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一种快速高效的农杆菌介导的鸢尾种子遗传转化方法

花匠小妙招
2024-12-07 17:11

本发明属于农业生物和植物基因工程领域，具体涉及一种农杆菌介导的鸢尾种子转化方法。

背景技术：

1、鸢尾科鸢尾属植物主要分布于我国黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古及云南。其作为观赏植物应用范围较广，在园林中可栽植于河畔池旁的浅水区，可做盆栽、布置花坛及专类园，还可丛植或片植于林荫树下。其花型奇特，雍容华贵，叶片浓翠，挺拔似剑，是一种观赏价值极高的花卉。随着生活水平和审美的提高，人们对鸢尾花品质改良的需求也越来越紧迫，传统鸢尾花杂交育种周期长、见效慢，严重影响了鸢尾花新品种的培育。目前，采用基因工程技术获得新品种是最高效的育种方式之一。但目前国内外对于鸢尾花的转基因技术报道极为缺少，尚未发表鸢尾花种子转基因研究的文章。

2、农杆菌介导的鸢尾花遗传转化法所采用的受体材料通常包括叶片，胚性愈伤组织等。这些材料来源植物的不同生长发育阶段，具有时空差异性，针对不同的材料需采取不同转化以及培养方法，操作过程较为繁琐，为了提高转化效率，获得新的品种，应该采用较为理想的遗传转化材料，其应具有以下优点：第一，材料处理方式相对均一，具有高重复性与普遍性；第二，材料分化程度低，细胞全能性强，具有发育成完整植株的可能性；第三，材料容易获取，减少取材对实验的影响，便于进行实验；第四，材料数量相对较大，有利于遗传转化成功。由于鸢尾花种子数量较大，材料均一，重复性高，且易获得，易保存，细胞全能性强，是进行鸢尾花遗传转化研究的理想材料。传统鸢尾农杆菌遗传转化往往需要借助植物组织培养技术，需要很长的培养时间长且农杆菌污染率高，植株易死亡。因此，建立一个不依赖组织培养的鸢尾花遗传转化方法对于创制鸢尾花新种质显得尤为重要。

技术实现思路

1、针对上述领域中的需求，本发明提供了一种鸢尾花遗传转化方法，从而避免了传统遗传转化方法中的缺点，包括植物组织培养技术繁琐，要求严格无菌条件，培养过程中生长周期长，对材料的状态要求较高等，建立了一种高效快速的农杆菌介导鸢尾种子的遗传转化方法。

2、一种快速高效农杆菌介导的鸢尾种子遗传转化方法，包含以下步骤：

3、(1)选取健康饱满的种子为实验材料，剥去外种皮，对种子进行消毒；

4、(2)调整含有目标载体的工程农杆菌菌液至适当浓度，结合针刺种子法，将农杆菌导入鸢尾的胚细胞；

5、(3)无菌滤纸吸取多余菌液后，将侵染后的种子播于共培养皿中，28℃暗条件培养20d，对幼苗进行荧光检测；

6、(4)将鸢尾花幼苗移入适宜生长的土壤，对其进行常规管理，至其长到5cm左右进行转基因鸢尾植株pcr鉴定。

7、所述步骤(1)中的种子为收集的成熟鸢尾花种子，烘干4℃保存备用。

8、所述步骤(3)中的培养基为去糖ms液体培养基。

9、本发明实施例中所述重悬液中农杆菌菌液od600为1.0-1.5。

10、本发明实施例中所述农杆菌菌液中加入乙酰丁香酮(acetosyringone，as)和表面活性剂(silwet l-77)。

11、本发明实施例中所述的生物工程菌为农杆菌gv3101；目标载体为携带溪荪转录因子myb113及筛选报告基因gfp的植物表达载体gv1300。

12、本发明实施例中所述针刺种子法是指在超净工作台中，一手用1ml规格的一次性注射器蘸取含目的基因农杆菌菌液，一手用镊子固定住预培养的种子，将针头刺向种子的胚部位，针刺深度约1mm。

13、本发明实施例中所述转基因植株鉴定方法为荧光检测和pcr分析，筛选有荧光反应和pcr扩增阳性的鸢尾花植株。

14、本发明实施例中所述鸢尾花种子进行遗传转化前，需进行消毒处理，75％酒精处理30s，5％次氯酸钠处理30min。

15、本发明实施例中所述的鸢尾花品种为野生型玉蝉花。

16、本发明以鸢尾成熟种子为材料，以针刺的种子为受体；利用农杆菌介导，将外源基因导入鸢尾基因组，从而获得转基因鸢尾。

17、本发明无需经过组织培养，直接用种子进行操作，具有以下优点：

18、(1)操作简单。避免了植物组织培养过程必须的培养基配制、外植体消毒、愈伤组织诱导、继代、共培、筛选、再生芽诱导、生根等一系列繁琐过程。

19、(2)生长周期短。获得转基因鸢尾花幼苗只需30d，相对于传统的组织培养的方法所需时间较短。

20、(3)重复性与普遍性高。对材料的处理方式统一，简便，易重复。

21、(4)经济效益高。直接采用农杆菌菌液侵染鸢尾花种子遗传转化受体，利用土壤培养鸢尾花，减少了传统转化过程中植物组织培养所需的一系列人力物力投入，可大幅度减少遗传转化成本。

技术特征：

1.一种快速高效农杆菌介导的鸢尾种子遗传转化方法，包含以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，所述的生物工程菌为农杆菌gv3101，目标载体为携带溪荪转录因子myb113及筛选报告基因gfp的植物表达载体gv1300。

3.根据权利要求2所述的方法，所述转基因植株鉴定方法为荧光检测和pcr分析，筛选有荧光反应和pcr扩增阳性的鸢尾花植株。

4.根据权利要求1所述的方法，所述的鸢尾花品种为野生型玉蝉花。

技术总结
本发明属于农业生物技术领域和植物基因工程领域，公开了一种快速高效的农杆菌介导的鸢尾种子遗传转化方法。该方法的主要步骤包括：成熟鸢尾种子消毒和针刺后用作遗传转化材料，调整农杆菌菌液浓度至适当值以用于侵染受体材料，依次经共培养、播种、荧光检测和PCR扩增后，鉴定转基因鸢尾植株。本发明方法无需组织培养步骤，且大部分操作过程无需在无菌条件下进行，避免了由于无菌和组培操作带来的繁琐、耗时等缺点，是一种简单、快捷、成本低、重复性较好的遗传转化方法，对于快速创制转基因鸢尾新种质具有重要的意义和价值。

技术研发人员：王玲,刘会君,刘桂伶,史恭发
受保护的技术使用者：东北林业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16