规模化猪场细菌性疾病的实验室诊断
病原学检测通过细菌分离培养，革兰氏染色镜检，生理生化鉴定、PCR等病原学检测技术进行快速诊断。对于细菌性疾病而言，细菌的分离鉴定和药敏试验，是最常用的技术手段。
1 、病料采集
重点采样部位一般为扁桃体、肺脏、淋巴结（如颌下，腹股沟）、脾肾、关节等，根据不同目的采取侧重点不同的各类样本，以下是不同疫病的推荐采样部位，供参考。
细菌性疾病
建议采集的病料
副猪嗜血杆菌病
肺脏（带气管）、心包液、关节、脑
链球菌病
肺脏（带气管）、脑、淋巴结、关节
传染性萎缩性鼻炎
肺脏（带气管）、深部鼻液
猪肺疫
肺脏（带气管）、淋巴结
猪传染性胸膜肺炎
肺脏（带气管）
猪沙门氏菌病
肺脏（带气管）、肝脏、肠内容物
大肠杆菌病
小肠及内容物、肺脏、心脏
2 、常见细菌疾病的实验室检测
序号
检测项目
检测内容和方法
1
副猪嗜血杆菌（HPs）
分离培养鉴定、生化鉴定、PCR鉴定
2
胸膜肺炎放线杆菌（APP）
分离培养鉴定、生化鉴定、PCR鉴定
3
链球菌（S.suis）
分离培养鉴定、生化鉴定、PCR鉴定
4
大肠杆菌（E.coli）
分离培养鉴定、生化鉴定、PCR鉴定
5
猪萎缩性鼻炎（AR）
抗体、分离培养鉴定、生化鉴定、PCR鉴定
6
多杀性巴氏杆菌（Pm）
分离培养鉴定、生化鉴定、PCR鉴定
7
沙门氏菌
分离培养鉴定、生化鉴定、PCR鉴定
8
细菌药敏试验鉴定
药敏试验
3、 猪场常见细菌性疾病的诊断
3.1副猪嗜血杆菌杆菌的实验室诊断
（1）细菌的分离培养鉴定
无菌采取病变明显的病料或积液接种于TSA培养基上进行培养24h后，然后挑选单个菌落分别划线接种于改良的LB固体培养基和TSA培养基上，在5%的CO2培养箱中于 37 ℃培养24h，观察并记录培养基上细菌菌落的生长情况。取液体培养基中的液体划线接种到鲜血培养基上，在培养基上垂直 于接种细菌水平划线接种金黄色葡萄球菌。在 18～24h，观察是否有“卫星现象”，是否溶血。镜检可见全部为革兰氏阴性菌体，菌体较小，菌体的形态不单一，出现少数的球状菌体，偶有细长丝状菌体（图2）。
图1 在TSA培养基上的生长形态
图2 革兰氏染色镜检形态
（2）生化鉴定
细菌分离纯培养后，同时接种各种生化反应管，置37℃温箱培养24h～48h观察结果。将分离菌对氧化酶、脲酶、接触酶试验为阳性，葡萄糖、 蔗糖、麦芽糖均可发酵，不发酵乳糖、山梨醇、 葡萄糖酸盐、甘露醇（表1）。
表1 生化试验结果
生化鉴定项目
结果
生化鉴定项目
结果
氧化酶
+
葡萄糖
+
脲酶
+
葡萄糖酸盐
—
接触酶
+
蔗糖
+
乳糖
—
甘露醇
—
山梨醇
—
麦芽糖
+
注：“+”为阳性，“-”为阴性
（3）PCR分子生物学诊断
根据副猪嗜血杆菌 16S rRNA 序列设计引物，上游引物：5-GGC TTC GTC ACC CTC TGT-3，下游引物：5-GTG ATG AGG AAG GGT GGT GT-3，PCR扩增产物为822bp大小的片段。这种方法检测的最小细菌浓度为 102 CFU/mL，敏感性也远远高于常规的细菌分离方法。
LaneM：DNA2000 Marker
Lane1：阳性对照
Lane2：阴性对照
Lane3-5：PCR扩增结果
图1 副猪嗜血杆菌16SrRNA电泳图
3.2胸膜肺炎放线杆菌的实验室诊断
（1）细菌分离培养鉴定
从病料中分离培养细菌后，取纯培养菌落于普通琼脂平板上，密集划线；另取相同纯培养菌落于加有0.1%NAD试剂的普通琼脂平板上，密集划线；然后，将两种培养皿同时放入37℃恒温箱中培养24h，分离的细菌在TSA培养基上长出乳白色1mm～2mm大小菌落（图1），革兰氏染色后镜检呈阳性小杆菌，小杆菌至长丝状，具有明显多形性（图2）。
图1 NAD依赖普通琼脂培养基生长状态
图2 APP染色镜检形态
（2）卫星现象
挑取纯培养菌落均匀涂布于普通琼脂培养基上，然后用金黄色葡萄球菌在培养基中央尽可能大的划一个三角形，置于37℃的恒温培养箱中培养24～48h，观察生长结果。分离菌离金黄色葡萄球菌越近，菌落越大、越密集，反之其菌落越小、越稀少，更远处则无菌生长，出现卫星生长现象。
（3）生化鉴定
取纯培养菌落接种过氧化氢酶、尿素酶、乳糖、蔗糖、果糖、葡萄糖、甲基红、山梨醇、甘露醇、靛基质等生化鉴定试剂，置于37℃恒温箱中培养1～3天，观察并记录反应结果。
表1 生化试验结果
生化鉴定项目
结果
生化鉴定项目
结果
乳糖
—
蔗糖
+
果糖
+
葡萄糖
+
甲基红
—
靛基质
—
山梨醇
—
甘露醇
+
注：“+”为阳性，“-”为阴性
（4）PCR分子生物学鉴定
根据APP JL03 全基因组序列设计特异性引物，能扩增出1806 bp大小的核酸片段。上游引物：
5-CTGGGATTCTCGTTACCGGTGAAAGTCGG-3，下游引物：
5-ATCGTCGACACCGCCGAAACCTTTGGTAT-3。
M：DNA Maker 2000
Lane1：阳性对照
Lane2：阴性对照
Lane3：PCR产物
图1 PCR电泳图
3.3 猪链球菌的实验室诊断
（1）细菌分离培养鉴定
将病猪的肺脏和脑样病料划线接种于TSA培养基上培养，挑菌纯培养后，均呈现大小一致、灰白色、表面光滑、针尖状大小的圆形菌落（图１）。将分离纯化后的单个菌落进行革兰氏染色镜检，镜下观察为革兰氏阳性菌，可见多个圆形或短链状排列（图2） 。
图1在血平皿上的生长情况
图2 革兰氏染色镜检图
（2）生化鉴定
细菌分离纯培养后，同时接种各种生化反应管，置37℃温箱培养24h～48h观察结果。将分离菌对水杨素、麦芽糖、七叶苷和MR反应呈阳性，对山梨醇、甘露醇、硫化氢、棉子糖、木糖和鸟氨酸呈阴性（表1）。
表1 猪链球菌的生化鉴定结果
生化鉴定项目
结果
生化鉴定项目
结果
山梨醇
—
麦芽糖
+
甘露醇
—
棉子糖
—
水杨素
+
木糖
—
硫化氢
—
鸟氨酸
—
M.R.
+
七叶苷
+
注：“+”为阳性，“-”为阴性
（3）PCR分子生物学诊断
根据猪链球菌荚膜多糖基因cps2（2型）、cps7（7型）和cps9（9型）进行引物设定，详见表2。
表2 猪链球菌PCR扩增引物
引物用途
引物序列
退火温度（℃）
扩增产物长度(bp)
猪链球菌
上游引物：
5-AAGTTCCTCGGTTTTGAGCA-3
下游引物：
5-GCAGCCGTATTCTGTCAAACG-3
58
566
2型猪链球菌
上游引物：
5-TTTGTCGGGAGGGTTACTTG-3
下游引物：
5-TTTGGAAGCGATTCATCTCC-3
58
637
7型猪链球菌
上游引物：
5-AATGCCCTCGTGGAATACAG-3
下游引物：
5-TCCTGACACCAGGACACGTA-3
58
498
9型猪链球菌
上游引物：
5-GGGATGATTGCTCGACAGAT-3
下游引物：
5-CCGAAGTATCTGGGCTACTGA-3
58
379
3.4 大肠杆菌的实验室诊断
（1）细菌分离培养鉴定
选取腹泻仔猪，蘸取肛门拭子划线接种于普通培养基培养后，再挑取单个菌落分别接种于普通培养基、麦康凯培养 基、血清琼脂培养基，37 ℃ 恒温培养 24 h。对麦康凯培养基上生长的菌落进行纯化。在普通培养基上生长出呈白色、湿润、光滑的菌落; 在麦康凯培养基上菌落 呈红色，周围培养基变红，划线部分可见胆酸盐沉 淀; 在血琼脂培养基上出现溶血反应。
图1普通培养基上的菌落 图2 麦康凯培养基上的菌落 图3 血琼脂培养基上的菌落
（2）生化试验
细菌分离纯培养后，同时接种各种生化反应管，置37℃温箱培养24h～48h观察结果。分离菌对蛋白胨水、葡磷胨水、半固体琼脂( 运动力) 、葡萄糖( 产气) 、山梨醇、 鸟氨酸、棉子糖、赖氨酸、木糖醇呈阳性；对葡萄糖酸 盐、枸橼酸盐、尿素、苯丙氨酸、侧金盏花醇、硫化氢呈阴性（表1）。
表1 生化试验结果
生化鉴定项目
结果
生化鉴定项目
结果
硫化氢
—
苯丙氨酸
—
葡萄糖酸盐
—
蛋白胨水
+
蛋白胨水
+
枸橼酸盐
—
尿素
—
木糖醇
+
半固体琼脂( 运动力)
+
葡萄糖( 产气)
+
山梨醇
+
鸟氨酸
+
棉子糖
+
赖氨酸
+
注：“+”为阳性，“-”为阴性
（3）PCR分子生物学诊断
设计PCR扩增通用引物，上游引物 P1: TGACACTGAACATTGAG; 下游引物 P2: CTTATCTCTTCCGCAT，检测菌目的条带均为 650 bp 左右。
LaneM：DNA2000 Marker
Lane1：阳性对照
Lane2-3：PCR扩增结果
图1 大肠杆菌PCR扩增结果
3.5 猪萎缩性鼻炎的实验室诊断
（1）细菌的分离培养鉴定
猪萎缩性鼻炎是由支气管败血波氏杆菌或产毒素多杀性巴氏杆菌引起的一种慢性接触性呼吸道传染病。对于表现萎缩性鼻炎临床症状的猪，消毒猪鼻盘后，用棉拭子采集猪鼻腔内黏性分泌物划线培养接种于10g/L 葡萄糖麦康凯培养基，挑取单个光滑、凸起、湿润、半透明的可疑菌落（图1）进行传代纯化和革兰氏染色镜检，分离物均为 G-的短小杆菌，多呈单或成双排列，少数成短链状，不形成芽胞（图2）。
图1 波氏杆菌菌落形态
图2革兰氏染色镜检形态
采用压滴法、硝酸银和节思明染色法分别观察细菌的运动性、鞭毛和荚膜。压滴法可观察到细菌具有运动性，经硝酸银染色后可见细菌有周鞭毛；节思明染色后发现细菌分离物有荚膜。
（2）生化鉴定
细菌分离纯培养后，挑取单菌落分别接种10g/L 葡萄糖改良麦康凯琼脂平板、鲜血琼脂平板、胰蛋白胨大豆琼脂平板及普通营养琼脂平板，同时接种各种生化反应管，置37℃温箱培养24h～48h观察结果（表1）。
表1 生化试验结果
生化鉴定项目
结果
生化鉴定项目
结果
葡萄糖
—
过氧化氢
+
乳糖
—
尿素酶
+
麦芽糖
—
硫化氢
+
甘露醇
—
石蕊
+
蔗糖
—
硝酸盐
+
木糖
—
吲哚
—
果糖
—
MR 反应
—
注：“+”为阳性，“-”为阴性
（3）PCR分子生物学鉴定
针对Bb FlaA 基因上游序列选择合成引物，其理论扩增片段长度为237bp。上游引物：5-TGGCGCCTGCCCTAT-3，下游引物：
5-AGGCTCCCAAGAGAGAAAGGCTT-3。
LaneM：DNA1000 Marker
LaneN：阴性对照
Lane1-17：PCR扩增结果
图1 PCR电泳图
3.6 多杀性巴氏杆菌的实验室诊断
（1）细菌分离培养鉴定
在病料中蘸取后划线培养接种于TSA平板上培养16-20小时后，挑取单菌落在绵羊血琼脂培养基上经过 37℃培养 24 h，菌落呈灰白色、湿润、半透明的露珠状，不溶血( 图 1) 。革兰氏染色呈阴性，形态为两端钝圆的短杆菌( 图 2) 。在麦康凯培养基上不生长。
图2 革兰氏染色形态
图1 TSA平板上的菌落形态
（2）生化鉴定
挑取分离的单菌落，接种到脑心浸液肉汤培养基中增殖培养，取培养完成的菌液离心洗涤后接种到细菌微量发酵管中，37℃ 恒温箱中培养 16 -22 h，培养完成后查看并记录生化反应结果（表1）。
表1 生化试验结果
生化鉴定项目
结果
生化鉴定项目
结果
葡萄糖
+
VP
—
乳糖
—
单奶糖
+
麦芽糖
—
硫化氢
+
甘露醇
+
氧化酶
+
蔗糖
+
肌醇
+
木糖
+
阿拉伯糖
—
果糖
+
MR 反应
—
山梨醇
+
甘露糖
+
接触酶
+
棉子糖
—
注：“+” 为阳性， “-” 为阴性。
（3）PCR分子生物学诊断
多杀性巴氏杆菌经核酸试剂盒提取DNA 后，设计16sRNA通用引物，上游引物5-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3，下游引物：5-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3。然后经PCR扩增后，琼脂糖凝胶电泳片段约为1500bp（图3）。
Lane1-2：巴氏杆菌PCR 扩增结果
Lane3：阳性对照
Lane4： 阴性对照
Lane M：DNA2000 Marker
图3 巴氏杆菌16SRNA PCR电泳图
另外，针对巴氏杆菌不同的血清型A、B、D、E和F，有不同的鉴定引物，具体见表2：
表2巴氏杆菌血清型鉴定的引物序列
血清型
扩增引物
扩增片段大小（bp）
A
上游：5-TGCCAAAATCGCAGTCAG-3
下游：5-TTGCCATCATTGTCAGTG-3
1044
B
上游：5-CATTTATCCAAGCTCCACC-3
下游：5- GCCCGAGAGTTTCAATCC-3
760
D
上游：
5-TTACAAAAGAAAGACTAGGAGCCC-3
下游：5-
CATCTACCCACTCAACCATATCAG-3
657
E
上游：5- TCCGCAGAAAATTATTGACTC-3
下游：5- GCTTGCTGCTTGATTTTGTC-3
511
F
上游：5- AATCGCAGAACGCAGAAATCAG-3
下游：5- TTCCGCCGTCAATTACTCTG-3
851
3.7 沙门氏菌的实验室诊断
（1）细菌分离培养与革兰氏染色鉴定
腹泻仔猪肠道内容物划线培养接种于血琼脂培养基，挑取单个群落在BS琼脂纯化培养，结果在BS琼脂培养基中可见到光滑圆整、透明、中心为黑色的菌落（图1）。挑取BS琼脂培养基上的黑色菌落，按照细菌染色方法进行革兰氏染色镜检，结果显示，分离菌为革兰氏阴性短小杆菌，结果见图2。
（2）生化鉴定
将分离的纯培养单菌落，接种于普通培养基进行培养，其后将单一菌落分别接种在葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、果糖等微量生化鉴定管，37 ℃培养48 h，统计并分析试验结果（表1）。
表1 生化试验结果
生化鉴定项目
结果
生化鉴定项目
结果
葡萄糖
+
VP
—
乳糖
—
吲哚
—
麦芽糖
+
硫化氢
+
甘露醇
+
枸橼酸盐
+
蔗糖
—
MR 反应
+
注：“+” 为阳性， “-” 为阴性。
（3）PCR分子生物学鉴定
根据沙门氏菌16S rRNA基因序列设计通用引物，上游引物：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG- 3'；下游引物5'-GGCTACCTTGTTACGACTT-3'。该菌株16S rDNA基因序列PCR扩增产物大小约为1 600 bp（图1）。
Lane1：PCR 扩增结果
Lane P：阳性对照
Lane N： 阴性对照
Lane M：DNA2000 Marker
图1 PCR电泳图
