高效快速基因靶向调控及编辑技术系统研究

• 花匠小妙招
• 2024-11-30 20:54

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第一章 绪论

1.1 基因调控和编辑技术

1.1.1 归巢核酸内切酶（HE）

1.1.2 锌指核酸酶（ZFN）

1.1.3 转录激活样效应因子（TALE）

1.1.4 CRISPR/Cas9

1.1.5 CRISPR/Cpf1

1.1.6 CRISPR/Cas13b

1.1.7 脱靶效应

1.1.8 几种基因组编辑技术的比较

1.2 诱导分化疗法

1.2.1 分化诱导剂

1.2.2 转录调控实现肿瘤诱导分化疗法

1.3 转录因子和染色质免疫沉淀

1.3.1 转录因子

1.3.2 转录因子NF-κB的介绍

1.3.3 ChIP-seq

1.4 本论文研究内容和意义

第二章 高效构建TALE-TF的新方法用于肿瘤诱导分化

2.1 引言

2.2 实验材料

2.2.1 生物材料和仪器

2.2.2 质粒的制备

2.2.3 单体的制备

2.2.4 人工TALE的构建

2.2.5 细胞培养和转染

2.2.6 使用TALE激活报告基因

2.2.7 基因表达检测

2.2.8 检测细胞活力和周期

2.2.9 细胞迁移的检测

2.2.10 TALE 的基因编辑和激活

2.3 结果与分析

2.3.1 TALE单体和骨架的制备

2.3.2 TALE构建的流程

2.3.3 人工TALE的构建

2.3.4 用TALE激活外源基因

2.3.5 用TALE激活内源基因

2.3.6 用TALE分化癌细胞

2.3.7 用TALE激活编辑的内源基因

2.4 讨论

2.5 本章小结

第三章 高效构建TALEN载体精准编辑NF-κB家族基因

3.1 引言

3.2 材料和方法

3.2.1 实验材料和仪器

3.2.2 线性TALEN单体的制备

3.2.3 TALEN骨架和sgRNA-CRISPR/Cas9质粒的构建

3.2.4 同源臂供体克隆的制备

3.2.5 TALEN和CRISPR靶标的设计

3.2.6 构建靶向18 bp DNA靶点的TALEN

3.2.7 构建靶向NF-κB的sgRNA-CRISPR/Cas9

3.2.8 细胞培养和转染

3.2.9 检测基因编辑的效率

3.2.11 通过流式细胞仪分选阳性细胞

3.2.12 检验NF-κB-ZsGreen 融合蛋白的生物功能

3.2.13 统计分析

3.3 结果与分析

3.3.2 用新型无质粒单体构建TALEN 的流程

3.3.3 构建针对NF-κB家族基因的TALENs

3.3.4 同源重组的编辑效率研究

3.3.5 NF-κB-ZsGreen 蛋白活性的验证

3.3.6 阳性细胞的筛选和培养

3.3.7 比较MiR533和BAY 11-7082对NF-κB的作用

3.4 讨论

3.5 本章小结

第四章 基于TALEN及同源修复的细胞及蛋白双标记系统

4.1 引言

4.2 材料和方法

4.2.1 实验材料和仪器

4.2.2 TALEN和CRISPR/Cas9表达载体的构建

4.2.3 两种同源臂供体的制备

4.2.4 细胞培养和转染

4.2.5 检测基因编辑的效率

4.2.6 通过RT-qPCR进行同源重组验证

4.2.7 阳性细胞的筛选

4.2.8 免疫荧光测定

4.3 结果与分析

4.3.1 双标签同源重组的编辑效率研究

4.3.2 阳性细胞的筛选和NF-κB-SBP蛋白的验证

4.4 讨论

4.5 本章小结

第五章 基于TALEN建立的双标记系统用于ChIP-seq

5.1 引言

5.2 材料和方法

5.2.2 TALEN的构建和同源臂克隆

5.2.3 细胞培养和转染

5.2.4 甲醛交联和阳性细胞的筛选

5.2.5 Tn5转座体的制备

5.2.6 NGS库的准备

5.2.7 测序文库的制备

5.2.8 测序结果分析

5.3 结果与分析

5.3.1 实验原理和阳性细胞的筛选

5.3.2 Tn5酶切基因组

5.3.3 文库制备

5.3.4 文库测序结果

5.3.5 NF-κB靶基因鉴定和GO分析

5.3.6 NF-κB靶基因KEGG分析

5.4 讨论

5.5 本章小结

第六章 总结和展望

参考文献

作者简介

致谢

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