采用花序浸染法将线性基因表达框导入拟南芥
采用花序浸染法将线性基因表达框导入拟南芥
花序浸染法通过花器官进行转化,转化部位为胚珠,可以直接获得转基因种子,不需要经过组织培养的过程。与叶盘转化法和基因枪法等传统的植物遗传转化方法相比,该方法具有育种周期短、操作简单和转化率高等优点,农杆菌介导的花序浸染法已经在多种十字花科植物的转化中取得了成功,但是,筛选标记基因和载体骨架序列引发的转基因作物的安全性问题越来越受到公众的关注。因此,本文通过花序浸染法将最小线性基因表达框转入拟南芥,旨在探索一种无载体、无标记和无需组织培养的转化体系。本文以模式植物拟南芥为材料,卡那霉素筛选拟南芥转基因种子既可靠又省时省力,因此本研究选择卡那霉素抗性基因(NPTⅡ基因)为目的基因,设计了无载体的NPTⅡ基因表达框(nos启动子-NPTⅡ基因表达框-nos终止子,基因表达框两侧分别包含25 bp的T-DNA左右边界序列)。通过花序浸染法将该表达框导入拟南芥,转化缓冲液为1/2MS+0.05%Silwet L-77+5%蔗糖,其操作要点是将DNA转化溶液直接滴加在花蕾上。另外,本研究以农杆菌和质粒作为对照,同样采用花序浸染法转化拟南芥,而且比较了这三种转化方法的转化率、外源基因的整合特点和遗传稳定性。通过卡那霉素筛选阳性植株,多次独立重复转化实验结果表明农杆菌、质粒和基因表达框介导的花序浸染法转化的平均转化率分别为0.72%、0.19%和0.08%,农杆菌和质粒转化稳定性和重复性好,线性片段转化的重复性不稳定,基因表达框转化的9次重复转化实验中有5次得到阳性植株。PCR检测结果表明NPTⅡ基因已导入到拟南芥基因组,对T1代植株Southern杂交结果表明农杆菌转化植株有1-4个插入位点,质粒转化植株有2-4个插入位点,基因表达框转化的植株的NPTⅡ基因是以单插入位点的方式插入.后代遗传分析表明这三种转化方法的NPTⅡ基因都能够在T1代植株中稳定表达,而且部分株系T1代植株的性状分离比符合孟德尔分离比。本研究首次通过花序浸染法将无载体的线性DNA片段导入拟南芥,初步建立了一种无需组织培养和再生植株过程,且有生物安全性的无载体无标记基因的植物转化体系。从理论上讲,将该方法可以应用于一些特殊的基因,如编码决定植物某一形态性状的结构基因或是编码决定植物体内某一生理、生化性状的结构基因,那么就可以通过本体系将线性基因表达框直接导入目标植物,这样的得到的转基因植株既可以表达外源目的基因又具有生物安全性,而且只需要通过植物颜色、形态的改变或生理筛选来鉴别外源基因是否转化到植株中。该成果有可能推广应用到其他十字花科作物中,如油菜、萝卜等,因此该转化系统具有广泛的应用前景。
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