纳米磁珠介导牡丹花粉转基因技术的研究
纳米磁珠介导牡丹花粉转基因技术的研究
牡丹(Paeonia Sect.Moutan)遗传背景复杂,通过杂交育种培育一个新品种至少需要10余年时间,包括转基因育种在内的分子育种将成为牡丹遗传改良的主要发展方向。然而,牡丹组织离体再生困难,至今尚未建立成熟的遗传转化技术体系。因此,探索一种简单、快速、有效的遗传转化新方法对牡丹育种具有重要意义。本研究采用四氧化三铁纳米磁珠转化方法,首次进行了花粉介导牡丹转基因的研究,选用磁性纳米颗粒(Magnetic nanoparticles,MNPs)poly MAG100为基因载体,构建不同质量比的纳米载体-基因复合物;通过琼脂糖凝胶电泳阻滞试验分析poly MAG100与DNA的结合能力以及保护DNA免受消化酶降解的能力;利用MNPs吸附质粒DNA,在磁场的作用下,将FT-EPSPS目的基因导入花粉,通过离体培养研究磁转染处理对花粉活力的影响;研究牡丹三个杂交组合FI代植株对草甘膦盐溶液的敏感性,及对潮霉素溶液的抗性,探究得出适宜牡丹的筛选体系;对初步筛选出的抗性种苗进行外源基因分子检测,分析其在牡丹基因组中的整合情况。所得结论如下:1 poly MAG100与DNA的质量比为1:1-1:10时,能够与DNA稳定结合,并能保护DNA免受酶的消化作用,是一种较为理想的基因载体。2磁转染‘凤丹’、‘京红’以及实生紫斑牡丹三种牡丹的花粉,萌发率依然保持在50%以上,与未处理的花粉相当,说明磁转染处理对花粉没有造成明显损伤。3草甘膦盐溶液处理植株叶片受害的程度,随着处理浓度增加有所加重,在溶液浓度比例为1:100-1:25的范围内,经处理地块的杂草全部死亡,但牡丹叶片只是尖部有所干枯;当溶液浓度比例增加到1:5时,牡丹叶片干枯、变黄受害现象明显,易于分辨。4在经2200mg/ml的潮霉素溶液筛选后,挑选无明显叶色反应的抗性植株进行分子检测,共筛选出22株转基因PCR阳性幼苗。本实验采取了花粉介导牡丹转基因的全新研究方法,在后续研究工作中可综合运用CRISPR-Cas9分子技术,培育牡丹优质新品种,加快推动牡丹分子育种事业的进程。
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