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2024合成生物学竞赛常规赛队伍专题之Antibiotic

花匠小妙招
2024-11-24 17:37

2024年合成生物学竞赛·创新赛第27期《常规赛科普专题》文章来自武汉大学Antibiotic-free团队，题为：无抗筛选，为生物安全保驾护航。

无抗筛选，为生物安全保驾护航

大家都有生病时在医院输液的经历吧，当人体受到细菌感染时，抗生素能有效帮助我们的免疫系统杀除病菌。但是近年来，由于抗生素的大量使用和不当排放，抗生素作为一类新兴有机污染物污染了自然水体中出现。这两张由中科院绘制的抗生素污染地图首次详细揭示了我国各地抗生素的使用和排放量水平，更显示了一年有超过5万吨抗生素排放进入水土环境中。其中中国河流总体抗生素浓度较高，各流域测量浓度最高达7.5 mg/L。

图1：中国各流域抗生素环境排放总量（左）和排放密度（右）

抗生素长期排入环境中，会造成微生物耐药性的增强，促进耐药基因在环境中扩展和演化，抗微生物药物耐药性已成为威胁全球公众健康的重大问题，预计到2050年将有1000万人死于抗生素耐药菌。事实上，很难将抗生素耐药菌的产生简单归咎于抗生素污染，抗生素污染只是一种环境选择，使得能面对抗生素压力的微生物脱颖而出，微生物基因突变或通过从其他细菌获得抗性基因（例如通过质粒或转座子）才进一步促成了抗生素与耐药菌之间的军备竞赛。粘菌素于1949年在日本被发现，被誉为治疗耐多药革兰氏阴性菌的最后手段，然而，目前粘菌素的耐药性mcr-1基因现已在全球30多个国家的农场动物和人体中发现。

图2：（a）抗性基因在同种微生物中的传播（b）抗性基因在不同微生物中的传播（c）抗性基因在动物、植物和人类间的传播

其实除了工业、农业、医疗等广为人知的领域外，在前沿的科学研究中，也需要用到种类繁多的抗生素。并且实验室作为基因工程研究的重要平台，是抗性基因污染的重要来源之一。

大家都知道DNA是一切生命活动的指挥官，科学家们发现可以将控制药物、蛋白质合成的DNA导入到微生物中，让他们合成我们所需要的物质，从有害菌摇身一变成为有益的“细胞工厂”。

图3：细胞工厂

帮助外源基因进入细胞的“搬运工”就是质粒（plasmid），它是在细菌和其他细胞中发现的一种独立于宿主染色体复制的小型环状DNA，是基因工程中常用的载体。一个合格的质粒通常由复制起始位点、抗生素抗性基因、多克隆位点等元件组成。其中质粒载体上的抗生素抗性基因，例如：氨苄西林（Ampicillin）、卡那霉素（Kanamycin）抗性基因，可以筛选成功导入质粒的细菌，没有质粒DNA的细菌无法在含有抗生素的培养平板中存活，从而使目的菌株脱颖而出。

图4：质粒的组成

科学家就是把这个小东西导入工程菌。

图5：大肠杆菌中的DNA与质粒

这些工程菌为人类生产着重要的药物如胰岛素，还有细胞因子、抗体、疫苗、激素等，为我们解决了诸多难题。然而，在生产过程中人们需要持续使用抗生素作为生存压力，避免工程菌质粒的丢失。这将导致抗生素污染日益严重，质粒上抗性基因的水平传播更敲响了生物安全的警钟。为了解决这一问题，科研工作者们采取了多方面的措施。凭借“解铃还须系铃人”的思路，浙江大学赵和平教授团队构建了一种能够降解外界DNA的细菌，利用微生物产生的胞外核酸酶降解污水厂出水中的抗生素抗性基因，从而抑制抗性基因的接合和转化，减缓微生物耐药进化进程。另一方面，为了防止工程菌株向自然环境中泄露与繁殖，研究者们通常会在工程菌株中设计“自杀”系统，细胞会在一定环境或时间后自行裂解死亡，上海交通大学唐鸿志教授团队构建了一种用于检测并降解水体水杨酸污染的菌株，并设计了一套毒素-抗毒素系统，使其在完成使命后“自杀”。

除了工业、农业方面抑制抗性基因水平转移的研究，一些科研工作者也从实验室工程菌系统构建方面进行了创新。他们不选择抗生素抗性基因进行筛选，而是尝试构建营养缺陷型菌株。这些微生物合成基本营养物质的能力受到限制或丧失，必须在额外添加了特定物质的培养基上才可以生长，在普通的培养环境下或者自然条件下死亡，这样一方面可以减少工程菌的泄露，一方面避免使用抗生素进行筛选，给生物安全上了双重保险。

我们就是基于这个想法，敲除掉大肠杆菌DNA的一个在自然条件下生长必须拥有的基因，让它必须依赖补充的营养剂或者通过导入装载该基因的质粒存活，因此在常规培养基上能正常生长的改造菌株就是成功导入质粒的菌株啦！这样的系统是我们成功在不使用抗生素的情况下筛选出成功导入质粒的细菌。

不仅如此，我们构建的这套体系还可以实现质粒拷贝数的动态调控。

DNA 质粒进入细胞后会复制到一定数量，被称为质粒拷贝数（PCN），可以简单理解为细胞内质粒的个数。质粒拷贝数受复制起点的调节，也受多种因素的影响，如生长条件，宿主菌株、温度和其他细胞外应激。大肠杆菌是人们表达外源基因的首选，但常常会遇到表达效率不高和产率较低等困难。目前，质粒拷贝数已经被证明能够用于代谢途径的动态调控，来提高细胞工厂的性能。当细胞内的质粒拷贝数增加时，质粒上携带的目的基因的拷贝数也增加，其转录翻译的产物数量自然也随之增加。

图6：质粒拷贝数及其影响因素

基于被敲除基因对细菌生命活动的重要性，当通过弱启动子减少的质粒基因表达时，大肠杆菌为保证自身生理活动的正常进行增加质粒拷贝数以保证基因维持在正常水平，质粒拷贝数的增加同时能使目的基因表达水平得到提高。

图7：通过质粒拷贝数来调节目的基因的表达水平和质粒稳定性

总之，我们构建了一个不依赖抗生素-抗性基因的质粒筛选系统，避免了抗生素和抗性基因的使用，同时，这个系统还可以实现质粒拷贝数的动态调控达使得目的基因的表达水平提高，有望应用于工业生产提高产量或发展成为新型生物传感器。

参考文献

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*部分素材来源网络

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