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革兰氏阳性菌在与过敏性紫癜相关的肠道微生物群变化中占主导地位

花匠小妙招
2024-12-07 17:09

编译：微科盟逍遥君，编辑：微科盟茗溪、江舜尧。

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导读

目的：免疫球蛋白A血管炎（IgAV），以前称为过敏性紫癜，是最常见的血管炎，具体表现为紫癜性皮疹。目前，与IgAV相关的因素仍未得到充分了解。本文中，研究人员旨在检查与IgAV及其恢复相关的肠道微生物组变化。研究人员收集了10名IgAV儿童（6-14岁）在接受多种药物治疗前后的粪便样本，以及9名年龄匹配的健康儿童。对样本进行宏基因组分析，以研究肠道微生物组的分类和功能变化。

结果：分析显示，与健康对照相比，治疗前患者表现出肠道微生物群的分类和功能显著改变，包括104个物种显著减少和7个物种显著增加（FDR < 0.05）。治疗后，IgAV患者微生物群变化部分恢复，因为患者和健康对照之间一些生物标志物（例如9个属和22个物种）的相对丰度相近（FDR > 0.1）。响应治疗的标志物包括Weissella、Faecalibacterium prausnitzii和Bifidobacterium pseudocatenulatum，以及假定的谷氨酰胺转运系统的三个组成部分。重要的是，革兰氏阳性菌占与IgAV相关并对治疗有反应的物种数量和总相对丰度的85%以上。此外，在122个IgAV显著减少的细菌基因中，82个为革兰氏阳性菌，革兰氏阴性菌仅有12个。

结论：革兰氏阳性菌是IgAV肠道微生物群变化的主要驱动因素，这可能有助于对该疾病的更合理的控制和治疗。

论文ID

原名：Metagenomic profiling reveals dominance of gram-positive bacteria in the gut microbiome shifts associated with immunoglobulin A vasculitis （Henoch–Schönlein Purpura）

译名：宏基因组分析揭示革兰氏阳性菌在与免疫球蛋白A血管炎（过敏性紫癜）相关的肠道微生物群变化中占主导地位

期刊：Clinical & Translational Immunology

IF：6.161

发表时间：2021年10月8日

通讯作者：黄永坤 & Xu Qian

通讯作者单位：昆明医科大学第一附属医院 & 上海市第十人民医院（暨同济大学附属第十人民医院）

DOI号：10.1002/cti2.1342

实验设计

结果

1.多种药物联合治疗和治疗结果

采用多种药物联合的方案治疗IgAV患者，包括红花黄注射液、阿莫西林/克拉维酸钾（青霉素皮试阳性或肺炎支原体感染患者用阿奇霉素替代）3种基础药物和维生素C以及条件特异性药物（如泼尼松、奥美拉唑、肝素或更昔洛韦）等（附表1）。该疗法，以下简称SACV，持续5至21天。在接受SACV治疗的33例患者中，32例治愈，1人（男性，12岁，住院ID：1132280）出现顽固性肾脏症状，随后发展为慢性紫癜性肾炎（图1a和附表1）。与患者症状消退一致（图1b和附表1），该疗法导致三个IgAV相关血清特征得到改善（FDR < 0.05；图1c），其中包括两个高凝指标（即纤维蛋白原降解产物和D-二聚体）和一种炎症指标（即红细胞沉降率）。32例治愈患者中，4例复发，均在治疗后第1年后半期出现皮疹和关节炎，但症状最终全部消失（附表1）。尽管治疗表现出相对较好的疗效，但由于缺乏随机治疗对照，因此研究人员在解释发现或评估疗效时非常谨慎。尽管如此，结果仍然能够分析与恢复相关的肠道微生物群变化。重要的是，不同部位或器官的炎症体征，特别是胃肠道中的炎症体征（如粪便隐血）（附表1），表明肠道环境发生了变化。

图1. SACV多种药物联合治疗方案的结果。（a）患者个性化用药和治疗结果的总结。虚线框内的参与者进行宏基因组分析。（b）治疗期间代表性患者的皮肤表现。（c）患者IgAV相关血清指标的治疗反应。N.S.表示无显著差异。

2.IgAV患者肠道微生物组的结构和分类变化

为了检查与IgAV相关的肠道微生物群特征，研究人员使用宏基因组学技术分析了SACV治疗前后10名随机选择的IgAV患者的粪便样本。与健康对照相比，治疗前IgAV患者的微生物多样性降低，如Shannon-Wiener指数（Wilcoxon秩和检验，调整后P < 0.05；图2a）和不同的微生物结构所示（主坐标分析，ANOSIM测试，调整后的P < 0.01；图2b）。治疗后，IgAV患者的微生物多样性部分得到恢复，尽管IgAV患者的初始治疗值和治疗后值之间没有统计学差异（Wilcoxon秩和检验，调整P = 0.684），治疗后IgAV患者的Shannon-Wiener指数与健康对照组相近（Wilcoxon秩和检验，调整P = 0.104；图2a）。此外，健康对照组和患者之间微生物结构的差异（Wilcoxon秩和检验，调整后的P < 0.05）不受治疗的明显影响（图2b）。总的来说，研究人员对肠道微生物群多样性和结构的发现表明，相当大的组成改变与IgAV相关，并且在SACV治疗后部分恢复。

接下来研究人员检查了参与者肠道微生物组的分类特征，并揭示了治疗前IgAV患者和健康对照之间存在的显著差异。在门水平，IgAV组真菌Blastocladiomycota的相对丰度增加，而厚壁菌门的相对丰度减少（Wilcoxon秩和检验，FDR < 0.05；图2c和附表2）。在属水平上，IgAV患者的5个分类单元的相对丰度显著升高，包括Allomyces（Blastocladiomycota内的一个真菌属）、Arsenophonus、Candidatus Azobacteroides、Clostridia bacterium UC511A9和Clostridiales bacterium VE202-07；此外还有44个分类单元的相对丰度显著降低，包括Roseburia、Fecalibacterium、Eubacterium、Firmicutes bacterium CAG:65和Coprococcus（Wilcoxon秩和检验，FDR < 0.05；图2c和附表2）。IgAV患者中的相对丰度显著增加和降低的分类单元之间的高偏向性也保持在物种水平，与健康对照相比，IgAV组种有7种细菌和1种真菌的相对丰度增加，有104种细菌的相对丰度降低（图2d和附表2）。这种在IgAV组相对丰度下降的分类单元比相对丰度增加的分类单元数量明显更多的不平衡模式与在治疗前患者中观察到的微生物多样性减少相一致（图2a）。

图2. IgAV患者肠道微生物群的分类变化。（a）样本的Shannon指数。（b）基于物种丰度的Bray-Curtis距离度量的PCoA。（c）在健康对照和治疗前IgAV患者之间显著不同的（FDR<0.05）的门、属和种水平上富集的分类群的相对丰度。括号中的“F”、“G-”、“G+”和“unk”分别代表真菌、革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和未知分类菌。（d）属和种的数量在健康对照和治疗前IgAV患者之间显示出相对丰度的差异（FDR<0.05）。Gram- bact.：革兰氏阴性菌；Gram+ bact.：革兰氏阳性菌；Unknown bact.：具有未知分类菌；IgAV-increased：在治疗前IgAV患者中相对丰度增加；IgAV-decreased：在治疗前IgAV患者中相对丰度降低。

3.治疗前IgAV相关分类群的治疗反应

治疗后肠道微生物多样性得到部分恢复（图2a）意味着一些IgAV相关分类群的相对丰度与恢复过程相关。为了研究这个问题，研究人员首先将对治疗有响应的特征定义为一个微生物组成分，结果显示，在对照和IgAV之间存在显著差异的相对丰度（Wilcoxon秩和检验，HC-pthIgAV FDR > 0.1）在治疗后显著性消失（Wilcoxon 秩和检验，HC-IgAV FDR < 0.05）。研究发现，尽管大多数与IgAV相关的分类单元不受治疗影响，但其中的一部分的相对丰度值接近健康对照中的相应水平（图2c，图3，附图1，附表1和附表2）。值得注意的是，没有应答物种显示出初始值和治疗后值之间的统计差异，这进一步证实了治疗后微生物群部分恢复的观察结果（图2a）。在属水平上，8个分类群显示出治疗反应，包括44个治疗前IgAV减少的6个属，即Weissella、Brachybacterium、Faecalibacterium、Cryptobacterium、Brachyspira和Lachnospiraceae_bacterium_5_1_57FAA，以及在治疗前IgAV显著增加（5个属）的2个属，包括Clostridiabacterium UC511A9和真菌分类群Allomyces。

在物种水平上，22个分类群对治疗产生响应，包括在治疗前IgAV减少的104个种中的21个种以及在治疗前IgAV增加的7个种中1个种。这些对治疗有响应的微生物包括Brachybacterium muris、Butyrivibrio sp. AD3002、Clostridium sp. CAG:43、Clostridium sp. CAG:7、Brachyspira pilosicoli、Butyrivibrio crossotus CAG:259、Blautia sp. Marseille-P2398、Ruminococcus sp. CAG:9、Eubacterium eligens和Enterococcus casseliflavus。上述结果表明，多药联合治疗与IgAV相关分类单元转变的部分恢复相关（图2c，图3，附图1，附表1和附表2）。

分类结果的一个有趣现象是革兰氏阳性菌占与IgAV相关的大多数物种（17/111；84.7%）和对治疗有响应的大多数物种（20/22；90.9%；图2d和图3e和附表2）。实际比例可能更高，因为8种IgAV相关的未知分类菌属中有7种是Firmicutes或Clostridiales（其中大多数成员为革兰氏阳性）。然而，由于以下两个原因，革兰氏阳性分类群的数量更多并不一定意味着它们是IgAV相关转变的主要驱动因素：（i）革兰氏阳性生物标志物的相对丰度总体上可能远低于革兰氏阴性菌；（ii）细菌系统发育存在争议和不断变化，这导致可能将一个物种视为多个物种的情况。鉴于此，研究人员计算了与IgAV相关且与SACV治疗相关的革兰氏阳性物种或革兰氏阴性物种的组合相对丰度。结果显示，在健康对照和IgAV患者中，革兰氏阳性菌占两种生物标志物总丰度的85%以上，而革兰氏阴性菌所占的比例很小（图4a、b）。这与此处检查的所有其他疾病中生物标志物的革兰氏阳性份额形成鲜明对比（附图2）。

研究人员接下来的分析种把革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性细菌作为一个整体（附表3），而不仅仅是上述的生物标志物（在健康对照和IgAV患者之间的表现是否不同）。PCoA显示，与革兰氏阴性菌群相比，革兰氏阳性菌群在健康对照组和IgAV患者之间表现出更好的分离（对于革兰氏阴性菌群，P = 0.014 和 R = 0.101；对于革兰氏阴性菌群，P = 0.001 和 R = 0.380；图4c、d），表明革兰氏阳性菌在IgAV相关的变化中比具有不同包膜超微结构的革兰氏阴性菌更敏感。因此，多条证据表明革兰氏阳性菌是IgAV相关分类转变的主要驱动因素。

图3. 对治疗有响应的微生物分类群。对治疗有响应的分类群（属：a和b；种：c和d）被定义为那些在健康对照和治疗前患者（HC-IgAVFDR<0.05）之间相对丰度存在显著差异但在健康对照组和治疗后患者之间显著差异消失（HC-pthIgAVFDR>0.1）。Wilcoxon秩和检验的结果显示在每个框的顶部（N.S.：无显著差异；*：FDR<0.05；**：FDR<0.01）。括号中的“F”、“G-”和“G+”分别表示真菌、革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。（e）治疗响应属（上图）和物种（下图）的数量。Gram- bact.：革兰氏阴性菌；Gram+ bact.：革兰氏阳性菌。

图4. 革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌之间的总体差异。（a，b）与治疗前的IgAV患者（a）相关并且对治疗（b）在健康对照和治疗前IgAV患者中产生反应的属和种的组合相对丰度，显示联合治疗中革兰氏阴性菌占优势相对丰度。Gram- bact.：革兰氏阴性菌；Gram+ bact.：革兰氏阳性菌；Unknown bact.：未知分类菌。（c，d）基于物种丰度的Bray-Curtis距离度量，IgAV患者中所有肠道革兰氏阴性菌或所有肠道革兰氏阳性菌的变化。

4.IgAV患者肠道菌群功能的改变

研究人员接下来研究了IgAV患者在疾病期和恢复期的微生物功能特征。在京都基因和基因组百科全书（KEGG）同源组（KOs）功能注释的4826个基因中，有143个基因在健康对照组和治疗前IgAV患者之间显著富集，其中21个基因在患者中表达较高，122个在患者中表达较低（图5a、b和附表4；Wilcoxon秩和检验，FDR < 0.05）。因此，分类和功能变化的特征为IgAV组降低数量更多（图2）。健康对照组和IgAV患者之间菌群结构的明显分离证实了功能存在差异（Wilcoxon秩和检验，P = 0.002；图5c）。尽管SACV治疗并未明显影响整体功能转变（Wilcoxon秩和检验，P = 0.671；图5c），但10个KOs表现出对治疗的响应，包括IgAV患者中7个KOs降低和3个KOs增加（Wilcoxon秩和检验，HC-pthIgAV FDR > 0.1）。这些响应治疗的KOs包括假定为谷氨酰胺转运系统的三个基因，即ABC.GLN1.A（K10041；ATP结合蛋白）、ABC.GLN1.S（K10039；底物结合蛋白）和ABC.GLN1.P（K10040，通透酶蛋白）。其他对治疗有反应的KOs包括dgt（K01129；dGTPase）、hpsN（K15509；磺基丙二醇3-脱氢酶）、atpA（K02111；F-型 H+-转运ATP酶亚基α）、mtnN（K01243；腺苷高半胱氨酸核苷酶）、pct（K01026；丙酸辅酶A转移酶）、bfr（K03594；细菌铁蛋白）和trbC（K12059；接合转移菌毛组装蛋白）。

HUMAnN221用于鉴定功能生物标志物的分类贡献者（图5d，补充图3和补充图4）。根据革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌这两种细菌的贡献，研究人员将KOs分为5类：革兰氏阳性主导（所有前7名已确定的贡献者均为革兰氏阳性；在前7名已确定的贡献者中，只有一种革兰氏阴性菌及其排名不高于第四），革兰氏阳性多数（在前7名确定的贡献者中，只有一种革兰氏阴性物种，其排名为第二或第三），革兰氏阴性主导（除革兰氏阴性物种外均为革兰氏阳性领先），革兰氏阴性多数（作为革兰氏阳性多数，但革兰氏阴性物种占优势）和贡献相当（其余病例）。在IgAV增加和减少的KOs中，研究人员观察到革兰氏阳性细菌的贡献与KO的相对丰度排序（在健康对照中）之间存在负相关（图5e）。具体来说，前12个丰度最高的IgAV增加的Kos都是革兰氏阴性主导，而在其余9个IgAV增加的KOs中，分别有3个贡献相当、1个革兰氏阳性多数和1个革兰氏阳性主导。对于IgAV减少的KOs，在30个丰度最高的KOs中只有4个革兰氏阳性主导，没有革兰氏阳性多数（前20个中有1个），但革兰氏阳性主导和革兰氏阳性多数特征在其余的KOs中占主导地位。这些发现似乎反映了两个潜在的现象：人类肠道中最丰富的微生物是革兰氏阴性菌（例如Bacteroides、Parabacteroides和Alistipes），即使它们自身的相对丰度确实没变，但它们在IgAV发生条件下可能会产生一些功能改变；然而，由于革兰氏阳性菌是IgAV相关分类学转变的主要驱动因素，因此它们不可避免地会导致实质性的功能影响，尤其是在那些不受高丰度革兰氏阴性菌群影响的基因中。

图5. IgAV患者肠道微生物群的功能转变。（a，b）在治疗前IgAV患者中，前20个KOs的相对丰度，KO富集（a）和减少（b）。（c）基于KO丰度的Bray-Curtis距离度量的PCoA。（d）对K01265（map）、K10040（ABC.GLN1.P）和K10041（ABC.GLN1.A）有贡献的主要微生物；K01265是IgAV中最丰富的KO标记物，而K10040和K10041属于推定的谷氨酰胺转运系统，并且是响应SACV治疗的10个KO之一。（e）革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌对IgAV相关KO的贡献。KOs根据它们在健康对照中的相对丰度等级排列，并根据革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的贡献进行颜色编码。G+ leading（革兰氏阳性主导）：7名前列贡献者均为革兰氏阳性或仅1名前贡献者为革兰氏阴性且排名不高于第四位；G+ majority（革兰氏阳性多数）：除了一个最高的贡献者都是革兰氏阳性，唯一的革兰氏阴性物种排名第二或第三；G- leading/majority（革兰氏阴性主导/多数）：和革兰氏阳性规则相同，但主要的贡献者为革兰氏阴性；Not available（不可用）：仅在不到四名参与者中确定的贡献物种；Comparable（贡献可比）：其他剩余案例。

讨论

目前，IgAV的治疗存在几个问题，包括仅诊断有皮疹的患者和相当大的复发率。具有非血小板减少性紫癜单一体征的儿科患者，通常在腿部和臀部，可能被诊断为IgAV，但这种表现与其他血管炎疾病的表现相似，例如皮肤白细胞碎裂性血管炎。这些皮疹IgAV患者通常预后良好，但少数可能发展为更严重的形式，如IgA肾病。换言之，诊断歧义有可能造成严重后果。此外，尽管其他研究报告了较低的范围（即2.7%、4.8%和16.4%），多项纵向研究仍显示其复发率很高（14.4-66%）。这种差异似乎与两者不同的计算方法有关，其中一个基于对一组患者的随访，另一个基于回顾性分析中的复发诊断。本研究认为基于纵向监测的复发率更可靠。替代方法产生的较低比率可能是由于复发患者可能放弃治疗或在其他地方寻求医疗救助的可能性。鉴于诊断和治疗问题，独特的肠道微生物群特征在控制疾病方面具有重要的临床潜力。

免疫球蛋白A血管炎的特征是微生物异常，包括此前报道的上呼吸道感染以及口腔和肠道中的微生物群变化。在本研究中，研究人员进行宏基因组分析以表征对多种药物治疗有响应的肠道微生物群（与IgAV相关）。当前研究的一个重要发现是肠道微生物群中革兰氏阳性菌占优势，它们对IgAV和治疗有响应。这与大多数成员为革兰氏阳性的主要肠道门（厚壁菌门）的结果一致，在IgAV患者中表现出超过50%的下降（在基于16S rRNA基因的研究中，厚壁菌门也与IgAV呈负相关）。革兰氏阳性菌的特征是缺乏脂多糖、完全暴露的肽聚糖层和细胞壁中存在脂磷壁酸。这些包膜的组成部分都可以影响宿主免疫。因此仍需要研究来调查粪便革兰氏阳性菌中的这些成分（或缺乏哪些成分）与IgAV的发病机制的关联。在各种分类群中，Weissella（一种与乳酸杆菌密切相关的乳酸菌属，已用于食品发酵）对治疗的响应最敏感（HC-pthIgAV FDR = 1）。虽然大多数属或种水平的处理响应类群在健康对照中的相对丰度低于0.01%，但Faecalibacterium和Bifidobacterium pseudocatenulatum均占健康对照组肠道菌群的1%以上。Faecalibacterium通过膳食纤维的发酵产生短链脂肪酸和抗炎肽，从而调节宿主炎症。有趣的是，该属在有哮喘风险的婴儿中也减少了，这是另一种常见于儿童的免疫介导的炎症性疾病。Bifidobacterium pseudocatenulatum与同一亲本属的十多个成员一起，是一种常见的益生菌物种，具有多种健康益处，包括代谢能力和抑制病原体。值得注意的是，所有三个属都被用作膳食补充剂，提高了益生菌辅助治疗IgAV的可能性。

这项研究的一个主要限制是样本量适中，这部分是由于IgAV的流行率低以及监测复发所需的时间所限制。然而，在这项基于宏基因组学的研究中产生的IgAV的微生物特征与来自16S rRNA基因测序的那些特征之间存在相当大的一致性。包括微生物多样性的减少以及多重分类学的转变，包括厚壁菌门、Clostridiales目（连同Clostridia纲）、Roseburia和Lachnospira亚属，以及Eubacterium eligens和Eubacterium rectale（均在16S研究中被鉴定）。此外，基于16S rRNA基因测序的证据表明，Lachnospiraceae科、Ruminococcus属或Streptococcus属在IgAV患者中的相对丰度有所降低，这与本研究的结果一致，即每个响应的科或属中有7个属或6个种在发病组中比例减少（附表2）；在16S研究中也观察到Enterococcus属（及其亲本Enterococcaceae科）的比例增加，在本研究的结果中观察到该属的2个物种（附表2）。因此，在采用不同方法的两项研究之间，IgAV的肠道微生物群标记存在相当大的保守性。

有两个与SACV治疗相关的注意事项。一个是，尽管本研究中的患者数量太少而无法调查此事，但方案中的条件特异性药物（因患者而异）可能是肠道微生物群分析的复合因素。另一个问题归因于在方案中加入了抗微生物剂或其他药物，这些药物可能会抑制各种细菌以改变分类学变化。然而，值得注意的是，丰度减少是IgAV患者的主要分类学转变，在表现出此类变化的分类群中，治疗后几乎没有进一步减少，而其中的一个子集反而显示出相对丰度的增加（即治疗反应能力）。换句话说，处理后的分类变化与预期的抗菌作用相反。此外，治疗后微生物群的变化，与疾病相关的微生物群变化一样，主要是革兰氏阳性菌的改变，如果治疗方案中的任何药物产生的抗菌作用起主要作用，这将是不可控的。因此，本研究得出结论，治疗后微生物群的变化表明微生物对恢复的响应。

结论

本研究表明革兰氏阳性菌在IgAV相关的肠道微生物群转变中占主导地位，这为更好地理解IgAV的发病机制提供了新见解，并为开发革兰氏阳性诊断组合和基于益生菌的治疗提供了实验基础。

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