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一种小花万代兰种苗无菌播种繁殖方法与流程

花匠小妙招
2024-11-26 06:04

本发明属于植物保护生物学和生物技术领域，特别涉及一种小花万代兰种苗无菌播种繁殖方法。

背景技术：

小花万代兰（vandacoerulescensgriff.）是兰科万代兰属植物，分布于印度东北部、缅甸、泰国，以及中国云南的西镇康、澜沧、墨江、思茅、景洪、勐海、勐腊、元江、元阳等县；生于海拔700-1600米，附生于疏林中树干上。为附生兰，茎粗壮，长8-30厘米，叶多枚，二列，先端有不规则缺刻；总状花序1-2个，长达36厘米，具多花，花色白色带淡蓝色，花期3-5月，国家二级保护植物，具有重要的育种、观赏、科研、保护等价值。但由于人们过度的采伐以及其生长环境发生变化，野外的小花万代兰种源稀缺，因而需要对其进行人工繁殖，一方面除了满足市场以及育种、科研的需求外，另一方面可将人工繁殖的种苗回归原产地放养，令其能自然繁殖，扩大其种群数量，极好地保护该物种的多样性。

目前世界上还没有小花万代种苗繁殖专利和文献报道。因此有必要设计一种小花万代兰种苗无菌播种繁殖方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种小花万代兰种苗无菌播种繁殖方法。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种小花万代兰种苗无菌播种繁殖方法，包括下列步骤：

第一步：将小花万代兰蒴果用酒精浸泡，然后用升汞溶液消毒，接下来用无菌水冲洗，再于无菌条件下用无菌滤纸吸干所述蒴果表面的水分；接着用无菌手术刀切开蒴果，将蒴果内的种子洗脱至一容纳有无菌水的容器内，制成种子悬浮液，然后用无菌水将所述种子悬浮液调整成浓度20~30粒种子/毫升的接种用种子悬浮液；

第二步：无菌条件下，将所述接种用种子悬浮液移至一容纳有一次成苗固体培养基的兰花培养瓶中，每个所述兰花培养瓶中的种子数量为40~60粒；每升所述一次成苗培养基含有1~2g的花宝1号、1～2g的花宝2号、0.5～2g的蛋白胨、40~80g的土豆泥、50~100g的香蕉泥、10~20g的苹果泥、500~1000mg的活性碳、80~120mg的肌醇、1.5~2.5mg的甘氨酸、0.05~0.2mg的盐酸硫胺素、0.4~0.8mg的盐酸吡哆醇、0.4~0.8mg的烟酸、0.05~0.1mg的6-苄基嘌呤、0.2~2mg的萘乙酸、15～30g的蔗糖、6～7g的琼脂；所述一次成苗培养基的ph值为5.4-5.6；

第三步：将所述培养瓶在温度为23~27℃，光照强度为100～1000lux的条件下培养60~90天，使种子萌发形成原球茎，原球茎长出根和叶片得到小苗；

第四步：将所述小苗在24~28℃，光照强度为1000～3000lux的条件下培养，获得高度为3~5cm、叶片数量为3～5片、根须的数量为3～5条、根的长度为1～3厘米的大苗；

第五步：将所述大苗在24~28℃，光照强度为3000～5000lux的条件下培养，获得高度为5~7cm、叶片数量为4片以上、根须的数量为5条以上、根的直径为3毫米以上的生根苗；

第六步：从培养瓶中取出所述生根苗，洗净附着在所述生根苗上的培养基后，用高锰酸钾溶液浸泡，然后将生根苗晾干至生根苗的根变白后栽培在基质上。

优选的技术方案为：将小花万代兰蒴果用体积分数为70%的酒精浸泡20~40秒，然后用质量分数为0.1~0.3%的升汞溶液消毒15~20分钟，接下来用无菌水冲洗4~5次，再于无菌条件下用无菌滤纸吸干所述蒴果表面的水分；接着用无菌手术刀切开蒴果，将蒴果内的种子洗脱至一容纳有200毫升无菌水的容器内，制成种子悬浮液。

优选的技术方案为：在第六步中，用质量分数为0.1~0.3%的高锰酸钾溶液浸泡4~6分钟。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：

本发明采用成熟的蒴果进行无菌播种、一次培养成苗，具有繁殖速度快、种苗品质优良、生长成本低等特点，只需要简单的组织培养设备就可以完成。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本实施例所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。

实施例1：一种小花万代兰种苗无菌播种繁殖方法

（1）材料：开花时选取生长健壮的小花万代兰进行人工授粉，授粉后150天选择种子基本成熟而未开裂的蒴果为外植体用于无菌播种。

（2）种子悬浮液制备：选取果龄为150天的蒴果为外植体，在体积分数为70%的酒精中浸泡30秒，再用质量分数为0.1%的升汞溶液消毒18分钟，无菌水冲洗4次，于超净工作台上无菌条件下用无菌滤纸吸干蒴果表面的水分。接着用无菌手术刀切开蒴果，将蒴果内的种子全部洗脱至一装有200毫升无菌水的三角瓶中，每个蒴果的种子对应洗脱至一瓶装有200毫升无菌水的三角瓶，制成种子悬浮液。对每个蒴果种子悬浮液进行种子密度的检测，在摇匀情况下用无菌移液枪吸取20微升于生物显微镜下计算其种子数量，每瓶种子悬浮液重复取10次计算其平均每毫升种子数。根据每瓶悬浮液种子浓度用无菌水进一步稀释成种子浓度为30粒/毫升的接种用的种子悬浮液。

（3）无菌播种：无菌条件下用移液枪吸取接种用的种子悬浮液2毫升至装有150毫升的一次成苗固体培养基的兰花培养瓶中，每瓶小花万代兰的种子数量60粒。一次成苗培养基：每升含花宝1号1.5g，花宝2号1.5g，蛋白胨2g，土豆泥80g，香蕉泥100g，苹果泥10g，活性碳500mg，肌醇100mg，甘氨酸2.0mg，盐酸硫胺素（vb1）0.2mg，盐酸吡哆醇（vb6）0.5mg，烟酸0.5mg，6-苄基嘌呤（6-ba）0.05毫克，萘乙酸（naa）1.0mg，蔗糖20g，琼脂6.0g，ph5.4。

（4）自然光照培养室建造：使用钢化玻璃建成透光的培养室，配备遮阳系统、降温设备、培养架。遮阳系统包括内外遮阳网，通过调控内外遮阳网使培养室内顶层培养架的光照强度为3000～5000lux，顶层往下的第二、三层培养架光照强度为1000～3000lux，底层即顶层下第四层光照强度100～1000lux。降温设备采用冷暖两用空调，可将玻璃培养室的温度控制在20～30℃。培养架宽为60厘米，高为200厘米，离地面10厘米为第四层，层距60厘米，共四层，培养架长度可根据培养室的大小而定。

（5）原球茎诱导培养：将种子悬浮液均匀分布培养基表面上，将此培养瓶放置全自然光培养室中的第四层培养架上，保持其光照强度在100～1000lux，保持培养室温度在(25±2)℃。此条件下培养60～90天，种子萌发形成原球茎，原球茎长出根和叶片。培养温度为(26±2)℃。

（6）小苗培养：将小苗移动至培养架的第二或第三层，加强其自然光照培养，促进小苗生长，此时期培养时间为90天，小苗长成大苗，苗高3～5cm，3～5片叶片，3～5条根须，根长1～3厘米。培养温度为(26±2)℃。

（7）大苗培养：将大苗移动至培养架的第一层，在高自然光光强下进行培养，既可以促进大苗的生长，又可以达到炼苗的效果。此时期培养60天，苗高5～7cm，4片以上叶片，3条以上根，茎粗3.0mm以上，达到出苗的标准。培养温度为(26±2)℃。

（8）瓶苗移栽：移栽时，从培养瓶中取出生根苗，洗净附着的培养基后，用质量分数为0.1%的高锰酸钾溶液浸泡5min，然后将生根苗晾干至根变白，种植基质采用已经消毒处理的水苔，注意保持适宜湿度和温度，置于阴凉通风处栽培，成活率可达95%以上。30d左右成活后的植株能产生新的根系，此时可移入大棚进行正常水、肥、药管理。

实施例2：一种小花万代兰种苗无菌播种繁殖方法

（1）材料及人工授粉：于小花万代兰开花季节，选取确认花粉有活力后将其异花授于同一植株的另一朵花的柱头上。授粉后套袋，约1星期后去袋，挂上标签，标签上授粉日期和授粉人等信息。注意观察杂交蒴果的发育情况，在授粉后4个月后可采集蒴果进行无菌播种。

（2）种子悬浮液制备：选取果龄为140天的蒴果为外植体，在体积分数为70%的酒精中浸泡30秒，再用质量分数为0.1%的升汞溶液消毒20分钟，无菌水冲洗5次，于超净工作台上无菌条件下用无菌滤纸吸干蒴果表面的水分。接着用无菌手术刀切开蒴果，将蒴果内的种子全部洗脱至一装有200毫升无菌水的三角瓶中，每个蒴果的种子对应洗脱至一瓶装有200毫升无菌水的三角瓶，制成种子悬浮液。对每个蒴果种子悬浮液进行种子密度的检测，在摇匀情况下用无菌移液枪吸取20微升于生物显微镜下计算其种子数量，每瓶种子悬浮液重复取10次计算其平均每毫升种子数。根据每瓶悬浮液种子浓度用无菌水进一步稀释成种子浓度为25粒/毫升的接种用的种子悬浮液。

（3）无菌播种：无菌条件下用移液枪吸取接种用的种子悬浮液2毫升至装有150毫升的一次成苗固体培养基的兰花培养瓶中，每瓶小花万代兰的种子数量50粒。一次成苗培养基：每升含花宝1号2.0g，花宝2号2.0g，蛋白胨2g，土豆泥40g，香蕉泥80g，苹果泥10g，活性碳500mg，肌醇100mg，甘氨酸2.0mg，盐酸硫胺素（vb1）0.2mg，盐酸吡哆醇（vb6）0.5mg，烟酸0.5mg，6-苄基嘌呤0.05毫克，萘乙酸（naa）1.0mg，蔗糖20g，琼脂6.0g，ph5.4。

（4）自然光照培养室建造：使用钢化玻璃建成透光的培养室，配备遮阳系统、降温设备、培养架。遮阳系统包括内外遮阳网，通过调控内外遮阳网使培养室内顶层培养架的光照强度为3000～5000lux，顶层往下的第二、三层培养架光照强度为1000～3000lux，底层即顶层下第四层光照强度100～1000lux。降温设备采用冷暖两用空调，可将玻璃培养室的温度控制在20～30°c。培养架宽为60厘米，高为200厘米，离地面10厘米为第四层，层距60厘米，共四层，培养架长度可根据培养室的大小而定。

（8）瓶苗移栽：移栽时，从培养瓶中取出生根苗，洗净附着的培养基后，用千分之一的高锰酸钾溶液浸泡5min，然后将生根苗晾干至根变白，种植基质采用已经消毒处理的水苔，注意保持适宜湿度和温度，置于阴凉通风处栽培，成活率可达98%以上。30d左右成活后的植株能产生新的根系，此时可移入大棚进行正常水、肥、药管理。

实施例3：一种小花万代兰种苗无菌播种繁殖方法

材料：保存于中国科学院华南植物园玻璃温室内小花万代兰。

人工授粉：于小花万代兰开花季节，选取确认花粉有活力后将其异花授于同一植株的另一朵花的柱头上。授粉后套袋，约1星期后去袋，挂上标签，标签上授粉日期和授粉人等信息。注意观察杂交蒴果的发育情况，在授粉后4个月后可采集蒴果进行无菌播种。

一种小花万代兰种苗无菌播种繁殖方法，包括下列步骤：

第一步：选取果龄为120-150天的蒴果为外植体，将小花万代兰蒴果用酒精浸泡，然后用升汞溶液消毒，接下来用无菌水冲洗，再于无菌条件下用无菌滤纸吸干所述蒴果表面的水分；接着用无菌手术刀切开蒴果，将蒴果内的种子洗脱至一容纳有无菌水的容器内，制成种子悬浮液，然后用无菌水将所述种子悬浮液调整成浓度20粒种子/毫升的接种用种子悬浮液；

第二步：无菌条件下，将所述接种用种子悬浮液移至一容纳有一次成苗固体培养基的兰花培养瓶中，每个所述兰花培养瓶中的种子数量为40粒；每升所述一次成苗培养基含有1g的花宝1号、2g的花宝2号、1.2g的蛋白胨、60g的土豆泥、50g的香蕉泥、20g的苹果泥、1000mg的活性碳、90mg的肌醇、1.5mg的甘氨酸、0.2mg的盐酸硫胺素、0.7mg的盐酸吡哆醇、0.7mg的烟酸、0.1mg的6-苄基嘌呤、0.25mg的萘乙酸、20g的蔗糖、6g的琼脂；所述一次成苗培养基的ph值为5.5；

自然光照培养室建造：使用钢化玻璃建成透光的培养室，配备遮阳系统、降温设备、培养架。遮阳系统包括内外遮阳网，通过调控内外遮阳网使培养室内顶层培养架的光照强度为3000～5000lux，顶层往下的第二、三层培养架光照强度为1000～3000lux，底层即顶层下第四层光照强度100～1000lux。降温设备采用冷暖两用空调，可将玻璃培养室的温度控制在20～30°c。培养架宽为60厘米，高为200厘米，离地面10厘米为第四层，层距60厘米，共四层，培养架长度可根据培养室的大小而定。

第三步：将所述培养瓶放在第四层培养架上，在温度为23~27℃，光照强度为100～1000lux的条件下培养60~90天，使种子萌发形成原球茎，原球茎长出根和叶片得到小苗；

第四步：将所述小苗在第二、三层培养架上，在24~28℃，光照强度为1000～3000lux的条件下培养，获得高度为3~5cm、叶片数量为3～5片、根须的数量为3～5条、根的长度为1～3厘米的大苗；

第五步：将所述大苗在第一层培养架上，在24~28℃，光照强度为3000～5000lux的条件下培养，获得高度为5~7cm、叶片数量为4片以上、根须的数量为5条以上、根的直径为3毫米以上的生根苗；

优选的技术方案为：将小花万代兰蒴果用体积分数为70%的酒精浸泡30秒，然后用质量分数为0.3的升汞溶液消毒15分钟，接下来用无菌水冲洗5次，再于无菌条件下用无菌滤纸吸干所述蒴果表面的水分；接着用无菌手术刀切开蒴果，将蒴果内的种子洗脱至一容纳有200毫升无菌水的容器内，制成种子悬浮液。

优选的技术方案为：在第六步中，用质量分数为0.1~0.32%的高锰酸钾溶液浸泡4分钟。

以上所述者仅为用以解释本发明之较佳实施例，并非企图具以对本发明做任何形式上之限制，是以，凡有在相同之发明精神下所作有关本发明之任何修饰或变更，皆仍应包括在本发明意图保护之范畴。