? ? 向日葵HaACO1基因的表达分析及功能验证 ? ? 孙瑞芬 张艳芳 牛素清 郭树春 李素萍 于海峰 聂惠 牟英男 (1. 内蒙古农牧业科学院,呼和浩特 010031;2. 内蒙古农业大学园艺与植物保护学院,呼和浩特 010011) 生物和非生物胁迫是影响植物生长发育和作物产量的重要因素,抗性相关基因的克隆和功能鉴定对采用基因工程手段改良作物抗性非常重要。乙烯(ethylene)是一种植物激素,在植物生长发育、成熟衰老整个生命活动及盐害、冷害、机械伤害、渍水等逆境胁迫和病原菌入侵中发挥着重要的作用[1]。ACC氧化酶(ACO)是乙烯合成途径中最后一个酶,直接催化ACC合成乙烯,其活性对乙烯生物合成具有重要的调控作用,因此ACO基因的表达是乙烯形成和应答的主要标志。ACO由多基因家族编码,目前,已在多种植物上克隆了ACC氧化酶基因,并对其在植物生长发育、成熟衰老等生育过程及激素、环境胁迫、提高作物抗逆性等方面进行了研究。拟南芥AtACO基因家族的6个成员(AtACO1-AtACO6)均可响应水分胁迫,其中AtACO1基因参与植物发育,特别是根系发育[2]。Yuan等[3]从梨的基因组中鉴定了11个ACO基因,其中8个ACO基因在梨的果实中表达,3个ACO基因可被乙烯诱导,表明乙烯是控制更年期果实成熟过程的主要因素。杨树ACC氧化酶基因Ptre-ACO3和Ptre-ACO6可通过调节乙烯合成而调控杨树秋叶的衰老[4]。Sornchai等[5]通过导入石斛兰CpACO基因反义载体延长了石斛兰花期寿命。孙申申等[6]从“云香”水仙中克隆的新型ACC氧化酶基因NtACOY2参与“云香”水仙花的发育,并且与其花衰老密切相关;在烟草中过表达NtACOY2,2株转基因烟草分别比野生型烟草提前8d和7d开花。吴建阳等[7]的研究表明荔枝Lc-ACO1基因参与调控荔枝幼果脱落。薛丽君从苎麻中获得的BnACO1基因参与ABA、干旱、NaCl 胁迫应答[8]。拟南芥中过量表达棉花GhACO2基因,增强了拟南芥耐盐、耐干旱能力[9]。有关向日葵ACC氧化酶基因相关方面的研究鲜有报道。本研究对前期从盐诱导向日葵中克隆的ACC氧化酶基因HaACO1(GenBank No. KP966508)[10-11]进行了表达分析及耐盐功能验证,为利用该基因进行作物抗逆性状改良奠定基础。 1 材料与方法 1.1 材料 试验在内蒙古农牧业科学院生物技术研究中心进行。将向日葵P50种子种植在实验室蛭石中,待发芽长成幼苗后,分别进行以下处理。(1)按照郭树春等[12]的方法接种黄萎病病菌(V21),取接种0 d(CK)、1 d、3 d、5 d和7 d植 株 的 叶 片。(2)按照孙瑞芬等[11]的方法,用120 mmol/L NaCl处理向日葵幼苗;用镊子夹伤叶片远端边缘并用大头针戳3-5下进行损伤处理;将向日葵幼苗置于4℃冰箱进行低温处理;用5 mmol/L水杨酸喷洒向日葵幼苗。分别取以上不同处理0 h(CK)、2 h、6 h、12 h和24 h植株的叶片。(3)取在1/2 MS营养液中培养4-5 d的向日葵P50幼苗的根、下胚轴和叶片。以上各处理材料于液氮中速冻后,-80℃保存备用。 将本课题组保存的野生型烟草SRI(Nicotiana tabacum)种子,用0.1% HgCl2消毒10 min,无菌水冲洗4-5次,接种到1/2MS固体培养基中,置于植物组织培养室中培养获得无菌苗,备用。新鲜洋葱购自市场。瞬时表达载体pCAM-35S-GFP、植物表达载体pPZP221、农杆菌菌株EHA101由本课题组保存。黄萎病病菌(大丽轮枝菌Verticillium dahlia)菌株V21由内蒙古农业大学赵君教授惠赠。利用Primer Premier 5/64软件设计引物(表1),由南京金斯瑞生物工程技术服务有限公司合成。 1.2 方法 1.2.1 HaACO1在向日葵中的表达分析 利用TaKaRa公司的RNA提取试剂盒(MiniBEST Plant RNA Exteaction Ki)提取各处理样品总RNA,通过微量紫外分光光度计(NanoDrop 2000)测其浓度并稀释到200 ng/μL,以其为模板,利用TaKaRa公司 的PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒合成cDNA。根据HaACO1的ORF序列设计引物F1和R1(表1),以向日葵18S rRNA(No.HM638219)为内参基因(引物为F2和R2),利用TaKaRa公 司 的SYBR?Premix EX TaqTMⅡ(Tli RNaseH plus)进行实施荧光定量PCR反应(qRTPCR),重复3次。通过2-ΔΔCT法计算HaACO1的相对
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