孢痕,在显微镜透射光源照射下呈现亮点。
11.葡萄孢属(Botrytis) 取黄瓜或番茄灰霉病标本,挑取其上的灰霉状物制片观察。分生孢子梗顶端分校,末端膨大,并产生小突起,其上着生多数分生抱子,外观呈葡萄穗状。
12.聚端孢属(Trichothehecium) 取棉铃红粉病标本,挑取霉层制片观察。分生孢子梗直立,少分隔或不分隔。分生孢子元色,双胞,洋梨形,常以基部交错相连的方式在孢子梗顶端聚集成孢子链。
13.青霉属(Penicillium ) 取柑桶青霉病标本或病菌培养,挑片观察。分生孢子梗集结成束,“扫帚状”分枝,分枝末端为瓶状小梗,分生孢子着生在瓶状小梗上。
14.褐孢霉属(Fulvia) 取番茄叶霉病标本,挑取霉层制片显微镜下观察。分生孢子梗基部细,上部粗。分生孢子串生, 孢子链常分枝,并有芽状突起。
(二)腔孢纲
1.炭疽菌属(Colletotrichum) 取苹果炭瘟病标本制片观察。分生孢子盘埋生于寄主表皮下,垫状无刚毛,成熟后突破表皮,分生孢子梗平行排列成一层。分生孢子单胞。
提示：切片时最好用新鲜采集的标本,如果标本干燥可用蒸馏水湿润一下再进行切片,切出的丝条越薄越好,若用乳酚油作浮载剂效果更好。
2.痂圆孢属(Sphaceloma) 取葡萄黑症病标本,切片观察。孢子梗排列紧密,自盘状子座基部产生。分生孢子盘黑色。分生孢子梗极短,紧密排列于子座上。分生孢子无色单胞,中部缝缩,内含1~2个油球。
3壳囊孢属(Cytospora) 取梨树腐烂病病树皮,徒手切片观察。子座暗褐色,多腔室,似迷宫状。分生孢子器着生于瘤状子座组织内。分生孢子香蕉形,与胶体物质混合,吸水膨胀后连同孢子自孔口挤出，成为分生孢子角。
4.壳针孢属(Septoria) 取芹菜斑枯病病叶,做徒手切片观察。分生孢子器球形。分生孢无色,针状,多胞。
提示：分生孢子的横隔须经染色后才能观察清楚；切片操作的最后一步即将切片放到载物台上时再加水浮载样晶,这样立即观察可看到分生孢子自孔口向外喷射的现象。
5.壳二孢属(Ascochyta) 取高粱粗斑病标本制作切片观察。分生孢子器黑色,分生孢子器扁球形。分生孢子圆筒形,双胞无色。
6.茎点霉属(Phoma) 取甜菜蛇眼病标本,切片观察。分生孢子器着生于寄主表皮下,呈轮纹状排列,球形,分生孢子无色,单胞,卵圆形。
7.叶点霉属(Phyllosticta) 多寄生于叶上。取苹果灰斑病叶,制作徒手切片观察,分生孢子器球形,有孔口。分生孢子极小(小于15μm),卵圆形。
提示：叶点霉属的形态与茎点霉属很难区分,应结合发病部位。
五、实验作业
1.绘梨孢属、尾孢属和镰孢霉属的分生孢子梗和分生孢子形态图。
2.绘炭疽菌属、盘二孢属的分生孢子盘和分生孢子形态图。
3.绘茎点霉属、壳二孢属和壳囊孢属分生孢子器和分生孢子形态图。
实验八 植物病原原核生物病害的症状观察及病害诊断
植物病原原核生物是仅次于真菌和病毒的第三大类病原生物。植物病原原核生物病害的发生和分布非常普遍,几乎每种作物上都有一种或几种原核生物病害。有些原核生物病害为害严重,如茄科植物青枯病、大白菜软腐病、果树根癌病和水稻白叶枯病等。有些原核生物病害在国内尚未发现,被列为对外检疫对象,禁止传入,如梨火疫病、玉米细菌性枯萎病、椰子致死黄化病和菜豆细菌性萎蔫病等。有些原核生物病害在国内区域性发生,是对内检疫对象,如柑橘黄龙病和水稻细菌性条斑病等。
植物病原原核生物引起的病害症状类型很多,有变色、坏死、腐烂、萎蔫和畸形等。一种病害可以有几种症状相继出现或同时出现,同一症状又可以由多种原核生物引起。
原核生物病害的症状表现复杂,类型多样,同时也各具特点。诊断者要善于掌握病害的典型症状,抓住同一寄主上各病害的区别,结合镜检,做出症状诊断。
一、目的要求
通过对各种病害标本及病害照片的观察,熟悉植物原核生物病害的主要症状特点,掌握常规诊断技术。
二、材料、试剂与仪器
1.植物病原原核生物病害标本及消耗性病害材料
(1) 水稻白叶枯病(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)。
(2) 水稻细菌性条斑病(X.oryzae pv.oryzicola)。
(3) 柑橘溃疡病(X.competrstris pv. citri)。
(4) 甘蓝黑腐病(X. competrstris pv. campestris)。
(5) 桃细菌性穿孔病(X. competrstris pv. pruni)。
(6) 黄瓜细菌性角斑病(Pseudomonas syringae pv. lachrymans)。
(7) 桑疫病(P.syringae pv. mori)。
(8) 白菜软腐病(Erwinia subsp. carotovora)。
(9) 番茄青枯病(Burkholderia solanacearum)。
(10) 马铃薯环腐病(Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicum)
(11) 果树根癌病(Agrobacterium tumefanciens).
(12) 苹果发根病(A.rhizogenes)。
(13) 马铃薯疮痂病(Streptomyces scalbies)。
(14) 柑橘黄龙病(Candidatus liberobacter asiaticum)。
(15) 枣疯病(Jujube witches broom disease)。
(16) 泡桐丛枝病(Paulownia witches broom disease)。
2.仪器与用品
显微镜、放大镜、载玻片、盖玻片、浮载剂(蒸馏水或乳酚油)、纱布、刀片、剪刀、挑针等。
三、实验操作
(一)植物原核生物病害症状观察
1.坏死 观察水稻白叶枯病、水稻细菌性条斑病、柑桶溃疡病、甘蓝黑腐病、桃细菌性穿孔病、黄瓜角斑病、桑疫病、马铃薯疮痂病的病状与病征。病原细菌通过侵害薄壁细胞组织,引起细胞和组织的局部死亡,形成局部病斑。病斑形状、颜色、大小各异,有圆斑、条斑、角斑等。有的病斑在后期会自动脱落形成穿孔，有的病斑发展成溃疡斑,有的病斑木栓化形成疮痂。细菌病害的病斑在初期呈水渍状半透明,有的病斑上还有淡黄色或灰白色的菌脓，干燥后形成鱼籽状黏附在病斑上。
2.腐烂 幼嫩、柔软多汁的组织被细菌为害后,细胞间果胶质分解,细胞离析,组织解体造成寄主器官呈软腐状,并常伴有恶臭气味。观察大白菜软腐病、水稻茎腐病的症状,注意腐烂部位、颜色变化,辨识特殊臭味。挑取少量新鲜腐烂组织制成玻片,镜检,可见寄主植物细胞单个游离的情况。
3.萎蔫 细菌侵染寄主植物维管束组织,破坏导管的供水能力,引起植物枝叶萎垂,初期为暂时性萎蔫,几天后变为永久性萎蔫。番茄青枯病菌从根部伤口侵入,然后在维管束组织中蔓延形成萎蔫。马铃薯环腐病菌侵染块茎维管束组织而引起薯块环状腐烂。萎蔫症状一般在生长后期表现特别明显。注意观察纵剖茎秆和横切薯块的维管束变色情况。
4.畸形 原核生物侵染寄主植物薄壁细胞,引起寄主细胞过度分裂和细胞体积增大,促使局部组织过度发育形成肿瘤。观察葡萄根癌病,根颈处形成似愈伤组织的瘤状物,褐色,表面粗糙,内部组织常木质化,较坚硬;观察苹果发根病，根部或嫁接处产生大量的畸形细根；观察泡桐丛枝病、甘薯丛枝病,腋芽大量萌发,侧枝丛生；观察枣疯病,芽大量萌发呈丛枝状,花器退化,尊片、花瓣变成叶片状。
5.变色 原核生物侵染植物可引起典型的变色症状。观察柑橘黄龙病,叶片褪绿,黄化、黄绿相间呈斑驳或花叶、叶脉变黄成黄色网络状；观察枣疯病,该病除表现畸形外,叶片黄化。
(二)原核生物所致植物病害的诊断
1.症状诊断 常见的植物病原原核生物不同的属引起的病害症状有所不同：土壤杆菌属(Agrobacterium)主要引起肿瘤、发根等畸形症状；假单胞杆菌属(Pseudomonas)、黄单胞杆菌属(Xanthomonas)主要引起叶斑、叶枯等坏死症状；软腐症状则主要是由欧文氏菌属(Erwinia)为害造成的。而萎蔫症状可由几个属的病原引起,如布克氏菌属(Burkholderia)、棒形杆菌属(Clavibacter)、欧文氏菌属、黄单胞杆菌属等；植原体属(Phytoplasma)主要引起植株黄化、丛枝、丛根、花变叶等。
细菌病害的病征简单,在病斑上可见到污白色、黄白色或黄色的菌脓。一些菌脓干燥后呈鱼籽状菌胶珠。腐烂型的细菌病害产生特殊臭味,且无菌丝,可与真菌引起的腐烂区别。萎焉型的细菌病害,横切病株茎基部,稍加挤压可见污白色菌脓溢出,并且维管束变褐。也可将一段病叶或病秆插在湿砂中,经保温保湿后,在上方切口处可见混浊的菌脓溢出。有无菌脓溢出是细菌性萎蔫同真菌性萎蔫的最大区别。
2.喷菌现象 观察许多细菌性叶斑病的病斑上无菌脓、菌胶珠,诊断上比较可靠的方法是在显微镜下检查病组织中是否有大量细菌存在。剪取一小块新鲜的病健交界处组织,平放在载玻片上,加蒸馏水一滴，盖上盖玻片后,立即在低倍显微镜下观察。如果是细菌病害,则在切口处可看到大量细菌涌出,呈云雾状,积聚于切口处。在田间,用放大镜或肉眼对光观察玻片标本,也能看到云雾状细菌溢出。
提示：所取病组织在4mm2较合适,尽量避开叶片主脉,盖上盖玻片后如果蒸馏水未将材料完全浸泡,可从盖玻片边缘再加一小滴蒸馏水。在显微镜下观察时,光线要弱,如果光线太强,即便有大量细菌涌出,也看不见。材料必须是新鲜病斑,否则,寄主组织中滋生的腐生细菌会导致误诊。
3病组织切片观察 取一块病组织作徒手切片,将切片放入载玻片上的一滴蒸馏水中,盖上盖玻片镜检。如果是侵染维管束组织的细菌病害,可见大量细菌堵塞导管(如水稻白叶枯病)；如果是侵染薄壁细胞织，可看到薄壁细胞间或细胞内大量细菌的存在(如柑橘溃疡病)。 但是细菌引起的根癌病、发根病,由于在薄壁细胞组织中的细菌量极少,不易检查。
五、实验作业
1.记录植物原核生物病害标本的主要症状特点。
2.诊断2~3种病害标本,初步判断是否是细菌病害,
六、实验学时：1学时。
实验九 植物病原细菌形态观察
一、目的要求
学习并初步掌握革兰氏染色法和鞭毛染色法；了解革兰氏染色和鞭毛染色的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。
二、基本原理
1 革兰氏染色 革兰氏染色是丹麦病理学家Christain Gram在1884年创立的,是细菌学中最重要的鉴别染色法。革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性菌(G+菌)和革兰氏阴性菌(G-菌),这是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。实际上,当用结晶紫初染后,所有细菌都被染成蓝紫色。再用碘液媒染,它能与结晶紫结合成结晶紫－腆的复合物,增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂(乙醇或丙酮)处理时,两类细菌的脱色效果是不同的。革兰氏阳性菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成,壁厚、类脂含量低,用乙醇或丙酮脱色时,细胞壁脱水,使肽聚糖层的网状结构孔径缩小、透性降低,从而使结晶紫一腆的复合物不易被洗脱而保留在细胞内,经脱色和复染后仍保留蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同,由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高,所以经脱色处理后,类脂被乙醇或丙酮溶解,细胞壁透性增大,使结晶紫一腆的复合物比较容易被洗脱出来,用红色复染剂复染后,细胞被染成红色。
2.鞭毛染色 鞭毛是细菌的运动“器官”,细菌是否具有鞭毛,以及鞭毛着生的位置和数目是细菌的一项重要鉴别特征。细菌的鞭毛纤细,直径通常为0.02~0.03μm,不能用光学显微镜直接观察到。要用普通光学显微镜观察细菌的鞭毛,必须用鞭毛染色法。
鞭毛染色是先用媒染剂处理,使它沉积在鞭毛上,使鞭毛直径加粗,然后再进行染色。
三、材料、试剂与仪器
（一）试验用菌种
(1)甘蓝黑腐病菌（X. competrstris pv. campestris）。
(2)茄青枯病菌(Burkholderia solanacearum)。
(3)白菜软腐病菌(Erwinia subsp. carotovora)。
(4)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
菌种必须在使用前5d移植,临用前18~36h再转管一次,以保证菌体处于分裂活跃时期。
(二)革兰氏染液
1.结晶紫草酸铵染剂
溶液I结晶紫2.0g 95%酒精20.0ml。
溶液Ⅱ草酸铵0.8g 蒸馏水80.0ml。
混合溶液I和Ⅱ,滤纸过滤,贮存于试剂瓶中,24h后使用。
2.鲁戈尔碘液
碘1.0g 碘化钾2.0g 蒸馏水300.0ml。
将碘和碘化钾放入同一研钵中研磨,研磨时缓慢加水直至碘和碘化钾溶解,然后加水稀释到300m1,装入棕色试剂瓶,放暗处备用。
3.复染剂 先配制原液,用蒸馏水稀释后为复染剂。
原液 番红O(藏红)2.5g 95%酒精100.0ml。
复染剂 原液10.0ml 蒸馏水90.0ml。
提示：配制好的染液不可超过一年,特别是鲁戈尔碘液要装在棕色试剂瓶中,置于暗处保存,否则会褪色无效。
(三)鞭毛染色液
西萨一基尔(Ceseres-Gill)法染液
(1)媒染剂：单宁酸10.0g AlCl3·6H20 18.Og ZnC1210.0g 碱性品红1.5g 60%酒精40.0ml。
在研钵中盛10ml酒精,加入以上各药品,充分研磨混合后,再加入剩下的酒精。使用前用蒸馏水稀释2倍,染色时经滤纸过滤,滤液直接滴在涂片上。
(2)苯酚品红染液：
溶液I 碱性品红0.3g 95%酒精10.0ml。
溶液Ⅱ 苯酚(结晶)5.0g 蒸馏水95.0ml。
混合溶液I和溶液Ⅱ,装入试剂瓶备用。
(四)载玻片的准备及其他用具和试剂
最好选用新的载玻片,首先将新载玻片用清水冲洗,去掉载玻片上的灰尘杂质。然后将载玻片一张一张地放入浓铬酸洗液中浸泡4~5d,捞出后清水冲洗。再放人洗涤液溶液中,煮沸1h,在自来水下用脱脂棉擦洗玻片至完全冲掉洗涤液,再用蒸馏水洗净后,浸泡在95%酒精中备用。也可在新的脱脂纱布上晾干,保存在密闭的容器中备用。
酒精灯、火柴、吸水纸、洗瓶、香柏油、小玻璃漏斗、铁架、移菌环、牙签、无菌试管、试管架、3%KOH溶液。
四、实验操作
(一)革兰氏染色
(1)用无菌蒸馏水将培养18～24h的菌种配制菌悬液。
(2)在洁净无脂的载玻片上,用移菌环取菌液涂片,在同一张载玻片的一端(2/3处)分别涂上枯草芽抱杆菌(G+菌对照)、甘蓝黑腐病菌(G-菌对照)和茄青枯病菌(待测菌),晾干后在酒精灯火焰上通过两次,固定涂片,并写上标记。
(3)滴加结晶紫草酸镀(覆盖三条菌膜)，染色1min。
(4)水洗数秒钟,甩去载玻片上的水,用吸水纸吸干(或用鲁戈尔碘液冲余下的水)。
(5)滴加鲁戈尔碘液,染色1min。
(6)水洗数秒钟,甩去载玻片上的水，用吸水纸吸干。
(7)将载玻片倾斜,在白色背景下,从上端滴下酒精,使其顺着整个载玻片均匀地向下流,直至流下的酒精无色。褪色时间不超过30s。
(8)水洗数秒钟,甩去载玻片上的水,用吸水纸吸干。
(9)滴加番红O复染10s。
(10)水洗,吸干,镜检。革兰氏阳性菌呈紫色或蓝黑色,革兰氏阴性菌呈红色。
提示：注意使用活跃生长期的培养物,菌龄18~24h。菌悬液不能太浓,涂片不宜过厚,以免脱色不完全造成假阳性。火焰固定涂片,以载玻片不烫手为宜；酒精脱色是革兰氏染色的关键环节。脱色不足,阴性菌被误染成阳性菌；脱色过度,阳性菌可误染为阴性菌。脱色时间一般20~30s,不超过30s；为避免实验错误,用已知革兰氏阳性菌和阴性菌作对照,与待测菌同涂在一张载玻片上。当对照菌呈现正确的颜色,实验成功；否则,失败。
此外,还有氢氧化钾溶解试验,其结果与革兰氏染色反应一致,可作为参考方法。原理是KOH溶液可破坏革兰氏阴性菌的细胞壁,从而释放出原生质等黏性物质,使菌悬液变得黏稠;而革兰氏阳性菌的细胞壁则不被KOH所破坏,加入KOH后菌悬液不变黏稠。
实验操作时,将3%KOH溶液一小滴点在干净载玻片上,用移菌环取一环待测细菌菌液放入KOH液滴中,用牙签搅动片刻,再将菌液向上提起,观察提起的时候有无黏丝。如果有,是阴性菌;如果无则是阳性菌。
(二)鞭毛染色
西萨一基尔(Ceseres-Gill)染色法：
(1)用无菌蒸馏水将培养18~24h的菌种配制菌悬液(如果室温过低,可将已加入无菌水的菌种试管放入26℃温箱中静置20~30min)。
(2)用移菌环取菌液3~6环,分别点在洁净无脂的载玻片上。倾斜载玻井,自然风干(一张玻片上可同时鉴定两个菌)。
(3)媒染剂经滤纸过滤直接滴在载片上,处理5~7min。
(4)用水洗去媒染剂,甩去载玻片上的余水,自然风干。
(5)滴加苯酚品红染剂染5min。
(6)水洗去染液,自然干燥后油镜下镜检,菌体和鞭毛呈红色。
五、实验作业与思考题
1.记载染色结果,并绘简图。
2.讨论染色成功与失败的体会。
六、实验学时：2时。
实验十、植物病毒的接种与传染
植物病毒不能主动侵入寄主,但病毒病仍然十分普遍,这是与病毒侵染的机制和传播的有效性密切相关的。实验室中常用病株汁液作为人工接种的材料,可有效地将大多数病毒接种到试验材料上。但有些病毒则不能用汁液接种,必须用介体来传染,例如昆虫介体等,它们以不同的方式来传播病毒。不同的病毒有不同的传播方式,因此这也是病毒鉴定时的重要性状之一。
一、目的要求
通过人工摩擦接种,学习常规的汁液接种法和关键技术；通过对一套鉴别寄主的接种,了解鉴别寄主的鉴别作用、筛选作用和定量作用。
通过蚜虫或叶蝉的传毒实验，学习利用介体传播病毒的技术,从而加深对介体作用的认识。
有些病毒材料在研磨过程中易被氧化而钝化,因此还要加入少量的缓冲液,常用的是0.01M的磷酸盐缓冲液〈PBS,pH7.2〉,有时还加有Na2SO3或巯基乙醇（0.1%）(Mercaptoethanol)、抗坏血酸等还原剂以保护病毒。
二、材料和用具
植物病毒标样1号、2号、3号；
4～5叶期的心叶烟、普通烟、苋色黎、千日红、蚕豆和菜豆苗等,幼苗生长健壮,无病虫害。
肥皂或肥皂水、消毒的研钵与研棒、洗瓶、金刚砂或硅藻土（600目）、0.05M pH7.2的磷酸盐缓冲液(PBS)、塑料标签、铅笔、小毛笔、养虫笼、养虫罩,拟除虫菊品、喷雾器、指形管、塑料封口膜、洗瓶。
蚜虫〈必须是不带任何病毒的健康的无翅蚜,尽量不用有翅蚜〉：桃赤蚜〈Myzuspersicae〉、豆蚜〈A.crassivora〉和甘蓝蚜(Brevicorgne brassicae)等。
三、内容与方法
（一）人工摩擦接种
1因为每个人的手指甲和手指上都可能污染有多种病毒，因此在做实验之前都应先用肥皂水洗手,将病毒钝化和洗除干净,以防污染。
2供试植物也面如有污物，应先用自来水冲洗干净,晾于后均匀地撒上摩擦。
3剪取小块病毒病样本的叶片放在研钵中,加入少量磷酸盐缓冲液,研碎成糊状。
4用食指或研棒蘸取少量病叶汁液,在供接种的植物叶面轻抹2～3次,注意摩擦要轻,不要来回擦,应单向地从叶基向叶尖方向抹,接种叶用手掌或手指托住,不要用力过大,更不能弄破叶片。
5接种后即可用洗瓶将叶面的病汁液和摩擦剂冲洗干净。注意：一定要将摩擦剂冲洗掉,否则将影响日后的症状观察。
6 用铅笔在接种过的叶片尖端刺一小孔作为接种叶的记号。
7 各组要用一盆植物做空白对照，即用缓冲液代替病叶汁液做接种。
8 用铅笔写好标签后插入花盆中，标签要注明：病毒标样代号，寄主符号，接种日期和接种者。例如T1，心叶烟，日/月，张/刘。
9 接种过的植物要放在有光的温室中培养，每2～3天观察记载一次发病情况，尤其要注意接种叶和新叶上的症状是否相同？
10 为了提高接种的成功率，通常将待接种的植物幼苗放在黑暗处8～10小时后再接种。
11 症状记载的常用符号：
枯斑：ll；坏死：N；褪绿：Ch；斑驳：Mo；花叶：M；环斑：RS；脉明：Vc；蕨叶：F。
如：接种叶枯斑，新叶无症状可记载为ll/－。
（二） 蚜虫饲毒接种 能传播病毒的媒介物很多，以刺吸式口器的昆虫为主，其次是真菌等。
1 从隔离的养虫笼中收集无翅蚜，用振落法使蚜虫跌落到大培养皿或白瓷盘中，用毛笔沾取蚜虫收集在指形管或三角瓶中,纱布封口,在叫右温箱叫4～6小时。
2将病毒病叶摘下放在大培养皿中。
3取出饥饿的扬虫,抖落在病叶上,蜘虫稍经爬行后立即停住取食〈头朝下,尾部朝上〉,也可将螃虫直接挑放在病株上饲毒。
4经取食5～10分钟或特定的时间后,用毛笔轻触蚜虫的尾部,使蚜虫拔出口针,然后用毛笔将蚜虫挑起,移放到待接种植株的心叶片上，并用养虫罩罩住；也可将蚜虫挑放在特制的接虫纱罩中,然后将纱罩夹在供接种植株上部嫩叶的背面。植株放在温室中培养。
5 24小时后喷撒杀虫剂杀死蚜虫,移去养虫罩或接虫纱罩。
6植物放在温室中培养。、
7定期观察记载接种和新叶上的症状。
四、实验作业与思考题
1列表记载接种毒源在各鉴别寄主上的症状及发病过程,查阅有关资料,分析核对你接种样本可能是哪一种病毒?
2为何一定要先洗手,后接种?
3如何测定病毒/螃虫是持久性传播还是非持久性传播〈提出试验方案来〉?
4为何要用缓冲液?为何要有作空白对照的植株?
5有些病态人工接种不发病，可能有哪些原因?
六、实验学时：2学时。
实验十一 植物病毒粒体的生物学测定
一、目的要求
掌握测定TMV病汁液物理稳定性状的方法。
二、基本原理
不同的病毒对外界条件的稳定性不同。对汁液传染的病毒,可通过病株汁液的体外性状(钝化温度、稀释限点和体外存活期)来测定。这些性状虽易受各种因素影响,但仍可作为区别不同病毒的依据之一,而且对病毒混合侵染的分离及制定病毒提纯方案具有参考价值。
三、材料、试剂与仪器
1.材料 TMV病株(烟草)、健康心叶烟植株。
2.仪器与用品 消毒研钵、纱布、薄壁小试管(口径相同)、烧杯、水浴锅、温度计、医用药棉、1ml及10ml吸管和试管等。
四、实验操作
(一) 钝化温度测定
(1) 取TMV病叶在研钵中磨碎,双层纱布过滤压汁，用1ml吸管将病汁分别装入5个薄壁小试管中,分别标记温度。
(2) 将恒温水浴锅调至95℃,90℃,80℃,70℃,60℃五种温度。
(3) 从高温至低温,依顺序每个温度放入一盛有TMV汁液的薄壁小试管,处理10min,取出立即置冷水中冷却。
(4) 按常规方法汁液摩擦接种各处理病汁液于心叶烟上。每处理接种1株心叶烟3张平展叶,挂牌标记。
(5) 第3～5d观察接种叶的枯斑出现情况,记录结果,失去产生枯斑能力的某一处理温度即为该病毒的钝化温度。
(二)释限点的测定
(1) 取6个试管,分别标记稀释度10－1,10－2,10－3,10－4,10－5,10－6。
(2) 用10ml吸管吸取蒸馆水,每试管9ml。
(3) 吸取1ml TMV汁液,放入10-1的试管中,往返吸吐3次,得1:10稀释液。
(4) 从10－1试管中吸取1ml,移入第二试管中,得10-2稀释液。同法依次得六种不同稀释度的病汁液。
(5) 从稀至浓,将六种不同浓稀释度病汁液分别用常规摩擦接种法接种于心叶烟上。
(6) 第3～5d观察枯斑的出现，记录结果。失去侵染力的一个稀释度即为该病毒的稀释限点。
(三)体外存活期的测定
将TMV病汁液20ml装入试管中,放在室温(20~25℃)或温箱(20℃)'中。
间隔1,2,4,6,8,16,32,64d……,分别取出少许病汁,在心叶烟上进行常规摩擦接种,每次接种后第二天记录发病情况,连续两次不再出现枯斑,停止接种。最后一次失去侵染力的间隔日期即为该病毒的体外存活期。
五、实验作业与思考题
1.记录实验操作过程,分析试验结果,写出试验报告。
2.病汁液物理性质测定有何意义？
3.不能经汁液摩擦传染的病毒如何测定其物理性质？
六、实验学时：1学时。
实验十二 植物病原线虫的分离
一、目的要求
了解从土壤和植物组织中分离线虫的基本原理，掌握从土壤和植物组织中分离线虫的方法。学习在解剖镜或扩大镜下用镊子、竹针、毛针、毛笔等工具从水中和滤纸上挑取线虫的方法。
二、基本原理
植物寄生线虫主要存在于土壤和植物组织中,分离线虫的方法有许多,要根据线虫的种类、研究目的等来选择适宜的方法。植物寄生线虫的个体很小,除极少数可从植物组织中直接挑出以外,绝大多数需借助特定的工具和方法才能完成。线虫的分离主要是利用它的趋水性、大小、比重以及与其他杂质的差异,采用过筛、离心、漂浮等措施,将线虫从植物组织、土壤中分离出来。
三、材料、试剂与仪器
1.实验材料 感染根结线虫病的植物病根、病土、感染大豆孢囊线虫或其他孢囊线虫的病士、感染甘薯茎线虫的病薯块等。
2.仪器或实验用具 解剖镜、漏斗分离装置、漂浮分离装置、浅盘分离装置、纱布或铜纱、记数皿或平皿、小烧杯、小玻管、旋盖玻璃瓶、40目和325目网筛、线虫滤纸、餐巾纸、挑针、竹针、毛针、毛笔等。
3.试剂 线虫固定液。
四、实验操作
1.直接观察分离 对于个体较大的线虫如根结线虫、孢囊线虫、粒线虫的雌虫等,可直接用挑针从植物组织中挑取,也可在解剖镜或扩大镜观察下直接挑取,对于虫体稍小的线虫如茎线虫、粒线虫的雄虫和幼虫等,需在解剖镜下,用竹针或毛针直接挑取。
取感染根结线虫的植物病根材料(若是干材料需用水浸泡过夜),剥开皮层,观察里面是否有针头大小、乳白色发亮的颗粒状物。用挑针挑取,置凹玻片上水滴中,在解剖镜或显微镜下观察是否为根结线虫雌虫。
2 漏斗分离法 该方法操作简单,是目前从植物材料中分离线虫较好的方法。其装置是将直径10~15cm的玻璃漏斗架在铁架上,、下面接一段约10cm的橡皮管,橡皮管上装一个弹簧夹。
(1) 将植物材料切碎用双层纱布包好,浸在盛满清水的漏斗中,或在漏斗内衬放一个用细铜纱制成的漏斗状网筛,将植物材料直接放在网筛中,分离土壤线虫时需在网筛上放一层纱布或多孔疏松的纸,上面加一层土样。
(2) 加水,静止24h。
提示：由于趋水性和自身的重量,线虫就离开植物组织或土壤,沉降到漏斗底部的橡皮管中。
(3) 打开弹簧夹,慢慢放出底部约5ml水样于平皿内。
(4) 在解剖镜下观察分离到的线虫。若线虫数量太少,可将水样倒入离心管中,在1500r/min离心机中离心3min,倒掉上层清水,将下层沉淀物悬浮后倒入平皿或记数皿中；在解剖镜下观察记数,然后将线虫用毛针或毛笔挑入盛有固定液的小玻璃管中备用。
提示：该方法也可用于分离土壤中的线虫,尤其是分离较为活跃的线虫。
3 培育分离法 对于用漏斗分离法不易分离到的线虫,如根结线虫和孢囊线虫的雄性成虫等,可采用培育分离法。
将病根采回后洗去表面土粒,放在培养皿中湿润的滤纸上培育3d，用少量清水冲洗组织和皿底,检查水中线虫,或将组织放在有螺旋盖的玻瓶中,加入几毫升清水,盖不要旋紧,在室温(20~25℃)下培育组,然后加50ml清水,盖紧盖子并轻轻振荡,后倒出悬浮液使其顺序通过40目和325目网筛，用小水流轻轻冲洗325目网筛背面,收集到记数皿或烧杯中,直接检查或离心后检查。
提示：从土壤中得到病根后要马上冲洗和培育。因为24h后,有50%的线虫会从根里爬出,冲洗时便被冲掉了。
4.浅盘分离法 该方法原理与漏斗分离法一样,但分离效果更好,而且泥沙等杂物较少。用两个不锈钢浅盘套放在一起,上面一个是筛盘,它的底部是筛网,网目大小为10目/2.5cm,下面一个是稍大的盛水盘。也可在培养皿上放置一个稍小的做成浅盘状的金属网,网与培养皿底部保持一定距离。
分离时将线虫滤纸放在网上用水淋湿,上面再放一层餐巾纸,将要分离的土样或植物材料放在餐巾纸上,在两盘之间缝隙中加水,淹没土样或植物材料,在室温(20~25℃)下保持到,去掉筛网后,将下面浅盘中的水样过筛(上层为25目,下层为400目),将下层筛上的线虫用小水流冲洗到记数皿中,观察记数。
5.漂浮器分离法 对于无活动能力的孢囊线虫的孢囊可采用漂浮器分离法(Fenwick－OoStenbrink改良漂浮法),该法需要特制的分离装置。分离时先将漂浮筒内盛满清水,将100g风干的土样放在上筛中,用强水流冲洗土样,使其全部洗到漂浮筒内,并从环颈水槽流到承接的细筛(100目)中,再用细水流冲洗一会，使漂浮物全部流入细筛。将细筛中的孢囊等漂浮物用水洗人烧杯或三角瓶中,再倒入铺有滤纸的漏斗中,用毛笔收集并观察滤纸上的孢囊。
提示：漂浮分离的土样必须要风干,否则孢囊不能在水中漂浮,需用比重小于1的溶剂。
五、实验作业与思考题
1.比较各种线虫分离方法的优缺点。
2. 绘大豆孢囊线虫或甘薯茎线虫图形。
实验十三 病原真菌的侵染方式和途径
一、目的要求
通过对小麦白粉病菌的接种，进一步认识病原物的侵入途径。
二、实验原理和方法
植物病害的侵染过程一般分为侵入期、潜育期和发病期。病原真菌和细菌侵入期的观察，包括如何侵入和侵入的数量等，由于采用扫描电镜技术，取得很大的进展。如以稻瘟拧军的孢子接踵在水稻和其他禾本科植物上，从孢子的萌发、芽管的生长、附着孢的形成、病菌的侵入和侵入后的发展，都可以用扫描电镜直接观察，并且能够证明都是由病原物和寄主植物的相应基因控制的。
病原菌的侵入途径有3种：（1）自然孔口如气孔、皮孔和水孔；（2）自然和人为的伤口；（3）直接穿透表皮侵入。病原真菌有以上三种侵入方式。病原细菌必须从伤口或自然孔口侵入，病毒一般必须从伤口侵入。
病原菌的侵入途径有它的特性，即使是同一种病原物的不同类型的孢子侵入途径也是一定的。
关于侵入途径的观察，除了上面提到的扫描电镜外，也可以用一般实验方法。
1气孔侵入的观察
孔口是主要的自然侵入孔口,这方面的研究也较多。
（1）气孔形状和大小的观察 观察的简便方法是在叶片接近叶脉部分用刀片划一小切口用镊子将小片表皮剥下,立即放入无水酒精中固定,使保卫细胞不致干燥或失水萎缩,然后移置于盛有一滴无水酒精的载玻片上,加盖玻片在显微镜下观察。叶片正反面气孔的数目不一，大多数双子叶植物的叶片背面气孔较多,所以在接种和喷洒药剂时,不应忽视叶背而只喷洒叶面。
火棉胶制成的胶膜也可用来观察植物的气孔,火棉胶溶液的成分如下：
火棉胶(硝酸火棉胶较好) 40g 乙醚 750ml 酒精(无水)250ml
乙醚的量多,胶膜比较坚固,酒精多则较软。在潮湿和高温的条件下,适当增加酒精用量较为适宜。使用时,用毛笔蘸以上溶液少许涂在清洁叶面上,最好只涂一下,如必须涂几次,则应朝同一方向涂。干'燥以后,用小筷子将膜取下,放在载玻片上,膜上再加一块薄的载玻片、两端用橡皮筋夹紧,经过24h以后,在显微镜下直接观察。这方法也适用于观察植物表面的真菌。
（2）病菌从气孔侵入的观察 可以用制成连续切片的方法观察,也有许多病菌可以直接观察。十字花科植物霜霉病菌侵入途径的一种观察方法是将采下的叶片洗净,放在保湿的培养皿中,用新鲜的孢子囊喷洒接种。在接种的第二天,将小块叶片表皮剥下,用苯胶蓝染色后在显微镜下观察。
2.其他自然孔口侵入的观察
其他自然孔口如水孔和皮孔的侵入,可用切片观察或接种的方法证明。
水孔侵入在植物病原细菌中典型的事例,如甘蓝黑腐病细菌从水孔侵入可用接种的方法证明,将甘蓝苗罩在玻璃罩内,以减少蒸发。经过一夜,次日早晨叶齿尖端如有水滴分泌,可用针蘸少许细菌放在水滴中,细菌即由水孔侵入。接种后,经过一定时间就可以将玻璃罩移去,以后逐日观察发病过程。其他细菌病害如水稻白叶枯病和玉米枯萎病细菌从水孔侵入,也都可以用这种方法证明。
许多病原物也能从植物的皮孔侵入,尤其是植物的地下部分,在湿度比较高的条件下更容易侵入,如马铃薯的疮痂病菌和晚疫病菌都是从皮孔侵入块茎。许多果实的腐烂与皮孔侵入有关。
3.伤口侵入的观察
植物受伤后,失去天然的保护层,病原物自然容易侵入。证明伤口侵入最简单的方法,就是用有损伤和没有损伤的植物作接种试验比较。从病斑发生的位置,也能初步确定伤口侵入问题。有些病原物必须要有伤口才能侵入,有些病菌则不一定要求有伤口,虽然有伤口对侵入是有利的。
有些病原物的抱子啧洒在植物的表面,往往不易引起发病,如果将果实或叶片表面损伤后接种,或者用针刺的方法接种,就容易成功。
伤口不仅是侵入的途径,而且许多弱性寄生菌可以在伤口附近死亡的组织中得到初步发展,然后侵入健全的组织中。例如,将甘薯块根的组织局部烫伤后再接种软腐病菌,就很容易发病。
4.直接穿透侵入的观察
有的病原物能穿透没有破损的表皮侵入。表皮有角质层,所以侵入以前必先穿透角质层。这种穿透可能是化学的作用,或者纯碎是机械的力量。目前认为主要还是化学作用,有些真菌也已经证明可以产生角质酶。
直接穿透侵入的真菌,孢子萌发的芽管和寄主表面接触时,芽管顶端即稍膨大而形成盘状附着胞,将芽管附着在角质层上,再从上面产生很细的侵染丝侵入寄主。附着胞的产生在直接穿透侵入的过程中是很重要的,这是芽管与物体接触的反应。孢子在石膜或硬的明胶膜上萌发,也会产生附着胞；孢子在玻片上萌发,当芽管和玻璃接触时,也会产生这种附着胞。
真菌的直接穿透侵入,可以用接种和切片的方法证明。例如,完全没有损伤的苹果,将炭疽病菌的孢子悬浮液滴在它的表面,保持相当湿度使孢子萌发。病菌如能直接侵入,苹果即逐渐腐烂。
四、实验操作
1.取小麦苗，用感染小麦白粉病并有大量分生孢子的麦苗在欲接种的小麦苗上轻扫。
注意：扫描时动作要轻，并最好在隔离箱中操作。
2.用喷雾器喷雾接种过的小麦苗。
注意：喷雾以有细雾滴，但不形成水膜为最佳。
3.写好标记置保湿箱中，保湿12h，设不接种为对照，分别保湿。
4.第二天取出，放于温室，25±5℃左右培养。
5.一周后观察白粉病发病情况。
五、实验作业与思考题
1.说明真菌、细菌、病毒三种病原物的侵入途径及其相应的一中接种方法。
2.观察接踵后小麦白粉病的发病过程和症状。
六、实验学时：1学时。
实验十四 植物病原真菌侵染过程的组织病理学观察
一、目的要求
学习组织整体透明染色技术和荧光染色技术,观察病菌在组织中的扩展过程和主要组织病理学特点,以增强学生对病原真菌侵染过程的了解。
二、基本原理
病原真菌侵染过程的组织病理学观察常用组织整体透明染色技术和荧光染色技术。组织整体透明的常用方法包括水合氯醛透明、甘油乳酸液水合氯醛透明、乳酸透明和吡啶透明等方法。
1.水合氯醒透明 将小块组织在等量的酒精(95%)和冰醋酸混合液中固定24h,然后浸在饱和的水合氯醛水溶液中。待组织透明后取出用水洗净,经稀苯胺蓝的水溶液染色后，用甘油浮载镜检。
2.甘油乳酸液水合氯醛透明 将小块标本或切片放在酒精和冰醋酸的混合液中固定,待叶绿素褪去后,标本移在载玻片上；加含有1%酸性品红的甘油乳酸液几滴染色,徐徐加热到发烟为止。然后,除去残余的甘油乳酸液,加几滴不含染料的甘油孔酸液(并加热),洗去多余的染料,移在水合氯醛的饱和溶液中,组织透明后即可检视。如要永久保存,可以用水合氯醛的饱和溶液作浮载剂,用贴金胶水或磁漆等封固。
3.乳酸透明 病组织在乳酸(75%)中浸几天后即透明,组织中有颜色的菌丝体和子实体都可以看到。病菌结构如果是无色的,可用加0.5%~1.0%苯胶蓝的甘油乳酸液染色中检视。
4.吡啶透明 小块叶片浸在吡啶中,很快即可褪色和透明,经过水洗或者直接放在甘油乳酸液中检视。
组织整体透明染色技术常用于在组织和细胞水平观察病菌的扩展过程。 该法适于进行组织中病菌菌丝扩展的定量研究,可以揭示寄主和病原物相互作用的时空变化动态。但该法难以区分细胞的病理性坏死和机械创伤。荧光染色技术则能克服这一缺点,能更准确、快速地观察组织中病菌菌丝的扩展情况。组织荧光染色技术是研究病菌与其寄主之间相互关系的较为理想的方法。
三、材料、试剂与仪器
1.小麦品种和锈菌菌种 供试品种由锈菌生理小种鉴别品种中或当地栽培品种中选取。试验菌种可以是小麦三种锈菌(秤锈菌、叶锈菌、条锈菌)中的任何一种。供试生理小种应能使各供试品种分别表现0,1,2,3~4等各级反应型。用所选小种的新鲜夏孢子作接种体。
2仪器与用具 小花盆、毛笔、手持喷雾器、保湿筒(箱),单刃刀片、镊子、烧杯(50ml)、滴瓶、酒精灯、三角架、石棉网、载玻片、盖玻片、测微尺、普通显微镜、荧光显微镜等。
3.试剂 50%和95%乙醇、棉蓝乳酚液(乳酚油配方为：乳酸20ml、苯酚20 ml、20%甘油40 ml、蒸馏水20 ml。乳酚油中加入0.05~0.1%棉蓝)、25%和50%甘油液、水合氯醛、滑石粉、甲醇、氯仿、Tris－HCl缓冲液(pH8.5,0.1mol/L)、固定透明液(乳酚油：95%乙醇=1：2 )、NaOH(0.5 mol/L)、calcofluor white (0.1%)等。
四、实验步骤
{一}组织整体透明染色观察
1.植物材料培育和接种 供试小麦品种饱满种子播于小花盆中,在16~20℃和日照12~16h的条件下育苗。幼苗第1叶片展平后接种。接种叶片用手指蘸水轻抹去叶表面的蜡粉(去蜡),用手指蘸取条锈菌新鲜夏孢子涂抹在叶片上接种,然后用手持喷雾器向接种叶片上喷水雾。再将花盆移入盛水的保湿筒内保湿12~24h后取出,培育(16~18℃,光照16h,光强不低于10000lx)。
2.取样和处理 分别在接种后12h、24h、72h和96h取样。每次每品种摘取3个接种叶片,用单刃刀片将接种叶片切成2cm长的叶段,叶段的上表皮朝上,从顶部由左下方向右上方斜切成楔形,以便于透明,染色后区分叶片上、下表面。
将叶段置入95%乙醇和棉蓝乳酚液等量混合液中,在酒精灯上加热煮沸1.5min,然后在室温下静置48h；取出叶段用蒸馏水漂洗2次；将洗涤后的叶段置入水合氯醛饱和溶液(一般按5g水合氯醛加2ml蒸馏水的比例)中30~50min(也可长时间放置)或用小火加热数分钟,但勿使溶液沸腾。取出叶段用清水漂洗后置于载玻片上，用50%甘油液作浮载剂制片。
3.样片检查和记载 样片用显微镜镜检并进行显微计测。各品种每次取样的材料至少检查30个单个夏孢子侵入形成的侵染点。
检查和记载的项目有:
(1)吸器母细胞。统计各侵染点中吸器母细胞数目,计算平均数。
(2)菌落线性长度。用测微尺测定菌落线性长度,该长度指菌落两端最远处的侵染菌丝顶端之间的直线距离。若小菌落只在一侧产生侵染菌丝,则计测由气孔下囊至最长菌丝顶端间的直线距离。若不用测微尺测量,则可以气孔长度为单位,估计菌落线性长度相当于气孔长度的倍数。
4 反应型记载 各品种均保留部分接种苗,在接种后12~14d，已充分发病,反应型正常时,按常规分级标准,记载反应型级别。
(二)荧光染色观察
1.接种将锈菌夏孢子与滑石粉按1:10比例混匀,用毛笔将孢子粉涂抹于未脱蜡的麦叶表皮上,然后按常规方法保湿24h。
2.取样经保湿后即可取样,具体时间因观察内容而定。
(1)将所取叶片切成2cm的叶段,放入甲醇－氯仿(1:2)透明液中,放置6h。
(2)转入固定透明液(乳酚油:95%乙醇=1:2)中煮沸1.5min,放置过夜。
(3)用50%乙醇冲洗2次,每次15min,然后用蒸馏水冲洗2~3次。
(4)转入0.5 mol/L NaOH中漂白透明2次,再用蒸馏水迅速冲洗2～3次。
(5)在Tris-HCl缓冲液(pH 8.5,0.1 mol/L)中浸泡30min。
(6)用0.1%Calcofluor whi-te (增白剂)(溶于Tris-HCl缓冲液,pH 8.5,0.1 mol/L)将叶段染色5min,迅速转入蒸馏水,并冲洗4次,每次10min。
(7)转入25%甘油液中,浸30min。
3.镜检 用含少量乳酚油的甘油作浮载剂制片观察。镜检时,荧光显微镜的激发滤光片应为365m(或u激发),阻碍滤光片应为475nm,在此条件下,可清楚地进行观察。
五、实验作业与思考
1.列表比较各供试品种在接种后不同时间, 单个侵染点的吸器母细胞数目、菌落线性长度、侵染点百分率的增长情况。
2.绘制各供试品种的典型侵染点形态图。
3.整体透明染色法有哪些优缺点?
六、实验学时：1学时。
实验十五 作物品种的抗病性鉴定
一、目的要求
学习小麦在苗期和成株期对条锈病的抗病性鉴定方法,熟悉病情调查的分级标准。
二、基本原理
植物的抗病和感病是寄主和寄生物在一定环境条件下相互作用的结果。抗性的强弱是在一定条件下针对特定的病原物而言的。植物抗性的差异表现为病害发生的轻重或者蒙受损失的多少。发病的轻和重,既有量的差异,也有质的不同。例如,抗大斑病的玉米品种,有的抗病品种叶片上形成的病斑数目较少;有的抗病品种的叶片上只形成褪绿小斑。有些植物人工接种病原物可以发病,但是在田间不受这种病原物的侵染,这种抗性称作田间抗性。
植物不同发育阶段的抗性有时是一致的,如苗期测定是抗病的,到成株期测定也是抗病的。但也有不一致的,在苗期测定是感病的,到成株期测定是抗病的,一般称作成株期抗性。也有些病害在苗期测定是抗病的,成株期反而是感病的。
三、材料、用具与试剂
1.小麦品种 对小麦条锈病菌有不同抗性的小麦品种。应包括典型抗病和感病材料。
2.菌种 小麦条锈病菌当地流行小种。菌种用小麦感病品种麦苗上繁殖。
3.用具和试剂 花盆、喷雾器、保释器、显微镜、吐温－20展着剂等。
四、实验步骤
(一)苗期鉴定
1.育苗 麦苗均匀播种在直径12crn的花盆内,每盆播15个麦苗，在而2叶或3叶期，接种麦苗的第一叶。麦种均匀播种在直径12cm的瓦钵中,每钵育成约15个苗,在二叶或三叶期,接种麦苗的第一叶。
2.接种 接种前,用湿的手指轻轻摩擦待接种的叶片,除去表面的蜡质层,喷雾后接种夏孢子,接种后再喷雾一次保湿。
叶面接种主要有以下三种方法:①涂刀接种。这是常用的表面接种法,尤其适用于夏孢子的量不多,或者是取单个夏孢子堆中的夏孢子接种。一般牙医用的扁头探刀,将刃口磨钝后是很适用的。接种时,涂刀沾湿后蘸取干的夏孢子或者它的悬浮液,在叶面上轻轻涂抹均匀；
②撒布接种。接种大量的幼苗,如接种物的量很多,可以用撒布的方法。待接种的幼苗放在保湿箱中,用水喷雾后,将发病的叶片或秤上的夏孢子抖在麦苗上,再用病叶或病秤在麦苗上来回弹动几次,使孢子分布更加均匀。接种后再喷雾保湿；
③喷粉接种。喷粉接种就是将夏孢子与滑石粉混合后,用小喷粉器喷在潮湿的叶面上。滑石粉用量的多少不是很重要的,大致是孢子量的10倍左右。此外还有用各种形式的"小旋风器"来喷孢子和滑石粉混合物的；改变小旋风器橡皮球中活门的方向,还可以用来吸孢子。使用小旋风器,从几个夏孢子堆上吸到的孢子,就足够用来接种一套鉴别寄主。
3.保湿 幼苗接种都要喷雾后再保湿一定的时间。
保湿箱的形式很多,最简单的是在高5cm,大小60cmX60cm的方形白铁盘中。盘中盛水1.2cm左右,土面架一个30cm高、大小55cm×55cm的白铁框。接种后盆钵放在浅盘中,上面盖一块玻璃或有机玻璃。玻璃与白铁框的上缘要求密封,以很好地保湿。每个保湿箱,可放20盆接种的植物。接种后一般只要保湿12h左右。最好是傍晚接种,次日上午取出移到温室中。
3 抗性的测定
苗期接种的测定 品种的抗性是根据侵染型而定,侵染型分级如表：
抗病级：
0 免疫－－没有夏孢子堆和任何其他症状。
0；近于免疫一一没有夏孢子堆,但有过敏性斑点。
1 高抗－－夏孢子堆很小,周围有清晰的坏死区。
2 中抗－ 夏孢子堆小到中等,往往产生在绿岛中,绿岛周围有明显褪绿或坏死的边缘。
感病级：
3 中感－－夏孢子堆大小中等,合并现象很少见,无坏死,但可能有褪绿区,尤其是在生长条件不适宜时。
4 高感－－夏孢子堆大,常常合并在一起,无坏死,但在生长条件不适宜时可能有褪绿现象
中间级：
X 混合型－－夏孢子堆形状不一致,在有些叶片表现以上各种侵染型和共同的中间型,不可能机械分开,如分离小的夏孢子堆再接种,可能形成大的夏孢子堆,反过来也是如此。
(二) 病圃的测定 品种抗性的大田病圃测定，是在每两行感病保护行之间，播种测定的品种，每个品种播种1m2。保护行在孕穗期接种（接种方法同（一）），接种一般是用该地区发生的主要生理小种，有时为了测定对特定生理小种的反应，可以用单个生理小种接种。
（三）发病情况的记载 按照国际同意锈病病圃，除去记载发病率外，也可考虑侵染型。小麦条锈病侵染型同（一）。
五、实验作业
列表比较各品种在苗期和成株期的发病率、严重度、病情指数和病斑反应型。
六、实验学时：2学时。
实验十六 种子带菌检验
种子带菌是病害发生的重要初侵染来源，又是病菌远距离传播的重要途径，因此种子带菌检验是病害防治和病害研究的重要手段。
一、检验材料的选择和取样
在检验整批种子时，由于数量大，不可能逐粒检验。必须从中抽取具有代表性的样品进行检查分析，这一过程称为取样和扦样。按照随即取样的原则，在不同部位扦取种子放在一起，称为“原始样品”。“原始样品”的数量根据全部数量种子而定。将样品充分混合后，用“正方形”四分法从其中抽取一部分，称为“平均样品”。检验时再从平均样品中扦取“小样”。
原始样品和平均样品具体扦取方法及数量在检疫部门和粮食部门都有具体规定，应参照执行。
二、检验方法
1 直接检验 将实验材料直接用肉眼或借助扩大镜进行检验，主要用于观察种子是否混有明显的病原物，如线虫的虫瘿、黑穗病的菌瘿等。以及种子上的明显症状，如小麦根腐病的黑胚粒及大豆紫斑病的病粒等。
2 洗涤检验 洗涤检验法是将一定量的种子放入容器中，加一定量的水，充分振荡，使种子表面所带的病菌尽量洗下来。洗涤液经离心机沉淀，镜检沉淀物，确定病原菌种类并记数。统计孢子的数量，可采用血球记数板直接记数法，也可以用载玻片镜检间接记数法。
三、实验目的
了解种子检验的意义，学习种子检验的方法。
四、实验材料
供检验小麦腥黑穗病的带菌麦种，粗天平、离心机、三角瓶、离心试管、血球记数板、盖玻片、显微镜、测微尺。
五、实验步骤
第一步 肉眼检验：每人检查实验桌上陈列的标样。首先检查每种标样中带有何病原物，是否含腥黑穗病菌瘿碎片、线虫虫瘿、菌核、菟丝子、杂草籽等，并计算其百分率。
第二步 小麦种子带腥黑穗病孢子洗涤检验方法：
（一） 从麦种的平均样品中取小样品50g，计粒数后放入三角瓶中，加入50ml蒸馏水。先加入30ml，再加入20ml。三角瓶加塞后充分振荡5min。注意不要使洗涤液溢出或摇到瓶塞上。
（二） 将洗涤液倒入刻度离心管中，用离心机以1000～1500转/min的转速离心5min，后轻轻倾去离心管中的上清夜，留下2ml管底的沉淀物备用。
（三）血球记数板检验法 用灭菌吸管或滴管吸取上述沉淀液，滴一滴于血球记数板上，小心盖上盖玻片，在显微镜下检查四角及中央5大方格（即16个小方格）内的孢子数，取得平均值。
血球记数板是一种很厚的载玻片，上表面划有边长为0.5㎜的小方格，每小格的面积是0.0025㎜2。加上盖玻片后，小格的深度是0.1㎜，所以每小格的容积是0.00025㎜3，它的容积是1/（4×106）ml。测数时，先将盖玻片放在血球记数板上有刻度的位置，从盖玻片的一侧加一小滴离心后的沉淀液，然后在显微镜下观察每5大方格中孢子的数目。
将小方格内平均孢子数乘上4×106，即等于每ml内的孢子数。由此数再经换算，得出原有悬浮液的孢子总含量，再除以洗涤种子的总粒数，即可获得煤粒种子上的孢子负荷量。
六、实验作业
计算自己所做的结果，写出书面报告。
七、实验学时：2学时。
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