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植物遗传转化农杆菌浸花法研究进展

花匠小妙招
2024-11-23 09:54

1、中国农学通报2010,26(16:22-25Chinese Agricultural Science Bulletin 0引言遗传转化方法是进行基因功能分析和改良作物性状的必要手段,大多数的转化方法都需要组织培养技术,熟练的操作人员和特殊的设备。途经愈伤组织培养阶段的禾谷类转化方法是非常成功的,但也存在许多的限制因素。通过组织培养技术进行单细胞的选择并再生出整个植株虽然减少了嵌合体的出现,但是由于后生影响和染色体重排就会出现体细胞无性系变异。利用浸花的方法进行转基因,其特点是避免了组织培养和再生过程1-6。前人的研究表明,浸花得到的T 0代种子是典型的杂合子,在同一插入位点只有2个等位基因中的

2、一个3,7。大量的结果表明转化发生在花发育的后期3,8。尽管浸花的方法有较高的转化率(T 0代种子约4%,但对于转化的细胞和转化的时间仍然基金项目:国家转基因生物新品种培育重大专项“抗逆转基因玉米新品种培育”(2008ZX08003-004。第一作者简介:高建强,男,1975年出生,博士研究生,生物化学与分子生物学,从事玉米抗逆转基因育种研究,通信地址:北京中关村南大街12号中国农业科学院生物技术研究所,Tel E-mail :gaojq123 。植物遗传转化农杆菌浸花法研究进展高建强,梁华,赵军(中国农业科学院生物技术所,北京100081摘要:为了为玉米农杆菌介导

3、浸染花序遗传转化方法找到理论依据,论述了浸染花序的遗传转化方法在拟南芥中的研究进展,说明农杆菌浸染的目的受体是胚珠,证实转化时间发生在授粉前。近年在黑麦和小麦的浸染花序遗传转化上的研究结果证实,农杆菌介导的浸染花序的遗传转化方法在禾本科麦类作物是可行的。遗传转化方法是进行基因功能分析和改良作物性状的必要手段,经愈伤组织培养阶段的禾谷类转化方法存在许多的限制因素,农杆菌介导的浸染花序遗传转化方法避免了愈伤组织培养过程,而且可节省大量的时间,为作物的遗传改良提供有效的快速获得转基因植株的方法。关键词:浸花法;植物遗传转化;拟南芥;生殖细胞;禾本科中图分类号:Q812文献标志码:A论文编号:2010

4、-0931Progress on the Floral-dip Method of Agribacterium-mediated Plant TransformationGao Jianqiang,Liang Hua ,Zhao Jun(Biotechnology Research Institute ,Chinese Academy of Agricultural Sciences ,Beijing 100081Abstract:In order to find the theoretical basis for floral-dip genetic transformation metho

5、d in maize mediatedby Agrobacterium ,This article discusses the development of floral-dip genetic transformation method inArabidopsis .It shows that the purpose receptor of Agrobacterium infection is ovule,and the conversion timeoccurs before pollination.In recent years the study of floral-dip genet

6、ic transformation in rye and wheat suggested that Agrobacterium -mediated floral-dip genetic transformation methods in wheat grass is feasible.It is necessary means of genetic transformation method for gene function analysis and improvement of crop traits.There are many constraints for transformatio

7、n method of cereal by the callus culture phase.The floral-dip genetic transformation method mediated by Agrobacterium avoids the process of callus culture and save a lot of time,so it can be to provide fast and effective transgenic method of crops genetic improvement .Key words:floral-dip;plant gene

8、tic transformation;Arabidopsis thaliana ;germ cell;gramineae高建强等:植物遗传转化农杆菌浸花法研究进展不太清楚。1浸花转基因法在拟南芥上的研究进展1998年,Clough 等6改进了拟南芥浸染方法,用5%蔗糖,500L/L 的silwet L-77,OD 600=0.8的浸染液浸醮替代真空渗入,得到了0.5%3%的转化率。并总结了转化成功的3个条件:合适的发育时期、蔗糖浓度和表面活性剂。1999年Ye 等9用GUS 作为标记基因通过真空渗入法证实,GUS 基因是通过胚珠传递的。GUS 在转化植株的胚珠中是始终表达的;在成熟的花粉和花粉

9、囊中,只是在转化后012天表达,在转化35天后花粉的表达频率只达到1%,而在511天未开花的胚珠中表达率则高达6%。尤其是转基因种子只能在导入基因的花粉受体植株上得到,而不是花粉供体植株上得到。这说明农杆菌的转化是通过胚珠进行的。2000年,Desfeux 等10为证实转基因的受体是雌配子而不是雄配子,用被注射农杆菌的拟南芥作为母本或者父本进行大量的杂交实验,结果表明,只有被注射农杆菌的拟南芥作为母本供体才能产生转基因后代。实验还监测到T-DNA 携带的GUS 报告基因的在各胚珠上的染色,却没有在花粉中观测到染色(图1,T-DNA 的插入事件在来自同一角果的各转基因籽苗之间是相互独立的。综合以

10、上内容可以认为,转基因的主要靶目标是胚珠。进一步观察表明,在有些情况下所有胚珠都被染色,而有些情况下只在胚囊靠近珠孔的部位的胚珠内部才被染色。这可能是不同的发育阶段即从胚珠原基到胚珠的各个发育阶段甚至新授粉的胚充当了效果不同的转化目标所致,但是花粉从萌发到授粉都没有观察到染色。Bechtold 等11确定了拟南芥转化的基因组是母体的基因组。综上所述,在拟南芥中农杆菌介导的转基因方法,不论是浸花法还是真空渗入法,T-DNA 片段只能通过胚珠传递而不能通过花粉传递。Labra 等12在拟南芥上用浸花的方法获得了稳定表达的转基因植株。2浸花转基因法在禾本科作物上的研究进展 Pe ña 等1

11、3将外源DNA 注射到黑麦的幼穗上得到了转基因植株。转化时期是根据小穗发育的形态来确定:当植株长到5片叶,旗叶达到终长度的1/31/2时,大约在植株第3片叶的地方,具有一个大约2cm 的花序,这个时候的花序最适合注射。结核菌素试验证明此时距离减数分裂还有14天。注射后的花序逐渐发育成熟,并授粉结实(图2。结果表明,可能将新的遗传信息导入谷物类的生殖细胞,收获的种子能够长成正常的植株,外源基因已经存在于植株基因组中并表达。重复试验也验证了上述结果,其平均转化率大约为0.3%。Pe ña 假定DNA 是通过植物的维管系统进入生殖细胞的,而生殖细胞只在一个合适的时期能够吸收外来的DNA 。

12、这个时期在黑麦栽培种中大约是减数分裂前2个星期,相当于雄性组织的减数分裂前,倒数第二次有丝分裂期14。因为雄性生殖细胞没有被胼胝质壁所包围,所以不能被转化。为了进行减数分裂,细胞经历了许多的改变,其中与摄取DNA 相关的最重要的改变,是建立了联系孢原细胞的染色质通道,DNA 分子可以通过这些结构进入细胞15。Janice 等16用浸花的方法成功转化了六倍体小麦并能稳定表达外源基因。用处于开花前,单核小孢子的前、中、后期的小穗做实验。小穗的长度由于培养条件的不同而有所不同,最合适的小穗长度大约在67cm ,此时小穗还未露出叶鞘。用剪刀轻轻去除叶鞘并剪去正在发育的小花,去除顶端和未端发育不良的小花

13、而保留中部的小花,保留的小花剪到颖壳的未端,处理过的小穗浸在农杆菌浸染液中1.52min ,并套塑料袋2天以保持较高的湿度(图3,浸花转化在孕穗早期,A ,B ,C 和D :ACT11-gusA (无内含子。C 和E :ACT11-gusA-intron 。图1GUS 在胚珠或花中发育种子通过带有ACT11-gusA农杆菌介导转基因植株中的表达··23小麦小穗还未抽出叶鞘时进行。然后,去除塑料袋使小穗在空气中晾干。当小穗发育到开花期时,套上羊皮纸袋以阻止异花授粉,尽管这会降低结实率。成熟的种子记为T 0,收获并进行筛选。在T 0代植株上检测到了转基因信号,并观察到相关基因的

14、表型。试验结果表明,不使用组织培养技术的浸花转基因方法,可以获得稳定遗传低拷贝数的转化株,在T 5和T 6代都观察到了基因的表达。3浸花转基因方法在其他物种上的研究进展Bartholmes 等17以两年生草本植物荠菜(Capsellabursa-pastoris 为材料,用2种农杆菌LBA4404和图2转化计划与筛选策略示意图图3小麦浸花转化的时期GV3101为载体,以GFP 和BAR 为标记基因,通过浸花的方法进行转化。图4中可以清楚的看到,GFP 和BAR 基因在转化后代中表达。证明此方法在荠菜(Capsella bursa-pastoris 中的转化是成功的。收获的种子播种,发芽率最低

15、1%,大多数30%50%,最高可达80%。结果显示,MS 培养基改变成份并不影响转化效率,0.02%0.05%Silwet L-77对转化效率的影响也不大,10%的蔗糖和GV3101菌株下转化效率最高。4前景当前,人们也在尝试采用不通过组织培养的技术来取得转基因的成功。如花粉管通道法、子房注射法,茎尖浸染法等,到目前为止,还没有一个方法称得上非注射DNA2cm 花序卡那霉素抗性株处理植株的防杂交卡那霉素筛选比例尺2cmabcd1mm1mm1cm··24高建强等:植物遗传转化农杆菌浸花法研究进展常适用。而从拟南芥上发展过来的浸染花序的方法,在许多作物的转化中非常有效。浸染花序

16、的转基因方法简单易行,也不需要经过组织培养过程,为玉米及其他作物中转化方法的研究提供了一个新的思路,即不使用组织培养技术的情况下,高效率获得转基因植株。在禾本科的黑麦和小麦上已经获得了成功,同样作为禾本科作物的玉米也应该适合该方法,主要在于如何实施设计试验方案。我们采用适用于玉米的类似拟南芥浸染花序的方法进行转基因方法的研究,试图找出用农杆菌介导的禾本科作物基因遗传转化的最简便、有效的方法,建立不依赖于植物细胞和组织培养的高效、规模化的转化体系,使基因工程技术能与常规育种有效结合,成为大多数育种工作者手中的有力工具,促进更多的基因工程品种用于生产。进而推动当前农作物生物工程的发展。参考文献1

17、FeldmannKA,MarksMD.Agrobacterium -mediatedtransformation of germinating seeds of Arabidopsis thaliana :a non-tissue culture approach J.Mol Gen Genet,1987,208:1-9.2Feldmann K.T-DNA insertion mutagenesis in Arabidopsis :seed infection transformation/Koncz C,Chua N-H,Schell J.Methods in Arabidopsis Res

18、earchC.World Scientific,Singapore,1992:274-289.3Bechtold N,Ellis J,Pelletier G.In planta Agrobacterium mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plantsJ.C R Acad Sci Paris Life Sci,1993,316:1194-1199.4Chang S S,Park S K,Kim B C,et al.Stable genetic transformation of Arabid

19、opsis thaliana by Agrobacterium inoculation in plantaJ.Plant J,1994,5:551-558.5Katavic V ,Haughn G W,Reed D,et al.In planta transformation ofArabidopsis thaliana J.Mol Gen Genet,1994,245:363-370.6Clough S J,Bent A F.Floral dip:a simplified method forAgrobacterium -mediated transformation of Arabidop

20、sis thaliana J.Plant J,1998,16:735-743.7Feldmann K.T-DNA insertion mutagenesis in Arabidopsis :mutational spectrumJ.Plant J,1991,1:71-82.8Azpiroz-Leehan R,Feldmann K A.T-DNA insertion mutagenesis inArabidopsis :going back and forthJ.Trends Genet,1997,13:152-156.9Ye G N,Stone D,Pang S Z,et al.Arabido

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