原位敲除猕猴RHO基因建立非人灵长类视网膜色素变性模型
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目录
第1章绪 论
1．1 视网膜结构及功能
1．1．1 视网膜的组成
1．1．2光信号转导通路
1．2视网膜色素变性
1．2．1 视网膜色素变性的临床特征
1．2．2视网膜色素变性的致病基因及遗传
1．2．3RHO基因的致病机理
1．3常用的视网膜色素变性动物模型
1．3．1 啮齿类动物视网膜色素变性模型
1．3．2大动物视网膜色素变性模型
1．4 CRISPR／Cas9基因编辑工具
1．5 AAV基因转导载体
1．6本课题的选题理由及主要研究内容
1．6．1 课题背景及选题目的
1．6．2课题研究内容
第2章实验材料与方法
2．1 实验动物
2．1．1 实验动物伦理许可
2．1．1实验动物管理
2．2常规分子克隆实验
2．2．1 PCR聚合酶链式反应
2．2．2 DNA凝胶回收
2．2．3限制性内切酶酶切与DNA连接
2．2．4 T-A克隆
2．2．5质粒转化实验
2．2．6鉴定目标克隆
2．2．7质粒的小量抽提
2．2．8质粒的大量抽提
2．2．9 Q-PCR实验
2．3细胞培养与转染
2．3．2 HEK293T细胞的传代
2．3．3 HEK293T细胞的转染
2．4．1 CRISPR／Cas9表达载体构建
2．4．2荧光报告基因表达载体构建
2．4．3AAV病毒的包装
2．4．4AAV病毒的纯化
2．4．5 AAV病毒滴度的测定
2．4．6AAV病毒感染力检测
2．5．1 基因组DNA的提取
2．5．2 SaCas9敲除效率检测
2．5．3 TRIzol提取RNA
2．5．4逆转录PCR(RT-PCR)
2．5．5蛋白质的提取
2．5．7 De novo Sequence
2．6冷冻切片、免疫组化和显微成像
2．6．1视网膜冷冻切片
2．6．2免疫组化染色
2．7视网膜下腔注射
2．7．1 猕猴视网膜下腔注射
2．7．2小鼠视网膜下腔注射
2．8猕猴视网膜临床检查
2．8．1 眼底成像与荧光造影成像
2．8．2 OCT成像
2．9透射电子显微镜(TEM)成像
2．10 离体视网膜电图(ex vivo ERG)记录
2．10．1 离体ERG
2．10．2 ERG a-wave的分离
2．11 统计分析
第3章实验结果与结论
3．2 AAV-CRISPR／SaCas9系统有效性检验
3．2．1 hSyn启动子在HEK293T和感光细胞中有效表达检验
3．2．2视网膜下腔注射shH10血清型AAV特异感染感光细胞
3．2．3体外检验CRISPR／SaCas9系统有效性
3．3 在体AAV-CRISPR／SaCas9系统有效敲除猕猴感光细胞RHO
3．3．2猕猴感光细胞RHO被有效敲除
3．3．2 cas9-RHO视网膜RHO蛋白表达显著降低
3．4敲除RHO的猕猴视网膜产生类似RP的感光细胞退化
3．4．2 Cas9-RHO视网膜视锥细胞发生退化
3．4．3 Cas9-RHO视网膜进行性退化
3．4．4 Cas9-RHO视网膜发生胶质细胞活化
3．5 Cas9-RHO视网膜显示出与RP一致的临床特征
3．5．2 Cas9-RHO视网膜表现明显的外核层变薄
3．5．3 OCT显示Cas9-RHO视网膜进行性退化
3．6 Cas9-RHO视网膜中视杆细胞亚细胞结构退化
3．7 Cas9-RHO视网膜的视网膜生理功能受损
3．7．2 Cas9-RHO视网膜感光细胞光反应降低
4．1 工作总结
4．2工作创新性及其应用
4．2．1 本研究意义和创新性
4．2．2本研究应用
4．3工作局限及未来方向
4．3．1 基于生殖细胞基因编辑的非人灵长类RP模型仍是必要的
4．3．2更高效的在体基因编辑效率
4．3．3机械损伤与病理发生相分离
4．3．4在体基因编辑效率的确定
4．3．5在体基因编辑的拓展
参考文献
附录
致谢
在读期间发表的学术论文与取得的研究成果
相关知识
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